新型冠状病毒多肽疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗领域。具体地说，本发明涉及冠状病毒，特别是新型冠状病毒的多肽疫苗及其应用。

背景技术

冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒。国际病毒学分类委员会于2012年将冠状病毒分为α、β、γ和δ等4大类。目前共发现7种可以感染人类的冠状病毒，分别是人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、香港I型人冠状病毒(HCoV-HKU1)、严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)及中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)和新型冠状病毒(2019-nCoV)。其中，SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV是目前发现的人高致病性冠状病毒，给人类健康带来了严重危害。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。它与SARS-coV同属网巢病毒目冠状病毒科，是一种不分节段的单股正链RNA病毒。新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)具有极高的传染性，已在全球范围引起严重疫情，危及数百万人的生命安全。人感染该病毒常出现呼吸道症状，如发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

目前尚缺乏针对COVID-19的明确有效的预防和治疗药物及措施，临床上暂以支持治疗和对症治疗为主。通过疫苗建立起对SARS-CoV-2的群体免疫，是控制和阻断COVID-19疫情的最终途径。目前已有多种类型的COVID-19疫苗处于临床前和临床试验中，包括减毒活疫苗、灭活病毒疫苗、重组病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗和多肽疫苗等。

然而，目前开发的疫苗所产生的免疫保护作用有限，例如存在免疫原性低、安全性风险、人群响应率低和难以克服病毒免疫逃逸等问题。因此，本领域迫切需要开发新的高人群响应率且可高效激发人体产生针对SARS-CoV-2的免疫应答的疫苗，以便在接种者中产生阻断型的抗SARS-CoV-2抗体，从而提供有力的免疫保护作用。并且根据研究预测，新冠病毒也许会在未来与人类长期共存。

因此，本领域急需开发治疗新冠病毒的疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的针对新冠病毒的疫苗，从而能在接种者中产生有力的免疫保护作用。

在第一方面，本发明提供一种疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物，所述疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物包含PCM多肽和/或RH2多肽以及任选的免疫学或药学上可接受的赋形剂；

其中所述PCM多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:1所示多肽具有相同或基本相同的功能；

所述RH2多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:2所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在优选的实施方式中，所述疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物是预防或治疗冠状病毒感染的疫苗组合物或药物组合物。

在优选的实施方式中，所述的冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或新型冠状病毒。

在优选的实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒或新型冠状病毒；更优选新型冠状病毒。

在优选的实施方式中，(b)中所述的“一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失”是在(a)中多肽的任一端进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失；优选一个或多个氨基酸的添加。

在优选的实施方式中，所述“一个或多个氨基酸”是1-7个氨基酸，优先1-6个氨基酸。

在具体的实施方式中，所述疫苗组合物或药物组合物包含PCM多肽和RH2多肽以及任选的免疫学或药学上可接受的赋形剂。

在第二方面，本发明提供一种多肽，所述多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:1所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在第三方面，本发明提供一种多肽，所述多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:2所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在优选的实施方式中，(b)中所述的“一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失”是在(a)中多肽的任一端进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失；优选一个或多个氨基酸的添加。

在优选的实施方式中，所述“一个或多个氨基酸”是1-7个氨基酸，优先1-6个氨基酸。

在第四方面，本发明提供第二或第三方面的多肽在制备疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物中的用途。

在优选的实施方式中，所述疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物是预防或治疗冠状病毒感染的疫苗组合物或药物组合物。

在优选的实施方式中，所述的冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或新型冠状病毒。

在优选的实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒或新型冠状病毒；更优选新型冠状病毒。

在第五方面，本发明提供第一或第二方面所述的多肽的编码核酸。

在第六方面，本发明提供包含第五方面所述的编码核酸的表达载体。

在第七方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第六方面所述的表达载体或其基因组中整合了第五方面所述的编码核酸。

在第八方面，本发明提供第二方面所述的多肽在提高疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物的效果中的用途。

在优选的实施方式中，所述用途是指第二方面所述的多肽作为提高疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物的增效剂的用途。

在优选的实施方式中，所述疫苗组合物或药物组合物是预防或治疗冠状病毒感染的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物。

