基于CRISPR技术对大肠杆菌K4进行基因插入的方法

技术领域

本发明涉及生物技术基因敲除领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的外源基因靶向大肠杆菌中染色体的方法。

背景技术

大肠杆菌K4(ATCC 23502)的荚膜多糖结构为硫酸软骨素类似物果糖软骨素，提高果糖软骨素产量一直以来都是热点研究问题。目前对大肠杆菌K4进行染色体水平上靶基因的改造有如下两种方法：一是利用其自身RecA同源重组系统编码的重组蛋白介导DNA发生同源重组；二是通过引入外源重组酶λ-Red或RecET提高同源重组效率。上述两种均是通过DNA分子发生双交换实现对靶基因的编辑。这些传统的大肠杆菌K4同源重组技术通常需要外源性辅助质粒以及筛选标记基因，对靶基因进行敲除及插入等实验操作，但当对靶基因进行点突变等更加精准的操作时，这些重组技术存在重组效率低、流程繁琐等缺点，想要大规模应用仍然面临巨大的挑战。

CRISPR/Cas9系统改造的碱基编辑器，是目前对核酸碱基进行点突变应用较为广泛的方法，作为一种新型基因编辑工具，该技术仍存在脱靶率高、编辑窗口局限等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种将大肠杆菌传统的基因编辑技术与CRISPR/Cas9技术相结合，快速、高效的实现大肠杆菌K4靶基因定点插入的方法。

第一方面，本发明要求保护一种对大肠杆菌K4基因组中靶基因进行定点插入的方法。

本发明所要求保护的对大肠杆菌K4基因组中靶基因进行定点插入的方法，可包括如下步骤：

(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌K4，获得大肠杆菌K4 pCas9；

(2)根据靶标基因LacZ设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTarget-F质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物经过Dpn I消化、磷酸化、T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，送去测序验证，提取含靶标基因20个核苷酸序列的pTarget-F质粒；

(3)以大肠杆菌K4基因组为模板，根据PgapA基因和待插入基因位点上下游核苷酸序列设计引物P3、P4、P5和P6，PCR扩增待插入的DNA片段；

(4)以大肠杆菌K4基因组为模板，设计引物P1、P2、P7和P8，PCR扩增lacZ上下游同源序列的DNA片段；构建携带待插入基因和lacZ基因上下游同源序列的Donor DNA片段；

(5)将步骤(2)获得的辅助质粒pTarget-F和步骤(4)获得的DNA片段通过电击转化的方法转入大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞，获得插入基因的重组大肠杆菌。

进一步，步骤(5)辅助质粒pTarget-F和DONOR DNA片段质量比优选1∶4；

进一步，步骤(5)转入方法为：将辅助质粒pTarget-F和DONOR DNA片段与大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞混合，轻弹混匀，加入预冷的电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪(Bio-Rad)的杯槽中，转化条件：电击后迅速加入液体培养基，30℃静置培养2h进行复苏，离心3min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB双抗固体培养基，获得基因重组的大肠杆菌K4；

进一步，步骤(2)所述PCR扩增条件为：PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物pTargetF-LacZF、1.5μL引物pTargetF-LacZR、模板1μL、dd H

进一步，步骤(2)所述DpnI条件为：37℃温育5min，70℃灭活15min，利用DNA产物纯化试剂盒直接回收酶切反应液中的DNA进行纯化回收。

进一步，步骤(2)所述连接条件为：Ligation Buffer 5μL、T4PNK 1uL、ddH

进一步，步骤(3)所述PCR条件为：PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P3、1.5μL引物P4、模板1μL、dd H

PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P5、1.5μL引物P6、模板1μL、dd H

进一步，步骤(4)所述PCR条件为：PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P1、1.5μL引物P2或者1.5μL引物P7、1.5μL引物P8、模板1μL、dd H

PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P1、1.5μL引物P8、模板各0.5μL、dd H

本发明所述LB琼脂培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

附图说明

图1为实施例1 pTargetF-lacZ质粒载体图谱。

图2为实施例1质粒pTarget-F经PCR扩增后的凝胶电泳图，M为DL2000Marker，泳道1-6代表平行的6个相同的质粒pTarget-F PCR产物。

图3为实施例1同源臂1、PgapA、glmM-GGGS-glmS和同源臂2的DNA片段融合PCR产物凝胶电泳图，M为10kb Ladder Marker，泳道1代表融合PCR产物。

图4为实施例1大肠杆菌K4重组株的菌落PCR验证凝胶电泳图，M为10kb LadderMarker，泳道1-2代表随机挑取5个转化子进行验证后两个阳性转化子PCR结果，结果显示为成功重组大肠杆菌K4株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1大肠杆菌K4中PgapA-glmM-GGGS-glmS基因的定点插入

1、将pCas9质粒点电转导入大肠杆菌K4，记为大肠杆菌K4 pCas，包括以下步骤：

(1)挑取大肠杆菌K4单菌落接种于5mL LB液体试管中培养12h，进行二次活化，将二次活化的菌液按1∶100接种到100mL新鲜的LB液体培养基中，220rpm振荡培养至OD

(2)转化：将贮存在-80℃冰箱中的大肠杆菌K4感受态细胞置于冰盒中解冻，100μL感受态细胞中加2-6μL pCas质粒，轻弹使其混合均匀，加入预冷的电击杯(0.1cm)中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪(Bio-Rad)的杯槽中，转化条件：1.8KV、电阻200Ω、电容25μF，电击后迅速加入900μL LB液体培养基，30℃静置培养2h进行复苏，8000g/min离心3min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB固体培养基(Kan，终浓度为50mg/L)，30℃过夜培养。转化子通过菌落PCR验证。记为大肠杆菌K4 pCas。

