TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法和应用

技术领域

本申请涉及基因人源化的非人动物的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。

肿瘤坏死因子受体2(Tumor necrosis factor binding protein 2，TNFR2，又称CD120b、p75等)属于TNF receptor superfamily家族，是一种单次跨膜蛋白，属于免疫检测点的新成员之一。人TNFR2基因跨度～55kb，有4个转录本，编码461个氨基酸；小鼠TNFR2基因跨度～45kb，有2个转录本，编码474个氨基酸。TNFR2在正常条件下处于未激活状态，当结合三聚体TNFa配体后，TNFR2也发生三聚体化，并发生结构变化，处于激活状态。

已有研究表明，在健康人群中，TNFR2仅在免疫细胞的某些亚群表达，包括淋巴细胞(CD4和CD8细胞)、内皮细胞、小胶质细胞和特异性神经元亚群、少突胶质细胞、心肌细胞和人间充质干细胞；在肿瘤微环境中免疫抑制性的Treg和很多类型的癌细胞(如肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和卵巢癌)的表面上高度表达。由于TNFR2在肿瘤微环境中很好的特异性表达，使得靶向TNFR2可以同时杀伤Treg细胞和肿瘤细胞，小鼠体内研究表明阻断TNFR2可以有效抑制肿瘤细胞生长，小鼠生存率显著提高，且机制上Teff细胞增加，Teff/Treg增加，暗示Treg细胞减少。实验还发现对PD-1等药物逃逸的肿瘤细胞中TNFR2表达上调，可见在临床上，靶向TNFR2治疗可能对目前肿瘤免疫治疗耐受的细胞具有更好的效果。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。由于人TNFR2的序列与啮齿类存在显著差异，如小鼠和人TNFR2蛋白序列的一致性为60％，所以，一般情况下识别人TNFR2蛋白的抗体，无法识别小鼠TNFR2，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向TNFR2信号通路药物的药效。

鉴于TNFR2在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败率最小化，本领域急需开发涉及TNFR2相关的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化的非人动物，如与人源化小鼠交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对多个信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中包括人TNFR2基因的全部或部分。

本发明的第二方面，提供了一种TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法，所述非人动物体内表达人或人源化TNFR2蛋白。

本发明的第三方面，提供了一种TNFR2基因人源化的非人动物，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中包括人TNFR2基因的全部或部分。

本发明的第四方面，提供了一种TNFR2基因人源化的非人动物，所述非人动物体内表达人或人源化TNFR2蛋白。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中包括非人动物TNFR2基因的部分序列，所述的非人动物TNFR2基因的部分包括非人动物调控元件，优选的，所述的非人动物调控元件包括启动子，进一步优选的，所述的人TNFR2基因与启动子可操作性的连接在非人动物TNFR2基因座。

优选的，所述的非人动物体内内源TNFR2蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人或人源化TNFR2蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物基因组中的TNFR2基因为纯合或杂合的。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中包含人或人源化TNFR2基因，其中，所述的人源化TNFR2基因包括人TNFR2基因的2号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，包括人TNFR2基因的2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子或6号外显子中的任一种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中包括人TNFR2基因的2号外显子的全部或部分，3至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子。其中，人TNFR2基因2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，所述的人TNFR2基因6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列。

优选的，所述TNFR2基因人源化的非人动物中至少一个染色体上包含人TNFR2基因。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区，其中所述胞外区包含人TNFR2蛋白胞外区的全部或部分，所述的胞外区的部分包含从胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸开始至胞外区C端，优选的，所述的胞外区的部分包含SEQ ID NO:4第33-257位氨基酸序列，进一步优选的，所述的跨膜区包含人TNFR2蛋白跨膜区的全部或部分，所述的跨膜区的部分包含跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸，更进一步优选的，所述的跨膜区的部分包含SEQ ID NO:4第258-259位氨基酸序列。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中TNFR2基因编码的蛋白包括SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中TNFR2基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区、信号肽和胞内区，其中，胞外区包含人TNFR2基因编码的胞外区的全部或部分，所述的胞外区序列连续5-235个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致，进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-225个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致，更进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-100个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。

进一步优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少50个与人TNFR2胞外区序列相同，更优选的，所述的胞外区序列包含SEQ ID NO：4第23-257位所示氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，所述的胞外区序列包含SEQ ID NO：4第33-257位所示的氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的跨膜区包含人或非人动物TNFR2基因编码的跨膜区的全部或部分。进一步优选的，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：2第259-288位所示氨基酸序列的全部或部分；或者，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：4第258-287位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的信号肽来源于非人动物TNFR2基因编码。进一步优选的，所述的信号肽序列如SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的胞内区来源于非人动物TNFR2基因编码。进一步优选的，所述的胞内区序列如SEQ ID NO：2第289-474位所示氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，胞外区包含人TNFR2基因编码的胞外区的全部或部分，所述的信号肽和胞内区来源于非人动物TNFR2基因编码，所述跨膜区包含人或非人动物TNFR2基因编码的跨膜区的全部或部分，同时人TNFR2基因和非人动物TNFR2基因通过序列拼接连接于非人动物内源的TNFR2启动子后。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的基因组中包括如SEQ ID NO：7所示的序列。

优选的，使用基因编辑技术进行TNFR2基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，所述的人或人源化TNFR2基因通过内源调控元件调控。

优选的，所述的构建方法包括将包含人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物TNFR2基因座。进一步优选的，将包含人TNFR2基因2号外显子的全部或部分，3号至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分，包含2-3号内含子和/或5-6号内含子，插入或替换至非人动物TNFR2基因座，其中，2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列。更进一步优选的，将包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列插入或替换至非人动物TNFR2基因座。

优选的，所述的构建方法包括将包含编码人或人源化TNFR2蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物TNFR2基因座。更优选的，将包含编码SEQ ID NO：4第33-259位的核苷酸序列插入或替换至非人动物TNFR2基因座。

优选的，所述的构建方法包括将包含人或人源化TNFR2基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物TNFR2基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为小鼠，将人TNFR2基因的全部或部分插入或替换(优选为原位替换)小鼠内源TNFR2基因；优选的，将人TNFR2基因的2-6号外显子替换(优选为原位替换)小鼠内源TNFR2基因的2-6号外显子。

优选的，所述的插入或替换的位置可以为非人动物TNFR2基因的1号至10号外显子上。进一步优选为2号至6号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为小鼠，所述小鼠TNFR2蛋白序列如SEQ ID NO：2中的全部或部分片段所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述人TNFR2蛋白序列如SEQ ID NO：4中的全部或部分片段所示。

优选的，所述的构建方法包括使用靶向载体进行非人动物的构建。

优选的，将人TNFR2基因的全部或部分插入或替换(优选为原位替换)内源TNFR2基因构建TNFR2基因人源化的非人动物，进一步优选的，使用靶向载体将人TNFR2基因的2号至6号外显子的全部或部分替换(优选为原位替换)内源TNFR2基因的相应区域，其中，至少一个细胞中的内源TNFR2基因被人TNFR2基因全部或部分替换。

所述的靶向载体包含人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子的全部或部分。优选的，包含人TNFR2基因2号外显子的全部或部分，3号至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子，其中，2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：4第33-259位核苷酸序列。更进一步优选的，包括如SEQID NO：7所示的序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，其中，所述5’臂选自TNFR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选为与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选包含SEQ ID NO：5；所述的5’臂选自TNFR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选为与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选包含SEQ ID NO：6。