在优选的实施方式中，所述的冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或新型冠状病毒。

在优选的实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒或新型冠状病毒；更优选新型冠状病毒。

在第九方面，本发明提供一种疫苗增效剂，所述疫苗增效剂包含一种多肽，所述多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:1所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在第十方面，本发明提供一种疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物，所述疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物包含PCM多肽和用于治疗或预防冠状病毒，特别是新冠病毒感染的其它多肽以及任选的免疫学或药学上可接受的赋形剂；

其中所述PCM多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:1所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在第十一方面，本发明提供一种提高疫苗疗效的方法，所述方法包括在有待提高疗效的疫苗中包含以下多肽的步骤，所述多肽是：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与SEQ ID NO:1所示多肽具有相同或基本相同的功能。

在第十二方面，本发明提供第二方面或第三方面所述的多肽的制备方法，包括以下步骤：

1)培养第七方面所述的宿主细胞，从而产生第二方面或第三方面所述的多肽；

2)从步骤1)得到的培养体系中获得产生的多肽。

在第十三方面，本发明提供一种预防或治疗冠状病毒感染的方法，包括将预防或治疗有效量的第一方面所述的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物或第二方面或第三方面所述的多肽给予有此需要的对象的步骤。

在优选的实施方式中，所述对象是哺乳动物对象，优选人。

在优选的实施方式中，所述的冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或新型冠状病毒。

在优选的实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒或新型冠状病毒；更优选新型冠状病毒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了RBD结合抗体滴度检测结果。比较了100ug RH2、100ug PCM、50ug RH2+50ug PCM的3组免疫小鼠产生的对RBD的血清抗体滴度。Control：未经免疫的小鼠血清。横坐标为血清稀释度。

图2显示了S2蛋白结合抗体滴度检测结果。比较了100ug RH2、50ug RH2+50ug PCM免疫小鼠产生的对S2蛋白的血清抗体滴度。横坐标为血清稀释度。

图3显示了RH2免疫小鼠和RH2+PCM联合免疫小鼠的脾细胞在10ug RCO和10ug RH2刺激下的特异性T细胞反应。NC：阴性对照(Negative Control)；RCO：10ug/孔；PC：阳性对照(Positive Control)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现两种多肽PCM和RH2，利用这两种多肽可以既刺激产生S1蛋白的结合抗体又刺激产生S2蛋白的结合抗体。特别是，二者联用相比于单独使用进一步产生了协同作用。在此基础上完成了本发明。

冠状病毒

本文所用的术语“冠状病毒(Coronaviruses)”是单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)。该病毒可以感染人、蝙蝠、猪、老鼠、牛、马、山羊、猴子等多种物种。已知感染人的冠状病毒(HCoV)有7种，包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)。

在具体的实施方式中，本文所述的冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或新型冠状病毒。在优选的实施方式中，所述冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒或新型冠状病毒；更优选新型冠状病毒。

最新分离的冠状病毒为β属新型冠状病毒，WHO命名2019-nCoV，是第7个可感染人的冠状病毒。目前尚无针对新冠病毒的有效疫苗和治疗药物，主要是通过防范措施控制病毒扩散，密切监控疫情，对疑似病例进行隔离观察。目前冠状病毒尚无特效治疗方法，主要采取对症支持治疗。