2、辅助质粒pTargetF-lacZ的构建

(1)以pTarget-F质粒(源自Jiang et al.，Appl Environ Microbiol，2015，81：2506-2514)为模板，通过引物pTargetF-LacZF(含有LacZ 20个核苷酸，即N20)和pTargetF-LacZR进行PCR，扩增得到线性化pTargetF-LacZ PCR产物。

pTargetF-LacZF：CATTTTTTGATGGACCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；(SEQ IDNO.1)

pTargetF-LacZR：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC；(SEQ ID NO.2)

PCR的具体条件为：

优选的，98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 3min，30循环；16℃保存。

PCR扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用DNA Fragment Purification Kit(购于TaKaRa公司)对其进行纯化回收。

(2)用DpnI处理纯化的PCR产物降解模板质粒：

优选的，37℃水浴15min，反应结束后，试剂盒对其进行纯化回收。

(3)磷酸化、T4DNA连接酶连接：

优选的，37℃温育30-40min，65℃灭活20min。16℃连接过夜。

(4)取步骤(3)得到的产物转化50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞：

优选的，冰浴30min，42℃热激90s后迅速置冰上1～2min，加入950μL、37℃预热的LB培养基中，混匀30℃，200rpm培养1h，涂布于含有100μg/mL壮观霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养12h，挑取阳性菌落，送公司测序(金唯智)。

序列分析结果，得到含有正确N20部分的pTargetF-LacZ，质粒图谱如图1所示。测得序列如下(SEQ ID NO.13)：

3.同源修复DNA(DONOR DNA)的制备。

(1)以大肠杆菌K4(ATCC23502)为模板，进行菌落PCR扩增出两段LacZ上下游同源臂DNA片段，引物如下：

P1：GGATCCGCCAGACGCCACTGCTGCCA；(SEQ ID NO.3)

P2：TTCGATGGTGTCCGGGATCTCGTCAGTATCCCCGTTTACA；(SEQ ID NO.4)

P7：CGGTTGAGTAACACGATGACTACGCGGGTTCC；(SEQ ID NO.9)

P8：CAACTGCCGTTCGACGATATCGATTTTTCTGCTTTAGATCTTTCTTTTG；(SEQ ID NO.10)

(2)以大肠杆菌K4为模板，进行菌落PCR扩增出PgapA基因(SEQ ID NO.11)，引物如下：

P3：GCATCATATCCTTCCAGACCTTTAAAATTCGGGGCGC；(SEQ ID NO.5)

P4：CGCGCCCTCTTTCTAGTATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAA；(SEQ ID NO.6)

以pETM6R2为模板，PCR扩增glmM-GGGS-glmS基因，引物如下

P5：TATACTAGAAAGAGGGCGCGGC；(SEQ ID NO.7)

P6：GTCATCGTGTTACTCAACCGTAACCGATTTTG；(SEQ ID NO.8)

(3)以上述PCR产物为模板，以P1和P8为引物进行融合PCR制备DONOR DNA片段；

1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物鉴定；融合PCR电泳结果如图3所示；结果有单一的特异性条带，大小为4408bp，纯化回收备用；

PCR的具体条件为：

优选的，98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 10s，30循环；16℃保存；

融合PCR的具体条件为：

优选的，95℃ 5min；95℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 2min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。

融合PCR产物进行测序分析(金唯智)检测是否含有待插入基因部分，并附带送测引物。

送测引物如下：

P9：GCTTCGGCCTGGTAATGGCCC；(SEQ ID NO.14)

测得序列如下(SEQ ID NO.12)：

4、大肠杆菌K4 pCas感受态制备

(1)挑取一个单菌落，转移到装有10mL LB液体培养基的试管内；在30℃条件下220rpm培养，当OD

(2)置于冰中预先冷却30min；吸取培养液1mL到预冷的1.5mL无菌EP管内，4℃，4000g离心10min；

(3)弃上清，加1mL预冷灭菌蒸馏水重悬菌体；于4℃条件4000g，离心10min；于超净台弃上清，加入1mL预先冷却过的10％甘油轻轻重悬菌体，重复此步骤3次；于4℃条件4000g，离心10min；于超净台内弃去上清液，加入80μL预先冷却过的10％甘油轻轻重悬菌体后备用。

5、转化：将1μg步骤2制备pTargetF-LacZ质粒(SEQ ID NO.4)和4μg步骤3制备的DONOR DNA片段(SEQ ID NO.11)与100μL大肠杆菌K4 pCas感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μL、30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200rpm培养1h。

pTargetF-LacZ质粒与DONOR DNA产物质量比为1∶2～1∶8，优选1∶4。

6、将步骤5菌液离心弃上清800μL后，剩余部分混匀，取50μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子。

7、用鉴定引物P1和P8进行菌落PCR验证转化子，得到阳性菌提取基因组DNA用引物P1和P8进行PCR结果如图4。鉴定引物在靶标基因外侧，在插入株中因待插入基因替换原靶标基因导致其序列长度为4408bp(泳道1、2)，实验结果与预期相符，表明该方法能够成功获得大肠杆菌K4重组株。

所有经检测的转化子中靶标基因有2/5被待插入基因替换，因此采用本方法敲除大肠杆菌的阳性率可达40％。

综上所述，本发明建立了一种CRISPR/Cas9系统介导的快速、简单和高效的大肠杆菌基因定点插入方法，将传统与现代基因编辑技术相结合，为大肠杆菌K4基因编辑的研究提供了有效的工具。为发酵生产果糖软骨素奠定了科学理论以及实践基础。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。