一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法

技术领域

本发明属于重金属生物可给性检测技术领域，具体涉及一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法。

背景技术

中药中重金属的毒性评价不仅与其摄入的绝对量有关，更与实际被吸收而发挥作用的含量密切相关。若将中药中本身重金属的含量用于评估其风险，可能会高估其对人体的危害。重金属的生物可给性(bioaccessibility)，是重金属在胃肠环境中可以溶出的比例，是评价其最大经口生物利用度 (bioavailability)的指标。动物试验是评价重金属生物可给性最有效的手段，但是动物实验复杂繁琐、实验周期长、费用高。而体外模拟实验成本相对较低，试验结果可重复性好，且不受医学研究的伦理桎棝，因此被广泛应用于重金属的毒性评价。

体外模拟消化/肠道细胞模型是测定中药中重金属生物可给性的一种新的、有效的技术手段。将生物可给性视为经口的最大生物利用度既反映了机体暴露污染物的最坏情况，达到保护大多数人的目的，又可以为避免传统的评估中假设污染物全部被机体吸收，导致政府采取不必要干预措施。其中 Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，其结构和生理生化功能与小肠上皮细胞相类似。Caco-2细胞培养后可形成紧密联结，并分化出绒毛面即肠腔室 (apical)和基底室(basolateral)即血液循环侧，同时能够表达小肠的多种转运体和代谢酶。因此，Caco-2细胞已被作为模拟小肠表皮细胞吸收过程的国际公认的体外模型。目前现有技术有报道采用体外消化/Caco2细胞模型评价场地土壤中重金属生物可给性/生物有效性及健康风险，发现在不同体外消化方法和不同消化阶段，土壤重金属生物可给性变化范围较大。然而场地土壤重金属污染与中药中重金属的存在形式、重金属种类以及重金属限量标准均有较大差异，并且中药的口服给药方式与场地土壤中重金属通过呼吸等方式摄入体内造成了生物可给性检测方法不同。目前还没有关于采用体外消化 /Caco2细胞模型评价中药中重金属的生物可给性方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法。

本发明提供了一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法，包括以下步骤：

1)在厌氧条件下，将冬虫夏草粉末在模拟胃液中消化，得到胃消化液和残渣；

2)将所述残渣在模拟肠液中消化，得到肠道消化液；

3)吸弃Caco-2细胞模型的原有培养液，将所述肠道消化液加入到肠腔室中，将新鲜细胞培养液加入基底室，经细胞转化后，将得到的细胞培养液过膜，收集滤液进行电感耦合等离子体质谱分析，得到砷含量，计算砷的生物可给性。

优选的，步骤3)中Caco-2细胞模型的建立方法，包括以下步骤：

将Caco-2细胞培养生长融合至80％以上时，用含质量浓度0.25％胰酶的EDTA溶液消化，调整细胞密度至3×10

优选的，步骤1)中冬虫夏草粉末在模拟胃液中消化的方法为将冬虫夏草粉末在模拟胃液中恒温震荡，离心，取上清液浓缩，加入硝酸消解，得到消解液；

所述冬虫夏草粉末的质量和模拟胃液的体积比为0.5g：50mL。

优选的，所述模拟胃液的配制方法为将1.25g胃蛋白酶、0.5g柠檬酸钠、 0.5g苹果酸钠、420μL乳酸和500μL乙酸溶解后定容至1L，调节pH值至 1.5。

优选的，所述冬虫夏草粉末的粒径为50～80目。

优选的，步骤2)中所述残渣在模拟肠液中消化的方法为将所述残渣在模拟肠液中恒温震荡，离心，取上清液浓缩，加入硝酸消解，得到消解液；

每0.5g冬虫夏草粉末得到的残渣用50mL模拟肠液处理。

优选的，所述模拟肠液的制备方法为将0.5g胰酶和1.75g胆酸钠溶解后定容至1L，调节pH值至7.0。

优选的，步骤3)中细胞转化是将分别添加有肠道消化液和新鲜细胞培养液的Caco-2细胞模型置于37℃、5％CO

优选的，步骤3)中所述细胞培养液含体积浓度10％FBS的DMEM高糖培养液。

本发明提供的基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法，是采用transwell培养建立Caco-2肠吸收模型，同时通过体外 PBET模拟胃、肠消化的二步消化法建立体外消化/Caco-2细胞模型，并采用 ICP-MS法测定冬虫夏草中砷的生物可给性，以期为科学、客观地评价其重金属的健康风险以及限量标准的制修定提供依据。实验证明，冬虫夏草中胃相生物可给量为0.339～2.169mg/kg，肠相生物可给量为0.260～1.337mg/kg， Caco-2细胞转运后砷的生物可给性为1.5％～13.0％。本发明提供的方法能促进中药产业发展，节约中药资源，同时为客观、科学地评价中药中重金属对人体的健康风险提供新的思路，为制定科学、合理的重金属限量标准提供依据。

附图说明

图1为本发明提供的基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法，包括以下步骤：

1)在厌氧条件下，将冬虫夏草粉末在模拟胃液中消化，得到胃消化液和残渣；

2)将所述残渣在模拟肠液中消化，得到肠道消化液；

3)吸弃Caco-2细胞模型的原有培养液，将所述肠道消化液加入到肠腔室中，将新鲜细胞培养液加入基底室，经细胞转化后，将得到的细胞培养液过膜，收集滤液进行电感耦合等离子体质谱分析，得到砷含量，计算砷的生物可给性。