新冠病毒通过表面的S蛋白与人体细胞表面的ACE2受体结合而进入细胞。S蛋白由较长的膜外区、跨膜区和膜内区组成，属于第一类病毒膜融合蛋白(Class I viral fusionprotein)。不同冠状病毒的S蛋白最显著的区别在于病毒的组装和释放过程中是否被宿主蛋白酶切割。成熟的S蛋白通常会被宿主蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等)切割成两个亚基：S1和S2。S1亚基可进一步分成两个相对独立的区域，分别是N-端区域和C-端区域。S1包含有受体结合域(receptor binding domain，RBD)，大部分的冠状病毒S蛋白的RBD都位于C-端区域。S2亚基通过跨膜区锚定在膜上，它含有膜融合过程所需要的基本元件，包括：一个内在的膜融合肽(fusion peptide，FP)，两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)、一个跨膜临近区(juxamembrain domain，JMD)和一个跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)，以及C末端的胞浆区域(cytoplasmic domain，CD)(约40个氨基酸长度)。两个HR即HR1和HR2，根据它们的位置又将其称为HR-N和HR-C，它们之间被大约140个氨基酸形成的中间螺旋结构隔开，当RBD与受体结合后，S2亚基通过将FP插入宿主细胞膜而改变构象，HR1和HR2各形成一个三螺旋结构，反平行排列集合成六螺旋束(6HB)，共同组成一个融合核心，最终导致病毒膜与细胞膜融合。因此阻断RBD识别宿主细胞和阻断S2亚基与细胞膜的融合都能够有效抑制病毒的入侵。

S蛋白因其功能上的重要性而成为一个比较理想的抗原。但是新型冠状病毒是一种RNA病毒，RNA病毒的疫苗经常会产生副作用，例如ADE(antibody dependentenhancement)。这些副作用往往是疫苗中有一些组分能够刺激产生没有保护作用的免疫反应而引起。

本发明的多肽

冠状病毒，例如新冠病毒已经出现了很多变种，但是其主要的入侵途径依然是通过其表面的S蛋白(Spike Protein)的受体结合区RBD识别并结合人细胞上的ACE2蛋白，从而完成对宿主细胞的入侵。因此，如果能有效阻断S蛋白与ACE2的结合，将有极大的可能阻止新冠病毒对人细胞的入侵，预防或治新冠病毒感染引起的一系列症状。

为此，本发明人设计了两个重组蛋白，PCM和RH2。实验证明PCM或RH2均可作为新冠疫苗候选，并且PCM+RH2联合免疫效果优于单独使用其中一种蛋白，可以作为一种有优势的新冠免疫策略。

在本文中，“本发明的多肽”或“本发明的蛋白”具有相同的含义，在本文中可以互换使用。这些术语均是指能够阻断冠状病毒的RBD识别宿主细胞或阻断S2亚基与细胞膜的融合，或者既阻断RBD识别宿主细胞又阻断S2亚基与细胞膜的蛋白或多肽。

在具体的实施方式中，本发明的多肽氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示的多肽：

MHHHHHHQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ(SEQ ID NO:1)；其中N端带有His6标签以及起始密码子编码的甲硫氨酸(M)；

或者，氨基酸序列如以下SEQ ID NO:2所示的多肽：

MHHHHHHRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE(SEQ ID NO:2)；其中N端带有His6标签以及起始密码子编码的甲硫氨酸(M)。

鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员会理解本发明的蛋白还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“本发明的蛋白”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2中任一所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。例如，为便于检测和实验，实施例中的蛋白均是在N端带有生物素标记的蛋白，这些标记对蛋白的性能没有产生任何不利的影响。

蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的蛋白”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他蛋白，如包含“本发明的蛋白”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白外，本发明还应包括“本发明的蛋白”的活性片段。

本发明还提供“蛋白”的类似物。这些类似物与本发明的蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

本发明的蛋白的保守性变体是指SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列中存在的氨基酸残基被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成的蛋白，但所述保守性变异蛋白依然具有与氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白相同或相似的活性。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

因此，本发明的蛋白还包括本发明蛋白经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有本发明蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述的衍生蛋白是由本发明的蛋白经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有本发明蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述的衍生蛋白是由本发明的蛋白经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有本发明蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述的衍生蛋白是在本发明蛋白的C末端和/或N末端添加或缺失1-30、1-10、1-6、或1-3个氨基酸残基而形成的且具有本发明蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，本发明的蛋白是在N端带有6His标签以及起始密码子编码的氨基酸残基M的蛋白，例如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。

在本发明的蛋白的基础上，本发明还提供了编码本发明蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的编码核苷酸序列有差别的核酸序列。

本发明的蛋白的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含本发明的蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白。