优选的，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。

优选的，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。

进一步优选的，所述的待改变的转换区位于TNFR2基因的2号外显子至6号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法包括如下步骤：

1)提供一种包含靶向载体的细胞，所述的细胞为受精卵细胞或胚胎干细胞；

2)将步骤1)所述的细胞在培养液中进行培养；

3)将培养后细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；其中，所述非人哺乳动物为假孕雌性；

4)鉴定步骤3)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人哺乳动物中的种系传递。

优选的，所述受精卵来源于任何非人哺乳动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；更进一步优选的，所述受精卵选自C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。

优选的，所述的胚胎干细胞来源于任何非人哺乳动物。进一步优选的，所述的胚胎干细胞来源于啮齿类动物。更进一步优选的，所述胚胎干细胞选自C57BL/6胚胎干细胞、FVB/N胚胎干细胞、129胚胎干细胞、BALB/c胚胎干细胞、DBA/1胚胎干细胞或DBA/2胚胎干细胞。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列的全部或部分；

B)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列序列同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

D)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

进一步优选的，所述的人源化TNFR2蛋白包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)编码人源化TNFR2蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：9所示蛋白的核苷酸序列杂交；

D)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

E)具有SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化TNFR2基因包含下列组中的一种：

(a)SEQ ID NO：7所示的序列的部分或全部；

(b)与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的部分或全部的同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(c)与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

(d)具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化TNFR2基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：

(a)SEQ ID NO：8所示的序列的部分或全部；

(b)与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的部分或全部的同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(c)与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

(d)具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TNFR2基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的非人动物中至少一个染色体上包含人源化TNFR2基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TNFR2基因序列包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：29和/或SEQ ID NO：11所示的序列。

本发明的第五方面，提供了一种TNFR2基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子的全部或部分，优选的，包含人TNFR2基因2号外显子的全部或部分，3号至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子，其中，2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：4第33-259位核苷酸序列，更进一步优选的，包括如SEQ ID NO：7所示的序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，其中，所述5’臂选自TNFR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选为与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选包含SEQ ID NO：5；所述的5’臂选自TNFR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选为与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选包含SEQ ID NO：6。

优选的，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。

优选的，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。

优选的，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自TNFR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自TNFR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。

优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段来自人。进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列为人TNFR2基因核苷酸序列部分或全部。更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列包括人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子的全部或部分。

更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列包括人TNFR2基因的2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子或6号外显子中的一个或两个以上的组合。在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列包括人TNFR2基因的2号外显子的全部或部分、3号至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子。其中，人TNFR2基因2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，所述的人TNFR2基因6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ IDNO：7所示。

优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列编码SEQ ID NO：4第23-259位所示氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列编码SEQID NO：4第33-259位所示氨基酸序列的全部或部分。

进一步优选的，所述的待改变的转换区位于TNFR2基因的2号外显子至6号外显子。

优选的，所述的靶向载体还包括可选择的标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的TNFR2基因的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的TNFR2基因的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第六方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

本发明的第七方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述包含靶向载体的细胞在构建TNFR2基因人源化中的应用。优选的，在敲除、插入或替换TNFR2基因的2号至6号外显子的部分或全部中的应用。

本发明的第八方面，提供了一种包含TNFR2基因人源化的细胞或细胞株，所述的包含TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中包括人TNFR2基因的全部或部分，同时内源TNFR2蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人TNFR2基因通过内源性调控元件调控。

更优选的，所述的内源性调控元件包括启动子，所述的人TNFR2基因与内源启动子可操作性的连接在内源TNFR2基因座。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中的TNFR2基因为纯合或杂合的。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株表达人或人源化TNFR2蛋白，该人或人源化TNFR2蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中包括人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中包括人TNFR2基因的2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子或6号外显子的一种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中包括人TNFR2基因的2号外显子的全部或部分、3号至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子，其中，人TNFR2基因2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，所述的人TNFR2基因6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列。优选的，所述的细胞或细胞株中至少一个染色体上包含人TNFR2基因。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中的TNFR2基因编码SEQ ID NO：4第33-259位的氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中TNFR2基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区、信号肽和胞内区，其中，胞外区的部分包含来源于人TNFR2基因编码的胞外区的全部或部分，所述的胞外区序列连续5-235个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-225个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。更进一步优选的，胞外区序列连续10-100个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。

优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少50个与人TNFR2胞外区序列相同，更优选的，所述的胞外区序列包含SEQ ID NO：4第23-257位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的跨膜区包含人或非人动物TNFR2基因编码的跨膜区的全部或部分。更优选的，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：2第259-288位所示氨基酸序列的全部或部分；或者，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：4第258-287位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的信号肽来源于非人动物TNFR2基因编码。更优选的，所述的信号肽序列如SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的胞内区来源于非人动物TNFR2基因编码。更优选的，所述的胞内区序列如SEQ ID NO：2第289-474位所示氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，胞外区包含人TNFR2基因编码的胞外区的全部或部分，所述的跨膜区、信号肽和胞内区来源于非人动物TNFR2基因编码，所述跨膜区包含人或非人动物TNFR2基因编码的跨膜区的全部或部分，同时人TNFR2基因和非人动物TNFR2基因通过序列拼接连接于非人动物内源的TNFR2启动子后。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中包括如SEQ ID NO：7所示的序列。

优选的，所述的细胞株来源于非人动物的细胞株。

所述细胞或细胞株来源于小鼠的细胞或细胞株，将人TNFR2基因的全部或部分插入或替换(优选为原位替换)小鼠细胞或细胞株内源TNFR2基因；优选的，将人TNFR2基因的2-6号外显子替换(优选为原位替换)小鼠细胞或细胞株内源TNFR2基因的2-6号外显子。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)编码人源化TNFR2蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：9所示蛋白的核苷酸序列杂交；

D)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或。

E)具有SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的基因组中包含人源化TNFR2基因，所述的人源化TNFR2基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：

(a)编码上述的人源化TNFR2蛋白；

(b)SEQ ID NO：8所示的序列的部分或全部；

(c)与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的部分或全部的同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(d)在严格条件下，与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列杂交；

(e)与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

(f)具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的细胞或细胞株中，至少一个染色体包含人源化TNFR2基因的序列。

本发明所述的细胞或细胞株不是动物品种，所述的包含TNFR2基因人源化的细胞或细胞株不会发育为个体。

本发明的第九方面，提供了一种上述细胞或细胞株的制备方法，使用基因编辑技术进行TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用靶向载体进行细胞或细胞株的构建。进一步优选的，将人TNFR2基因的全部或部分插入或替换(优选为原位替换)内源TNFR2基因构建TNFR2基因人源化的细胞或细胞株，其中，至少一个细胞的内源TNFR2基因被人TNFR2基因全部或部分替换。更优选的，使用靶向载体将人TNFR2基因的2号至6号外显子的全部或部分替换(优选为原位替换)内源TNFR2基因的相应区域。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的TNFR2基因人源化的细胞或细胞株的制备方法包括如下步骤：

1)提供一种包含靶向载体的细胞，所述的细胞为受精卵细胞或胚胎干细胞；

2)将步骤1)所述的细胞在培养液中进行培养。

本发明的第十方面，提供了一种制备多基因人源化的非人动物或其子代的方法，包括如下步骤：

(1)制备上述的TNFR2基因人源化的非人动物，或者，采用上述TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法制备的TNFR2基因人源化的非人动物；

(2)将步骤(1)制备获得的TNFR2基因人源化的非人动物与其他人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化的非人动物或其子代。