本发明在厌氧条件下，将冬虫夏草粉末在模拟胃液中消化，得到胃消化液和残渣。

在本发明中，将冬虫夏草粉碎，过筛，得到冬虫夏草粉末。所述冬虫夏草粉末的粒径优选为50～80目，更优选为60～70目。冬虫夏草粉末在模拟胃液中消化的方法优选为将冬虫夏草粉末在模拟胃液中恒温震荡，离心，取上清液浓缩，加入硝酸消解，得到消解液。所述冬虫夏草粉末的质量和模拟胃液的体积比为0.5g：50mL。所述模拟胃液的配制方法优选为将1.25g胃蛋白酶、0.5g柠檬酸钠、0.5g苹果酸钠、420μL乳酸和500μL乙酸溶解后定容至1L，调节pH值至1.5。所述恒温震荡的温度优选为37℃。所述恒温震荡的时间优选为1h。所述恒温震荡的转速为100rpm。所述厌氧条件优选采用通氩气提供无氧环境。所述离心的转速优选为4000rpm，所述离心的时间优选为5min。所述浓缩优选采用电热板低温浓缩。所述浓缩优选每25mL 上清液浓缩至3mL浓缩液。所述消解优选在消解仪中进行。得到胃消化液后，将所述胃消化液进行电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS分析)，得到胃消化液中砷的含量。按照公式I计算胃相生物可给量。本发明对所述 ICP-MS分析的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的ICP-MS分析方法即可，例如参见现有技术记载即可(ICP-MS法测定18种动物药中重金属及有害元素的残留量及初步风险分析,左甜甜,药物分析杂志,2017,37 (2),237-242.)

得到残渣后，本发明将所述残渣在模拟肠液中消化，得到肠道消化液。

在本发明中，所述残渣在模拟肠液中消化的方法优选为将所述残渣在模拟肠液中恒温震荡，离心，取上清液浓缩，加入硝酸消解，得到消解液。每 0.5g冬虫夏草粉末得到的残渣优选用50mL模拟肠液处理。所述模拟肠液的制备方法优选为将0.5g胰酶和1.75g胆酸钠溶解后定容至1L，调节pH 值至7.0。所述恒温震荡的温度优选为37℃，所述恒温震荡的时间优选为4h。所述离心的转速优选为4000rpm，所述离心的时间优选为5min。所述浓缩优选采用电热板低温浓缩。所述浓缩优选将每25mL的上清液浓缩至3mL。所述消解优选采用微波消解仪中。将得到的消解液优选用超纯水定容至50 mL容量瓶中，得到肠道消化液。得到肠道消化液后，将所述肠道消化液进行ICP-MS分析，得到肠道消化液中砷的含量。按照公式II计算肠相生物可给量。本发明对所述ICP-MS分析的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的ICP-MS分析方法即可，例如参见现有技术记载即可(ICP-MS法测定18 种动物药中重金属及有害元素的残留量及初步风险分析,左甜甜,药物分析杂志,2017,37(2),237-242.)。

吸弃Caco-2细胞模型的原有培养液，将所述肠道消化液加入到肠腔室中，将新鲜细胞培养液加入基底室，经细胞转化后，将得到的细胞培养液过膜，收集滤液进行电感耦合等离子体质谱分析，得到砷含量，计算砷的生物可给性。

在本发明中，Caco-2细胞模型的建立方法，优选包括以下步骤：

将Caco-2细胞培养生长融合至80％以上时，以质量浓度0.25％EDTA- 胰酶消化，调整细胞密度至3×10

在本发明中，所述Caco-2细胞培养的方法优选将Caco-2细胞接种于T75 培养瓶，于37℃、5％CO

在本发明中，所述肠道消化液的添加体积优选为4～6mL，更优选为5 mL。所述新鲜细胞培养液的添加体积优选为4～6mL，更优选为5mL。细胞转化优选是将分别添加有肠道消化液和新鲜细胞培养液的Caco-2细胞模型置于37℃、5％CO

在本发明中，电感耦合等离子体质谱分析的参数可参见现有技术记载即可(ICP-MS法测定18种动物药中重金属及有害元素的残留量及初步风险分析,左甜甜,药物分析杂志,2017,37(2),237-242.)。

砷的生物可给性的计算公式如公式III所示。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

冬虫夏草样品(均购自西藏拉萨药材市场)粉碎，过50目筛，精密称 0.5g冬虫夏草粉末，加入50mL模拟胃液(由1.25g胃蛋白酶、0.5g柠檬酸钠、0.5g苹果酸钠、420μL乳酸和500μL乙酸配制而成，溶解后定容至1 L，并用HCl调节pH值至1.5)。通氩气1～2min，模拟胃肠中的厌氧环境。在37℃的恒温水浴中震荡1h(100r·min

胃液提取结束后，向残渣中加入50mL模拟肠液(由0.5g胰酶和1.75g 胆酸钠配制而成，溶解后定容至1L，再用NaOH将pH值调至7.0)。在37℃的恒温水浴中震荡4h(100r·min

基于Caco-2细胞模型的冬虫夏草中砷生物可给性的考察

将Caco-2细胞置于T75培养瓶内，以含10％FBS的DMEM高糖培养液，于37℃、5％CO

当Caco-2细胞生长融合至80％以上时，以0.25％EDTA-胰酶消化，调整细胞密度至4×10

从培养箱中取出Transwell 24孔板，在室温条件下平衡0.5h，将用培养液平衡过的电极垂直插入细胞培养小室内，待示数稳定时记录读数。当TEER 值大于200Ω·cm

吸弃Transwell 24孔板中的培养液，取“提取肠液”0.5mL,加入到肠腔室中，基底室加入培养液0.5mL。将Transwell 24孔板在37℃、5％CO

采用ICP-MS分析得到胃相生物可给量、肠相生物可给量、Caco-2细胞转运后生物可给量，并按照公式III计算Caco-2细胞转运后砷的生物可给性。结果见表1。

表1不同批次冬虫夏草生物可给性结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。