本文所述的宿主细胞包括包含上述表达载体或基因组上整合了本发明的蛋白的编码序列，优选SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的编码核苷酸序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(E.Coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在上面的方法中的重组蛋白可以组成型表达或条件表达，例如当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高压匀浆、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的疫苗组合物或药物组合物

在本发明的两个重组蛋白，PCM和RH2的基础上，本发明进一步提供了疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物，其中包含PCM或RH2，或同时包含二者。

本发明的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物可以诱导产生既阻断RBD识别宿主细胞，又能阻断S2亚基与细胞膜的融合中和抗体。

此外，本发明人出乎意料地发现，本发明的PCM多肽不仅能够刺激产生RBD的结合抗体，还因免疫原性较强，能较好地刺激T细胞。因此，本发明的PCM多肽可以与RH2联用，从而具备更明显的优势。由于PCM蛋白免疫原性较强，能较好地刺激T细胞，其还可以与其它冠状病毒抗原联用，从而产生更好的免疫保护作用。因此，本发明的PCM蛋白不仅本身可以用作冠状病毒的疫苗，还可以用作其它针对冠状病毒的疫苗的增效剂，从而起到协同作用。

在本文中，所用的术语“结合抗体”是指能与相应抗原结合的所有抗体。在本文中，所用的术语“中和抗体”是指能够结合相应抗原并且能够阻断该抗原与其受体结合的抗体。

本发明的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物包含本发明的多肽或蛋白，并且通常与免疫学或药学上可接受的载体组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体的例子包括(但并不限于)蛋白质、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。

此外，本发明的疫苗组合物或免疫原性组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括(但并不限于)以下种类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、口服、或局部给药。

使用(疫苗)组合物时，是将安全有效量的本发明疫苗多肽施用于人。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

除了本发明的蛋白之外，本发明的疫苗组合物或免疫原性组合物或药物组合物中还可以与其它抗病毒药物联用以增强疗效。所述其它抗病毒药物可以选自洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、瑞德西韦、奥司他韦、达菲、拉尼米韦、帕拉米韦和氯喹(磷酸氯喹)中的一种或多种；优选洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、瑞德西韦和氯喹(磷酸氯喹)中的一种或多种。

本发明的优点：

1.本发明的蛋白或疫苗组合物或免疫原性组合物能够产生保护性中和抗体而且避免产生副作用；

2.本发明的蛋白或疫苗组合物或免疫原性组合物既能刺激产生S1蛋白的结合抗体，也能刺激产生S2蛋白的结合抗体，并且同时刺激T细胞反应。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例

材料与方法

本发明所有的材料或试剂均是本领域可常规获得的，例如市售可得的。

1.序列

PCM序列(含N端His

MHHHHHHQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ

RH2(含N端His

MHHHHHHRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE。

2.诱导表达

将表达菌株均匀涂布到含硫酸卡那霉素的LB平板上，倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到50ml含硫酸卡那霉素的LB培养基(生工生物的LB肉汤培养基25g/L，卡那霉素50ug/ml)中，37℃，150rpm培养过夜。随后扩大培养，按1:100扩培至含卡那霉素的2YT培养基(10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，pH 7.4，卡那霉素50ug/ml)中。当OD值达到0.8左右时，加入IPTG，使终浓度为0.2mM，37℃，200rpm诱导4h后结束培养，离心收集菌体。

3.蛋白纯化

菌体超声波破碎并洗涤后获得包涵体。包涵体采用20mM Tris(pH8.0)，300mMNaCl，1％Triton X-100，2mM EDTA，5mM DTT的溶液洗涤后洗涤后，用20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea缓冲液溶解变性，同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。

4.蛋白复性

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的祖分，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液(1×PBS，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-精氨酸，1MUrea，5％甘油)中复性，复性后蛋白最终透析于储存液(1×PBS，5％甘油)溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，获得所需蛋白。

5.小鼠免疫

准备20只BALB/c小鼠(5-7周，雌性，18-20g)，分组如下：

免疫方式如下：第0天进行第一次免疫，两周后(即第14天)进行第二次免疫，再过一周(即第21天)进行第三次免疫，一周后(第28天)将小鼠处死、取材，并进行ELISA和ELISPOT实验。