优选的，所述的其他人源化动物为非人哺乳动物。更优选的，所述的非人哺乳动物可以为啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备TNFR2基因人源化动物的非人哺乳动物。最为优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

优选的，所述的其他人源化动物包括但不限于基因PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、TIM3、CD27、CD28、CD40、CD47、CD73、SIRPA、OX-40、4-1BB、GITR或TIGIT等基因人源化动物。

优选的，所述多基因人源化动物基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

优选的，所述多基因人源化的非人动物为双基因人源化的非人动物、三基因人源化的非人动物、四基因人源化的非人动物、五基因人源化的非人动物、六基因人源化的非人动物、七基因人源化的非人动物、八基因人源化的非人动物或九基因人源化的非人动物。

本发明的第十一方面，提供了一种上述的制备多基因人源化的非人动物或其子代的方法制备获得的多基因人源化的非人动物或其子代。

本发明的第十二方面，提供了一种荷瘤或炎症的动物模型，所述的动物模型来源于上述的方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的多基因人源化的非人动物或其子代。

本发明的第十三方面，提供了一种荷瘤或炎症的动物模型的制备方法，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法制备的TNFR2基因人源化的非人动物或多基因人源化的非人动物或其子代的步骤。

更优选的，所述的动物模型的制备方法还包括在上述构建方法制备的TNFR2基因人源化的非人动物或多基因人源化的非人动物或其子代植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第十四方面，提供了一种上述的方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的多基因人源化的非人动物或其子代在制备荷瘤或炎症的动物模型中的应用。

本发明的第十五方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代，或者，上述的荷瘤或炎症的动物模型。

本发明的第十六方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代，或者，上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。

本发明的第十七方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的构建方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代，或者，上述的荷瘤或炎症的动物模型。

本发明的第十八方面，提供了一种人源化TNFR2蛋白，所述的人源化TNFR2蛋白包含人TNFR2蛋白的胞外区的全部或部分，其中，所述的胞外区的部分包含从胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸开始至胞外区C端，优选的，所述的胞外区的部分包含SEQ ID NO:4第33-257位氨基酸序列，进一步优选的，所述的跨膜区包含人TNFR2蛋白跨膜区的全部或部分，所述的跨膜区的部分包含跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸，更进一步优选的，所述的跨膜区的部分包含SEQ ID NO:4第258-259位氨基酸序列。

优选的，所述的人TNFR2蛋白包含人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子编码的蛋白的全部或部分，优选的，包含从2号外显子编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至6号外显子编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，进一步优选的，包含SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列。

本发明的第十九方面，提供了一种人源化TNFR2蛋白，所述的人源化TNFR2蛋白包括非人动物TNFR2蛋白部分，和，人TNFR2蛋白部分的拼接。

优选的，所述的人TNFR2蛋白部分包括人TNFR2基因的2号外显子至6号外显子编码的蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的人TNFR2蛋白部分包括人TNFR2基因的2号外显子的全部或部分，3至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分编码的蛋白。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白包括胞外区、跨膜区、信号肽和胞内区，其中，所述胞外区包括人TNFR2蛋白胞外区的全部或部分，所述的胞外区序列连续5-235个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-225个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。最为优选的，所述的胞外区序列连续10-100个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。

优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少50个与人TNFR2胞外区序列相同，进一步优选的，所述的胞外区序列包括如SEQ ID NO：4第23-257位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的跨膜区包含人或非人动物TNFR2蛋白跨膜区的全部或部分。

进一步优选的，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：2第259-288位所示氨基酸序列的全部或部分；或者，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：4第258-287位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的信号肽来源于非人动物TNFR2蛋白。进一步优选的，所述的信号肽序列如SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的胞内区来源于非人动物TNFR2蛋白。进一步优选的，所述的胞内区序列如SEQ ID NO：2第289-474位所示氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述胞外区包含人TNFR2蛋白胞外区的全部或部分，所述的跨膜区、信号肽和胞内区来源于动物TNFR2蛋白，优选的，所述的跨膜区包含人或非人动物TNFR2蛋白跨膜区的全部或部分。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

优选的，所述的人源化TNFR2蛋白包含下列组中的一种：

A)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列的全部或部分；

B)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列序列同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

D)SEQ ID NO：4第33-259位所示氨基酸序列包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TNFR2蛋白包含下列组中的一种：

A)为SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)编码人源化TNFR2蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：9所示蛋白的核苷酸序列杂交；

D)与SEQ ID NO：9所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

E)具有SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第二十方面，提供了一种编码上述人源化TNFR2蛋白的人源化TNFR2基因。

本发明的第二十一方面，提供了一种人源化TNFR2基因，所述的人源化TNFR2基因包括非人动物TNFR2基因的部分，和，人TNFR2基因的部分的拼接。

优选的，所述的人TNFR2基因的部分包括人TNFR2基因2号外显子至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人TNFR2基因的部分包括人TNFR2基因的2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子或6号外显子中的任一个或两个以上的组合。更进一步优选的，所述的人TNFR2基因的部分包括人TNFR2基因的2号外显子全部或部分，3号至5号外显子的全部，和6号外显子的全部或部分序列，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子。其中，人TNFR2基因2号外显子的部分包含从编码胞外区N端第1-15(具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止，优选至少包含2号外显子3’-5’的50-100bp的核苷酸序列，具体为2号外显子中从2号外显子3’端至长度为56、57、58、59、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90bp的核苷酸序列，所述的人TNFR2基因6号外显子的部分包含从6号外显子的第一个核苷酸开始至编码跨膜区N端第1-5(具体为1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸为止，优选至少包含6号外显子5’-3’的223-236bp的核苷酸序列，具体为6号外显子中从6号外显子5’端至长度为223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236bp的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TNFR2基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区、信号肽和胞内区，其中，所述胞外区包含人TNFR2基因编码的胞外区的全部或部分，所述的胞外区序列连续5-235个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-225个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。更进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-100个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。

优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少50个与人TNFR2胞外区序列相同，进一步优选的，所述的胞外区序列包含SEQ ID NO：4第23-257位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的跨膜区包含人或非人动物TNFR2基因编码的跨膜区的全部或部分。进一步优选的，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：2第259-288位所示氨基酸序列的全部或部分；或者，所述的跨膜区序列包含SEQ ID NO：4第258-287位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的信号肽序列来源于非人动物TNFR2基因编码。进一步优选的，所述的信号肽序列如SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的胞内区来源于非人动物TNFR2基因编码。进一步优选的，所述的胞内区序列如SEQ ID NO：2第289-474位所示氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，胞外区包含人TNFR2基因编码的胞外区的全部或部分，所述的信号肽和胞内区来源于非人动物TNFR2基因编码，所述的跨膜区包含人或非人动物TNFR2基因编码的跨膜区的全部或部分，同时人TNFR2基因和非人动物TNFR2基因通过序列拼接连接于非人动物内源的TNFR2启动子后。

优选的，所述的人源化TNFR2基因包括如SEQ ID NO：7所示的序列的全部或部分。

优选的，所述的人源化TNFR2基因编码SEQ ID NO：4第33-259位的氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的人源化TNFR2基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：

(a)编码上述的人源化TNFR2蛋白；

(b)SEQ ID NO：8所示的序列的部分或全部；

(c)与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的部分或全部的同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(d)在严格条件下，与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列杂交；

(e)与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

(f)具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO：8所示序列为TNFR2基因人源化小鼠TNFR2 DNA的非模板链、编码链或有义链。