6.IFN-γ酶联免疫斑点法检测小鼠T细胞

用BD PharminGen公司的酶联免疫斑点实验试剂盒进行。IFN-γ抗体预包被的板上加上免疫后小鼠的脾脏细胞，并用10ug/孔的RCO和10ug/孔RH2蛋白刺激，共同孵育12-16h，弃去脾细胞，加入标记的抗IFN-γ的抗体孵育1小时然后显色，待显色终止之后，用斑点计数仪进行斑点计数。RCO蛋白是一个针对病毒RBD序列设计的重组重叠多肽，用于检测新冠感染引起的特异性T细胞反应，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示(RCO蛋白参见中国专利申请号CN202011063193.7)。

MHHHHHHSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFLRMKKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADLRMKEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLRMKPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLLRMKLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYLRMKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYLRMKAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVLRMKYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELRMKDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGLRMKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWLRMKIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIV(SEQ ID NO:3)

7.抗体滴度检测

用ELISA方法检测免疫后小鼠针对RBD和S2蛋白的抗体滴度。

7.1酶标版包被2ug/ml的RBD蛋白：将从Genescript购买的RBD蛋白用pH9.0的CB液稀释后，每孔100ul添加到酶标版中，4℃包被过夜。

7.2封闭：用PBST(0.05％Tween-20)洗板后，每孔添加200ul的2.5％BSA溶液进行封闭，37℃封闭1h。

7.3血清样品稀释：取免疫后及对照组的小鼠血清，每个样品各取10ul与990ul的PBS溶液混匀，即为1:100稀释度的小鼠血清。随后4倍梯度稀释，取250ul 1:100的小鼠血清与750ul PBS溶液混合混匀，为1:400稀释度的小鼠血清；取250ul 1:400的小鼠血清与750ul PBS溶液混合混匀，为1:1600稀释度的小鼠血清，以此类推。使用的最高稀释度为1:1,680,000。

7.4加样：将封闭完的酶标板用PBST洗板后，加入7.3稀释后的血清样品，每孔100ul，37℃孵育1h。

7.5加酶标抗体：PBST洗板后，加入1:20000用PBS稀释过后羊抗鼠-HRP抗体，每孔50ul，室温孵育30min。

7.6加显色液和终止液：PBST洗板后，每孔添加100ul TMB显色液，显色5-10min后每孔添加50ul 15％硫酸终止反应，并检测OD450值。

7.8使用四参数拟合绘制小鼠血清抗体滴度曲线

8.中和抗体检测

酶标板包被2ug/ml的RBD蛋白，用含有2.5％BSA的PBS溶液37℃封闭1h。对血清样本进行稀释，然后与标记的人的ACE2蛋白混合后，加在包被RBD的酶标板上，孵育1h。用PBS或者未免疫小鼠血清混合ACE2作为对照。然后进行洗板、显色、读板。

实施例1.PCM多肽的制备

根据材料与方法中所述，委托南京铭研生物科技有限公司构建、制备本发明的PCM多肽。

实施例2.RH2多肽的制备

根据材料与方法中所述，委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建、制备本发明的RH2多肽。

实施例3.抗体滴度的检测

如材料与方法中“7”和“8”所述，本发明人检测了本发明的多肽PCM和RH2的滴度。具体结果是：

免疫28天后，100ug RH2、100ug PCM或50ug RH2+50ug PCM免疫组小鼠均可产生较高滴度的RBD结合抗体。尽管联合免疫中每个蛋白的用量只是单独免疫的二分之一，联合免疫产生的RBD结合抗体滴度与较高剂量PCM或RH2单独免疫的RBD结合抗体滴度相当(如图1所示)。联合免疫组产生的S2结合抗体滴度甚至明显优于RH2单独免疫的(如图2所示)，而PCM中不包含S2蛋白序列，因此PCM单独免疫小鼠不产生S2的结合抗体。

中和抗体检测实验显示，在三组免疫的小鼠中，都可以产生能够阻断RBD和ACE2结合的中和抗体。

实施例4.特异性T细胞反应的测定

取各组免疫后小鼠的脾脏，提取脾脏淋巴细胞，然后分别用RH2或者RCO，一个包含RBD重叠多肽的蛋白，做为刺激剂刺激脾脏淋巴细胞，并且用ELISPOT的方法，检测受到特异性刺激的淋巴细胞释放的IFN-γ。实验表明，无论是100ug RH2或者50ug RH2+50ug PCM免疫的小鼠，都能受刺激产生对RH2的特异性T细胞反应。而用RCO做刺激剂时，50ug RH2+50ugPCM免疫的5只小鼠全部都能产生特异性T细胞反应，100ug RH2免疫的5只小鼠中只有3只也就是60％产生了特异性的免疫应答(如图3所示)。

结论：

从抗体检测可以看出，不管针对RBD蛋白还是S2蛋白，50ug RH2+50ug PCM联合免疫组都可以产生滴度较高的结合抗体。100ug PCM免疫组的小鼠，由于PCM不含S2亚基的部分，免疫后只能产生滴度较高的RBD的结合抗体，而不能产生针对S2的抗体。100ug RH2免疫组除了产生RBD结合抗体之外，也可以刺激产生一部分S2蛋白的结合抗体。但是比较来看，产生的S2结合抗体滴度远低于RH2+PCM联合免疫组。从免疫原组成上来看，与仅使用50ugRH2进行的RH2+PCM联合免疫相比，单独使用100ug RH2免疫时针对S2亚基的免疫原成分更高，应该产生的抗体滴度也更高，但事实并非如此。

不想局限于任何具体的理论，但本发明人认为可能是因为PCM蛋白免疫原性较强，能较好地刺激T细胞，同时CD4+T细胞分泌的细胞因子又同时刺激了针对PCM和RH2的B细胞克隆的分化，从而提高了抗体滴度。

进一步分析特异性T细胞反应也可以支持这一想法。图2显示，RH2+PCM联合免疫的T细胞反应要优于单独使用RH2免疫的T细胞反应。因此，RH2或者PCM都可以作为冠状病毒的候选疫苗，但是RH2与PCM联合应用更具有明显的优势。

此外，由于PCM蛋白免疫原性较强，能较好地刺激T细胞，其还可以与其它冠状病毒抗原联用，从而产生更好的免疫保护作用；换言之，本发明的PCM蛋白不仅本身可以用作冠状病毒的疫苗，还可以用作其它针对冠状病毒的疫苗的增效剂，从而起到协同作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 常州文松生物技术有限公司

<120> 新型冠状病毒多肽疫苗及其应用

<130> P2020-2434

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His His His His His His Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

1 5 10 15

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

20 25 30

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

35 40 45

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

50 55 60

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

65 70 75 80

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

85 90 95

Val Gly Tyr Gln

100

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His His His His His His Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

1 5 10 15

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

20 25 30

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

35 40 45

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

50 55 60

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

65 70 75 80

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

85 90 95

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

100 105 110

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

115 120 125

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

130 135 140

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

165 170 175

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

180 185 190

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

195 200 205

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

210 215 220

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

225 230 235 240

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

245 250 255

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu

260 265 270

<210> 3

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met His His His His His His Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

1 5 10 15

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

20 25 30

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Leu Arg Met Lys Lys Leu

35 40 45

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

50 55 60

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

65 70 75 80

Asp Leu Arg Met Lys Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

85 90 95

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

100 105 110

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Arg Met Lys Pro Asp Asp Phe

115 120 125

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

130 135 140

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Leu Arg Met Lys Leu Asp

145 150 155 160

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

165 170 175

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Leu

180 185 190

Arg Met Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

195 200 205

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

210 215 220

Cys Tyr Leu Arg Met Lys Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

225 230 235 240

Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr

245 250 255

Asn Gly Val Leu Arg Met Lys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe

260 265 270

Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu

275 280 285

Ser Phe Glu Leu Arg Met Lys Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val

290 295 300

Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn

305 310 315 320

Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Leu Arg Met Lys

325 330 335

Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu

340 345 350

Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Leu

355 360 365

Arg Met Lys Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile

370 375 380

Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

385 390 395 400

Ile Val