本发明的第二十二方面，提供了一种包含TNFR2基因人源化的细胞、组织或者器官，所述的细胞、组织或者器官表达上述人源化TNFR2蛋白。优选的，所述的细胞、组织或者器官包含上述的人源化TNFR2基因。

本发明的第二十三方面，提供了来源于上述的构建方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代、上述包含TNFR2基因人源化的细胞或细胞株、上述的方法制备的细胞或细胞株、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述组织或器官或其培养物、上述荷瘤后的瘤组织、上述的人源化TNFR2蛋白、上述的人源化TNFR2基因、上述的构建体、上述包含构建体的细胞，或者，上述包含细胞的组织，上述细胞、组织或器官，上述的表达人或人源化TNFR2蛋白的非人动物，或者，上述的荷瘤或炎症的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或在筛选、验证、评价或研究TNFR2信号通路基因功能、TNFR2信号通路相关抗体、针对TNFR2信号通路靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。

优选的，所述应用或用途包括在制备药物组合物或者检测试剂盒中的用途。

优选的，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法。

优选的，所述药物筛选或药效评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十四方面，提供了一种抗体筛选的方法，所述的方法包括向个体施加抗人TNFR2抗体，其中，所述的个体选自上述的方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代，上述表达人或人源化TNFR2蛋白的非人动物，或者，上述的荷瘤或炎性的动物模型。

本发明的第二十五方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括向个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较，其中，所述的个体选自上述的方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代，上述表达人或人源化TNFR2蛋白的非人动物，或者，上述的荷瘤或炎性的动物模型。

优选的，所述的方法包括向个体体内移植肿瘤细胞的步骤。

优选的，所述药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括TNFR2靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

本发明的第二十六方面，提供了一种治疗方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加治疗方案，对施加治疗方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价，其中，所述的个体选自上述的方法构建的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的TNFR2基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代，上述的荷瘤或炎性的动物模型，或者，上述的非人动物。

优选的，所述治疗方案是CAR-T。

优选的，所述的评价方法不是治疗方法。该评价方法对治疗方案的效果进行检测和评价，以确定该治疗方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、慢性阻塞性肺病、心肌炎、肾炎、肝炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、葡萄膜炎、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫相关疾病选自再生障碍性贫血、哮喘、特发性血小板减少症、葡萄膜炎、多发性硬化症等。

本发明所述的“全部或部分”或“部分或全部”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“x-xx号外显子”或者“x号至xx号外显子”或“x号至xx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至6号外显子”包含2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子和6号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“4-5号内含子”表示4号外显子与5号外显子之间的内含子。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“TNFR2基因座”表示TNFR2基因1号至10号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被插入或替换的TNFR2基因座可以是TNFR2基因2号至6号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为2号至6号外显子上的任选一段的DNA序列。

本发明所述的细胞、组织等不是动物品种，其也不会发育为个体。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物可以为啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备TNFR2基因人源化的非人动物的非人哺乳动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd edited By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠和人TNFR2基因对比示意图(非按比例)；

图2：人源化小鼠TNFR2基因示意图(非按比例)，其中，用人TNFR2基因2号至6号外显子的部分片段替换小鼠的相应区域获得人源化TNFR2基因；

图3：TNFR2基因打靶策略及靶向载体设计示意图，其中，靶向载体包含5’同源臂、3’同源臂以及含有人TNFR2基因的TNFR2-A片段；

图4：采用5’探针、3’探针和Neo探针进行Southern Blot鉴定的结果图，其中，WT为野生型C57BL/6小鼠，1-F08、1-G10、2-A11、2-G03、2-G04、2-C12、2-E03、2-F04、2-H06为细胞编号；

图5：阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性筛选标记基因过程示意图；

图6：F1代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠对照，H

图7：小鼠体内脾脏细胞中TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中B-hTNFR2(H/+)为TNFR2基因人源化杂合子小鼠，C57BL/6为野生型小鼠，图A、C、E为C57BL/6野生型小鼠脾脏检测结果，图B、D、F为B-hTNFR2(H/+)小鼠脾脏检测结果；

图8：小鼠体内脾脏细胞中TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中B-hTNFR2(H/+)为TNFR2基因人源化杂合子小鼠，图A、C、E为C57BL/6野生型小鼠脾脏检测结果，图B、D、F为B-hTNFR2(H/+)小鼠脾脏检测结果；

图9：未刺激的小鼠体内脾脏细胞中T细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图10：经CD3刺激的小鼠体内脾脏细胞中T细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图11：未刺激的小鼠体内脾脏细胞中CD4+T细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图12：经CD3刺激的小鼠体内脾脏细胞中CD4+T细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图13：未刺激的小鼠体内脾脏细胞中Treg细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图14：经CD3刺激的小鼠体内脾脏细胞中Treg细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图15：未刺激的小鼠体内脾脏细胞中B细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图16：经CD3刺激的小鼠体内脾脏细胞中B细胞表面TNFR2蛋白表达流式分析结果，其中，WT为C57BL/6野生型小鼠，H/H为TNFR2基因人源化纯合子小鼠；

图17：脾脏中免疫细胞分群结果，其中WT代表野生型C57BL/6，H/H代表TNFR2人源化小鼠纯合子；

图18：脾脏中T细胞亚群的分群结果，其中WT代表野生型C57BL/6，H/H代表TNFR2人源化小鼠纯合子；

图19：淋巴结中免疫细胞分群结果，其中WT代表野生型C57BL/6，H/H代表TNFR2人源化小鼠纯合子；

图20：淋巴结中免疫细胞T细胞亚群的分群结果，其中WT代表野生型C57BL/6，H/H代表TNFR2人源化小鼠纯合子；

图21：利用q-PCR检测TNFR2基因在小鼠体内的相对表达水平，其中WT代表野生型C57BL/6，H/H代表TNFR2人源化小鼠纯合子；

图22：脾脏中CD3+T细胞与抗人TNFR2抗体的结合情况，其中WT代表野生型C57BL/6，H/H代表TNFR2人源化小鼠纯合子；

图23：小鼠结肠癌细胞MC38植入TNFR2人源化小鼠纯合子体内，并利用抗人TNFR2抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重情况；

图24：小鼠结肠癌细胞MC38植入TNFR2人源化小鼠纯合子体内，并利用抗人TNFR2抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重变化情况；

图25：小鼠结肠癌细胞MC38植入TNFR2人源化小鼠纯合子体内，并利用抗人TNFR2抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠肿瘤体积测量结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下述实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

EcoRI或NdeI或SspI酶购自NEB，货号分别为R3101M、R0111L和R3132M。

C57BL/6小鼠和Flp工具鼠均购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

流式细胞仪生产厂家为BD，型号为Calibur；

离心机生产厂家为白洋，型号为R320；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号为BCG-DX-001；

MEGAshortscript

实施例1 TNFR2基因人源化小鼠

小鼠TNFR2基因(NCBI Gene ID：21938，Primary source：MGI：1314883，UniProtID：P25119，位于4号染色体NC_000070.6的第145212368至145246870位，基于转录本NM_011610.3及其编码蛋白NP_035740.2(SEQ ID NO：2))和人TNFR2基因(NCBI Gene ID：7133，Primary source：HGNC:11917，UniProt ID：P20333，位于1号染色体NC_000001.11的第12166948至12209222位，基于转录本NM_001066.2及其编码蛋白NP_001057.1(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在内源小鼠TNFR2基因座引入人TNFR2的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化TNFR2蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在内源小鼠TNFR2基因座上用人TNFR2基因序列替换小鼠TNFR2基因序列，如将至少包含小鼠TNFR2基因的2号外显子至6号外显子的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化TNFR2基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠TNFR2基因不同程度的人源化改造。

进一步设计了图3所示的打靶策略。图3的示意图中显示了靶向载体上含有小鼠TNFR2基因的上游和下游的同源臂序列(包含内源TNFR2基因2号外显子部分序列及其上游的4468bp和7、8号外显子及其下游的共3487bp的小鼠DNA)，以及包含人TNFR2基因序列的TNFR2-A片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000070.6的第145233556-145229089位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQID NO：6)与NCBI登录号为NC_000070.6的第145223912-145220426位核苷酸序列相同；TNFR2-A片段上有4275bp的人TNRF2的第2号外显子部分序列至第6外显子部分序列的基因组DNA(SEQ ID NO：7)，该人基因组DNA序列与NCBI登录号为NC_000001.11的第12188814-12193088位核苷酸序列相同，其上游与5’同源臂直接连接，下游与鼠基因座的连接设计为

改造后的人源化小鼠TNFR2的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。鉴于人TNFR2或小鼠TNFR2可能具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因座的连接设计为

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用EcoRI或NdeI或SspI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，见表1)检测，结果见如图4所示，检测结果表明9个经PCR验证为阳性的克隆中，2-G03、2-G04、2-C12和2-F04为阳性杂合克隆且无随机插入。

其中，PCR测定包括下述引物：

F1：5’-CTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3’(SEQ ID NO：12)，

R1：5’-CCTAACCTCTCTTGGTGCTGAGAAC-3’(SEQ ID NO：13)；

F2：5’-GATCAGTGAGACAGTCCAACTTGGC-3’(SEQ ID NO：14)，

R2：5’-GCATGGGCCAGTGCATAGAACTAG-3’(SEQ ID NO：15)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

F：5’-TGATGGTGGGATGAGTCTGAAGAAG-3’(SEQ ID NO：16)，

R：5’-GAATGCCTCACCCTCTCTGCTATTA-3’(SEQ ID NO：17)；

3’探针(3’Probe)：

F：5’-ACCTCGAGTCAGACTTCTGTAGGTA-3’(SEQ ID NO：18)，

R：5’-CTAGGGATATAAGCAGAACGTGGCT-3’(SEQ ID NO：19)；

Neo探针(Neo Probe)：

F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：20)，

R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：21)。

表1 具体探针及目的片段的长度

将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到TNFR2基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去Neo)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-1小鼠为阳性杂合小鼠。PCR测定引物如表2所示。

表2 PCR引物及目的条带大小

其中，WT为野生型小鼠，Mut为TNFR2人源化小鼠。

这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的TNFR2基因人源化小鼠(即B-hTNFR2)。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化TNFR2蛋白的表达情况，如流式细胞术检测(FACS)等。取4周龄野生型C57BL/6小鼠和TNFR2人源化小鼠杂合子的脾脏细胞，分为3组，按照如下染色方案进行流式检测：先用PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse TCRβchain(anti-mTcRβPerCP/Cy5.5)(购自Biolegend，货号109228)和FITC anti-mouseCD19Antibody(anti-mCD19 FITC)(购自Biolegend，货号115506)标记细胞，然后用抗鼠TNFR2抗体PE anti-mouse CD120b(TNF R Type II/p75)Antibody(anti-mTNFR2 PE)(购自Biolegend，货号113405)或抗人TNFR2抗体PE anti-human CD120bAntibody(anti-hTNFR2PE)(购自Biolegend，货号358403)识别染色后进行流式检测，对照组使用同型对照(ISO)抗体PE Syrian Hamster IgG Isotype Ctrl Antibody(购自Biolegend，货号402008)或PERat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody(购自Biolegend，货号400508)。流式分析结果表明，可在正常野生型小鼠脾脏细胞中检测到鼠TNFR2蛋白的表达(图7C、8C)，但未检测到人或人源化TNFR2蛋白的表达(图7E、8E)；可在TNFR2人源化杂合子体内检测到鼠TNFR2蛋白的表达(图7D、8D)和人源化TNFR2蛋白的表达(图7F、8F)；对图7、8的进一步分析显示人源化和野生型小鼠脾脏中表达TNFR2蛋白的细胞一致且表达水平相当，表明经人源化改造后小鼠体内TNFR2可正常表达。

在另一个实验中，取4-6周龄野生型C57BL/6小鼠和TNFR2基因人源化小鼠纯合子各2只，随机选择野生型和TNFR2基因人源化小鼠各1只，先用抗鼠CD3抗体(mCD3)进行刺激，然后所有小鼠按照同样的方法检测小鼠体内脾脏中多种免疫细胞上TNFR2蛋白的表达情况，流式染色方案如下：先用anti-mTcRβPerCP/Cy5.5、anti-mCD19 FITC、APC anti-mouse/rat Foxp3(购自eBioscience，货号17-5773-82)和Brilliant Violet 421

其中，T细胞被定为完整的、单一的、活的，CD19-，TCR+；CD4+T细胞被定为完整的、单一的、活的，CD19-，TCR+,CD4+；Treg细胞被定义为完整的、单一的、活的，CD19-，TCR+,CD4+,Foxp3+；B细胞被定为完整的、单一的、活的，CD19+，TCR-。

流式分析结果表明，可在正常野生型小鼠脾脏细胞中的T细胞、CD4+T细胞、Treg细胞和B细胞体内检测到鼠TNFR2的表达(图9A至图16A)，未检测到人或人源化TNFR2的表达(图9C至图16C)；可在TNFR2人源化基因工程小鼠纯合子细胞上检测到人源化TNFR2的表达(图9D至图16D)，未检测到鼠TNFR2的表达(图9B至图16B)。经过CD3刺激后，野生型和人源化小鼠体内的TNFR2在免疫细胞表面的表达都有不同程度的升高，其中T细胞和CD4+T细胞中上升最为明显(图10、图12、图14、图16)。

进一步的，还检测了TNFR2基因人源化小鼠脾脏、淋巴结中的免疫细胞分群情况，与野生型相比未发现明显差异(图17-20)。

在一个实验中，分别提取野生型和人源化小鼠的RNA，通过相对定量PCR方法，检测人源化改造对TNFR2基因的表达是否有影响。利用培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(来源TIANGEN，货号DP430)参照说明书方法提取RNA，反转录成cDNA后，使用PowerUp

F:5’-GCCTACAAAGAGATGCCAAGGTG-3’(SEQ ID NO：1)，

R:5’-TCTGAAATCCTGGAGCTGGCAC-3’(SEQ ID NO：3)，

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量，计算公式：基因相对表达量＝2

实施例2双重人源化或多重人源化小鼠的制备及应用

利用本方法或制得的TNFR2人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，或选择TNFR2人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到TNFR2人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的TNFR2小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰(例如PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、TIM3、CD27、CD28、CD40、CD47、CD73、SIRPA、OX-40、4-1BB、GITR或TIGIT基因修饰)纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到TNFR2人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。

实施例3人源化细胞进行体外测试

可进一步用抗人TNFR2抗体进行确认改造后的小鼠体内TNFR2信号通路功能是否正常。初步验证表明3种抗体Ab1、Ab2、Ab3均为抗人TNFR2抗体。

取野生型C57BL/6小鼠(WT)和TNFR2基因人源化纯合子小鼠(H/H)的脾脏细胞，分为两组后，分别用mCD3E、mCD28和/或mTNFa刺激，每种来源的细胞再分为5份，随机选取其中3份加入200nM的3种抗体Ab1、Ab2、Ab3，另外2份随机加入抗鼠PD1抗体(mPD-1Ab)(作为阳性对照)或加入等量IgG1(作为同型对照)。其中mPD-1Ab已验证可结合鼠PD-1且具有抑制肿瘤生长的能力。

利用流式细胞检测加入的抗体与细胞上TNFR2或PD-1的结合情况，如图22所示，检测结果表明三种抗人TNFR2抗体均可与TNFR2基因人源化纯合子小鼠细胞结合，不与野生型C57BL/6小鼠细胞结合。在低mCD3E/mCD28刺激条件下，加入mTNFa配体可以明显增强抗体与CD3+T细胞表面的TNFR2的结合，表明mTNFa可触发人源化TNFR2细胞并增加TNFR2在细胞表面的表达。

表3结合试验方案

进一步的，还在体外检测了加入抗体后不同免疫细胞中的NFkB信号通路的情况。发现使用不同的抗人TNFR2抗体刺激后，分离自人源化小鼠的细胞出现不同程度的NFkB信号表达，且T细胞有不同程度的活化表现。总体结果与人PBMC结果一致。

本研究证明人源化小鼠体内TNFR2信号通路功能正常，其表达的人源化TNFR2蛋白可以结合抗人TNFR2抗体和鼠TNFa，并表明本方法制备的小鼠可用于抗人TNFR2阻断型抗体的筛选、药效评价等。

实施例4人源化小鼠模型体内药效验证

取上述TNFR2基因人源化小鼠纯合子(9-10周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×10

表4给药方式和频率

表5中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时、分组后14天时及实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibitionvalue，TGI

表5肿瘤体积、存活情况及体积抑制率

整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时，所有治疗组和对照组在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无明显区别(图23、24)；但从肿瘤体积测量结果上看(图25)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠，与对照组相比肿瘤体积增长呈现不同程度的抑制和/或缩小。表明这3种抗人TNFR2抗体和抗鼠PD1抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有不同的体内抑制肿瘤效果。

具体来说，从肿瘤体积测量结果来看(图25，表5)，实验终点时对照组(G1)平均肿瘤体积为1832±134mm

上述研究结果证明人源化TNFR2动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于TNFR2相关调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人TNFR2信号通路的抗体的有效性及治疗效果等。

实施例5基于CRISPR的制备方法

采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以CRISPR技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得TNFR2基因人源化小鼠。

鉴于本发明的目的之一是将小鼠TNFR2基因的2-6号外显子全部或部分用人TNFR2基因片段原位替换，为此，发明人根据靶位点设计sgRNA并通过UCA实验验证切割效率，选择效率较高的sgRNA进行下一步实验。进一步设计了包含5’同源臂、3’同源臂和人源化基因片段的靶向载体，靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的靶向载体和筛选的sgRNA体外转录产物通过显微注射至C57BL/6小鼠受精卵的细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代阳性鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代阳性鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过再次提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司

<120> TNFR2基因人源化的非人动物的构建方法和应用

<130> 1

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gcctacaaag agatgccaag gtg 23

<210> 2

<211> 474

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus. musculus)

<400> 2

Met Ala Pro Ala Ala Leu Trp Val Ala Leu Val Phe Glu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Trp Ala Thr Gly His Thr Val Pro Ala Gln Val Val Leu Thr Pro Tyr

20 25 30

Lys Pro Glu Pro Gly Tyr Glu Cys Gln Ile Ser Gln Glu Tyr Tyr Asp

35 40 45

Arg Lys Ala Gln Met Cys Cys Ala Lys Cys Pro Pro Gly Gln Tyr Val

50 55 60

Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Ala Asp Cys Glu

65 70 75 80

Ala Ser Met Tyr Thr Gln Val Trp Asn Gln Phe Arg Thr Cys Leu Ser

85 90 95

Cys Ser Ser Ser Cys Thr Thr Asp Gln Val Glu Ile Arg Ala Cys Thr

100 105 110

Lys Gln Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Glu Ala Gly Arg Tyr Cys Ala

115 120 125

Leu Lys Thr His Ser Gly Ser Cys Arg Gln Cys Met Arg Leu Ser Lys

130 135 140

Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Ser Ser Arg Ala Pro Asn Gly Asn

145 150 155 160

Val Leu Cys Lys Ala Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser

165 170 175

Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile Cys Ser Ile Leu Ala Ile

180 185 190

Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Ala Pro Glu Ser Pro Thr

195 200 205

Leu Ser Ala Ile Pro Arg Thr Leu Tyr Val Ser Gln Pro Glu Pro Thr

210 215 220

Arg Ser Gln Pro Leu Asp Gln Glu Pro Gly Pro Ser Gln Thr Pro Ser

225 230 235 240

Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile Ile Glu Gln Ser Thr Lys

245 250 255

Gly Gly Ile Ser Leu Pro Ile Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ser Leu

260 265 270

Gly Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Asn Cys Ile Ile Leu Val Gln Arg

275 280 285

Lys Lys Lys Pro Ser Cys Leu Gln Arg Asp Ala Lys Val Pro His Val

290 295 300

Pro Asp Glu Lys Ser Gln Asp Ala Val Gly Leu Glu Gln Gln His Leu

305 310 315 320

Leu Thr Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala

325 330 335

Ser Ala Gly Asp Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly His Pro Gln Ala Arg

340 345 350

Val Met Ala Glu Ala Gln Gly Phe Gln Glu Ala Arg Ala Ser Ser Arg

355 360 365

Ile Ser Asp Ser Ser His Gly Ser His Gly Thr His Val Asn Val Thr

370 375 380

Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser

385 390 395 400

Ser Gln Ala Ser Ala Thr Val Gly Asp Pro Asp Ala Lys Pro Ser Ala

405 410 415

Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Gln Glu Glu Cys Pro Ser

420 425 430

Gln Ser Pro Cys Glu Thr Thr Glu Thr Leu Gln Ser His Glu Lys Pro

435 440 445

Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Met Gly Met Lys Pro Ser Gln Ala Gly

450 455 460

Trp Phe Asp Gln Ile Ala Val Lys Val Ala

465 470

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tctgaaatcc tggagctggc ac 22

<210> 4

<211> 461

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr

20 25 30

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

35 40 45

Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys

50 55 60

Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys

85 90 95

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

100 105 110

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

115 120 125

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145 150 155 160

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

165 170 175

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

180 185 190

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser

195 200 205

Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser

210 215 220

Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser

225 230 235 240

Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly

245 250 255

Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly

260 265 270

Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys

275 280 285

Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro

290 295 300

Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu

305 310 315 320

Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser

325 330 335

Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly

340 345 350

Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser

355 360 365

Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile

370 375 380

Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln

385 390 395 400

Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro

405 410 415

Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser

420 425 430

Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro

435 440 445

Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser

450 455 460

<210> 5

<211> 4468

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

agctcagtta ccaccaccca agggatatac ctaccccagg gctggcaggg caagtgttcc 60

catgagatgc acacaccgac agcccgtgtg tggagccgga ggctgctgtt tgaggaagta 120

gaggagggtg aagagaaggt tcttagttaa tgagacaaat agtttcccca ggaaggctag 180

tctgggagtt ttattgggga cactcaggcc ttctgtgtca gttagcattc tttggagtga 240

tggatacaaa tgagctatga cactgatttc tggggtccaa ggctccccta attctgctgt 300

gtaccttcct cactcctttc tcccaactta ccttactttc tccatgggat aggatactca 360

gaccacattg agtagagcag aggagtctct aatccccagg aagagttctt tcttatttta 420

tctttcctct ttatgagcag tgtggctccc cagcccagag actctccccc cttagatgtg 480

aaagggtcag ccagccattg atgtaccctt tgatgtgttt gttacattag cagttctcat 540

ctgaacacaa cacactgggt ccgagcggtt ccacgtgtga gatgtttatt gggagggggg 600

cgcaggggag aaggtgacag cagaaagaga aggggaaaaa gagagagagg gcctccttag 660

aagtgggaac aaaacaccct tggaaggagt tacagagaca aagtttggag ctgagattaa 720

agggtggacc atgtagagac tgccttatcc agggatccac cccataatca gcatccaaac 780

gctgacacca ttgcatacac tagcaagatt ttatcgaaag gacccagatg tagctgtctc 840

ttgtgagact atgccggggc ctagcaaaca cagaagtgga tgcccacagt cagctaatgg 900

atggatcaca gggctcccaa tggaggagct agagaaagta cccaaggagc taaagggatc 960

tgcaacccta taggtggatc aacattatga actaaccagt accccggagc tcttgactct 1020

agctgcacat gtatcaaaag atggcctagt cggccatcac tggaaagaga ggcccattgg 1080

acacacaaac tttatatgcc ccagaacagg ggaatgccag ggccaaaaag ggggagtggg 1140

caggtagggg agtgggggtg ggtgggtatg ggggactttt ggtatagcat tggaaatgta 1200

aatgaactaa atacctaata aaaaatggaa aaaaaaaaag gaaaaaaaaa gagatattaa 1260

ggaaaagtaa aaaaaaaaaa agagagagag agagggaggg ctgttcccct tatttatatg 1320

aaaaaaatga cgtaacacag gtaaaggtgg gaggtgagcc aagtggattc tgggaatatg 1380

ctgcaggtcg cgctgtcacc tatgtgatgt cataggtttg ggaggtcctg atgcaaagac 1440

ccttgacctt gagaacagtc agtgaggtcc cagacagtgt ggaacaccct tatttgtgtg 1500

ctcagactca actggttgtt ttgtcaagaa atggaacggg gaagtgccag gatattgtgt 1560

gtaggcatgt gcgcatgcgc ttggatgtgt gtgcagctgt ccagagggag ctgcagtggc 1620

tttttcagac tgggtactca gcatggttct gcgacttccc tcacccagct gtctgcatga 1680

ccttcctgaa aaggattgcc ttgatggagg aactcagaga taggccaggg cagcagatgc 1740

atctatgttc aagcttcttg gccctggtgc ccagggggag gctctcgcct caaggaaatg 1800

acattagaat tattacctta ctcagggtag caactattga ttactctttt ctgtctggct 1860

ctggataggg tagctcgcac tgcagcctcc aatgggccct catctggggt tactgggtga 1920

gcatgaagac aaggcagggg gctggctgta ttgggttgct tatccagggc acggtgtgca 1980

cagtcgcctg aagagggaag cactctgtgt ggacttttgg ccaaaggcgc aagaggcagc 2040

tagggtactg tggcaggtcc agaagagcca aagactgtcc acagcataga accccagtcc 2100

cttgagtcat ggcttctggt ggctttcagc tgttatcact gagtggctga gcaaagagaa 2160

acatgatagg ctcagaggtc actcagtgca cagcactagg caaggtaggg tgatgctctc 2220

cagacacagc tggggatggg aaggggaaag acagaaagca gagccactgc ccacagatca 2280

tgggagtttg tgcagtctat acagaccaaa tgagcctaat agtaaggtcg gcatcttctc 2340

tgattggctt gtttgcagtg gcttttcaga gactgatcca tgcctttgct gtgctaattg 2400

ttggatattt tatgtatctc tcttgctccc atagaattga gtcaggaacc gatgtccaga 2460

gagataggga cacttgattg actatgacca tacagcttct ggatggaaga ataagaaaag 2520

aagaccacat ctctctaact ctccaccttt atctgaggag tcaggggatt catttgggtt 2580

actggtttaa taaacattta ttaagctcct gctgaccata tgacggcagc tgctggtaca 2640

atcaagagtg cggagcagcc ttcctcttta acctagaacc accccttggt catttccagg 2700

tgacatcagc agaggctgca agggtgttga gtgtgtgttc acaccctctt tgctcttgta 2760

gatccactcc catgtttgct catgagttca catttgtgca gaaatggcta attcatgctt 2820

gtccctaaag tttccaattg ctgttccacc ttctggaaga aaggctgggg cttaggcagg 2880

tctctgaggt actgggatag acccagtggt gacagttgct gctgctgtac acttctgaga 2940

actgaggacc tcttggagat ctgagggagg gctctgtgtt tctcacagtt ggttctgtgc 3000

catgttgggt gtttttttgt tttttgtttt ttctcctccc catttgtctc cctttcataa 3060

ttatttattt aattaaaaaa tgtgagtact cctgagtata tgtatgtgaa ccacacacat 3120

tcaggagtat gcagaactta gaagggagcg tcaggttacc tggaactgga gtgacagaca 3180

gttgtgagct gccatgttgg tgctgggaac tgatcccaag ttgtctccaa gaatagtaag 3240

tgcccctaac cactgcgcta tctctggagc tcctcctccc catcctcccc atcgctccct 3300

gctttcctgg tctctccctg gaagtgctta gcccagtcat tgaaatcatg gcctagagag 3360

acagacagga cccaggctca aatctctgtc actgccttag gtgggtaacc tgtgctcgtt 3420

atgcctgttt cctttctata caatggtcgg agtccaacat ggctggttgt tagagaactg 3480

aatgcaataa tacatccatc tcaggtccag gctctggaag cacagcctga ggcatggctt 3540

cttgtaacag gagaaggctc tcaggcaaga gggtggggtg gcaggatgtg gcagcagggt 3600

cacatgtttt ccagccaaaa cctatgagtg ttggtcttgg gttgaggcca aggtactgcc 3660

tttgagttgg agacttgtcg gccagtgctg aggctattct cctggcagtt ggagtctgag 3720

catggctagg agcccccact ggtccaaacc ttctaagccc ataggtgtaa ggcagcactg 3780

atgtgaggag gtgcacaggt ttgttttcat tctgtattaa cttcctgagg cagctctgcc 3840

atggcctgtg tcagaagctt gggtctagag gtggcgcagc cattatctgt gtcataggtg 3900

gcagcatatg gacacatgta tgtacacctg tgtgcatatg catggatgtg agtgcaagga 3960

cacacggtgc caattcagaa caatgacatg aaggtcagaa ggggccatgt ctatattcag 4020

agagaaccca gaggaggaag agcctacatt aggcccagga gagtagaggg tacttctggg 4080

agaaggaaga cctcagccac aaggacagag ggacagatgg acagacatcc taaaaagaga 4140

agctttgtgt ggaggtcctt gtcacagtga gtcaagccac tgtcttaaaa aaactacatc 4200

ttctcagagc cttgctgggt ctcacccagc aggcaggagg gaagccctaa agtaacccac 4260

ttcctggccc agcaaactgc agacacaagc gtgccacgct gaagaggaag gccaagaagg 4320

gaaaaagcct gggctctact ctctcaagcc ttcctcgtcc tccaacgcaa aaacccatcc 4380

atgaggcctg gtgacaggta tgctggagcc cagagtcata ctgatggctg cctcccttgt 4440

tcccttccag gttgtcttga caccctac 4468

<210> 6

<211> 3487

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

agatgcaagt gtagaagagt tgagtctcca aagatgtgat attgccatag ggaatccctg 60

ggtggcatga atgtgaacat aggttctggt tgctagttat gatgaacccg tttgtctcac 120

agactatgga ctgctggtgt ctctggcttc cctctggggt taggatggta ccaagcccaa 180

ggccctacac tgtagccttc tgactgcatg tggtttgcag atgtgatctt tggtttgacc 240

ctgaatttga gggcctaagg ctggacttga tctcagcatc agcaccagcc accctggaac 300

ctttgtttct gagtaccctg ccgttttcct aggtctgatt gttggagtga catcactggg 360

tctgctgatg ttaggactgg tgaactgcat catcctggtg cagaggaaaa gtaaggttct 420

gctctcgtcc tgtttcccgc cccacgtccc taccctaaca ctttctcgga gccttgggtg 480

gcaggcctcg ttcagagctc tgcactatca tagactcggg tggatctgga gactgtagcc 540

tcttgctctc caggaactta gagcctggtg tagaaggtac atactctaac ctggctacca 600

gaaggtagtg tcaaggctat tccaggggat tgaagttcag gatttttata caggaagcct 660

ggagtctctc ggattctgtg agctggcctg ggtctcagtg ggtggagtgt gttgaggcag 720

ggctacaaca caggctgtac tggaggatgg ctggggcaaa ggggtagtgg ctgaaagtag 780

catgggctca tccgtgaaca tgacaggcag ctactccctg ggctgggtcc actctcctgg 840

ctctacccta gccatgctgt gcccattaag acagctgttc tgaagaagtc ctgcctctga 900

cttgttcccc tctcttcatt gtagagaagc cctcctgcct acaaagagat gccaaggtgg 960

tgagtatccc tctgcggtcc tcctccccct tctctcctcc agctctccct cttcctcctc 1020

ctctttctcc tcctcttcca gttcctttac tagggcatca taagcaacat catataagca 1080

ggatctaatg tatatggtgg tgcatacctg ccatcccaat agttaggggc aggtagaggc 1140

tggagggtca gagtgtaaat actccctcag agccagctga tgtttagttc cattacagtt 1200

gggaagaaac cggcaaactc tcccctagct gggcatagcc aggctctttc cctaggctat 1260

gtccaactcc tcactggtcc tatgcataag gcaccttggc tcctcattat atagatgagg 1320

aaatgtaggc ttaacagata cagtcaccct tgaaaggttg tgttgtgtcc tggtggtcaa 1380

accctctgcg catgtgcatc cggcagctac acccaaagct gtctcaggct ggcctctcct 1440

agcagggact gctcgccaag actggtcacc aggatttgga gaacctagat gccccccttt 1500

gtccagccct gtgccctgtc agctacctgc cccagggccc tactctggag cccagtggac 1560

ggtgtcctca tgtgctagag tgaggaggct gtcaggcagg agcagcagtg actcagcttc 1620

tactctgagg actggggaag atgaggttat ctggaaaaac agcacgtgaa ttcatctaca 1680

cctcccccag tcatgcgcat ggttcatgtt tagtcgccgg cagttactgg tggtggtgga 1740

ggaaggacgt gccagcactg tctgagggct tattcttcca gcttgactgt gacacaggct 1800

atgacacagg ctgtggcaca ggctgtgaca gaggttattg cccccaacgt tagacagagt 1860

ctgggattat atggctcaga cactcttaag taattgtcct gtgtcctagc tgtgtcctag 1920

acacagctaa tgggtatggc ctggaacaca aacttagcat acaattacta cccagcatac 1980

aattactgtg ccactcttag gcatgcccac atgagcctgc acatataaat acccttagct 2040

cagaggccga cagaagccag ccatgcttct gccagtccca gttccatata acaggaccag 2100

acccagaacc ataggaggta tcaggcaagc taagattttt tggtgttcat tcagtggggt 2160

cctagccaga gtcacatgac tctgatagtg tctgtacttg aacactgtag cttgtggctt 2220

tgaagaagct agctgtgacc tttggggagg aggggaagat cgggttctgt ctggctctag 2280

ccacaagcag aaagggggag gcccagacag aaaagctcct tctctggggc tggtgtggtg 2340

tgacatttat gagtgcctct gtagagttac agggtaaggc cagggccaag gtcagaccgt 2400

gagttcagga tgtttttcct ctcttccatt ttggggtacc tagctgggag gaccccaggg 2460

gagtcaggag gatgcagtgg gcatgctccc acatcctaga ctgggtttgc ttactgtggc 2520

catcagccag ctctgtaact ctgagctctg gattcatctt ctgtgggctt ttgtggcctc 2580

atgaagacag cttgtataag atccttccag tccagagtca gaagctgtgg actgtgcagg 2640

aaacaaggcc tcaaggccat gtatcatgac atacctgggc atctaagaag acatagcaac 2700

agtgggcagg acctggagat ggaagtttta gtgactctct agagagcacc agccacagga 2760

aggatagccc aactattgtt tcagcttaga ctacacctgg cattgtgcct ccctggaaaa 2820

gtgtggccac ttttccagct gctgtcaaca gacaatggcc ttggaataga tgtccttagc 2880

ataagttgcc atgaacaggg aatttgtctt aagcctcaag agctgaaccc cagacaccca 2940

gaagaggcat ggtgagtttt tagctcgact gcactgtatc caaaccatgg cctcaggcag 3000

aaagttccgt ttccatattt acagagctag gatggcacta ggctatattg agtgtctaga 3060

agagctgaga ccaatgtgac tcaggcacag gatttggcac taggtgctca tgtcacatac 3120

agagtaagaa gccacaggga agccacacga catcatctgg gtgaactgtg ggaacgggca 3180

gctgagaaga ccagtgagga accctgtgag tggccctgtg agtggccctg aggaaaggac 3240

cccatgggcc agggtgattc attgagcaga aggaatgaag agtaaaggtg ttaagcttca 3300

agcaccaagg ctggcctctg ggacagctac tctgatctgc cacccaccat caggaagtct 3360

gtgctttgca aaacattgat gacagctcag gtgcatcaaa cttgtttatt tacgaacact 3420

aaaacttgac ctttagattt gaggcatttt gtattttaga cacggactta tgtagcctgt 3480

attgacc 3487

<210> 7

<211> 4275

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gccccggagc ccgggagcac atgccggctc agagaatact atgaccagac agctcagatg 60

tgctgcagca aatgctcgcc gggtgagggc agccacgggg gcactcgggg cccatgccct 120

ggaggagcgt gtgtgtacag gggctggggc gcaagagcat agcccttgat tcttactgaa 180

ctcctagttc tatgcactgg cccatgctcc ctgctgcttc tgggcctgtg aacatgctgt 240

tccctcttcc tggcacactt cccaactccc tttccctgat taactccaac ttgcccttta 300

gacctcagct gaagatgtcc cctcttccag gaaggctgcc tgccccatac tgcccagccg 360

gtggaggagg gggaggagga gcctaaatta gctcctgggg gagtcaggga gggctgcctg 420

gaggaggcag cactcagctt gaaagacaag tgctgcctcc tttgagctct cactggcctc 480

tgatgttccc atggaagctc tttccttgct gtgggattat agcccggtcc tgcttcctgt 540

tgcctccact gtgtgctcct ctagggcaga gattgtggct tgttttctgc tgaatcccca 600

gcacgtggcg caatgccatg taggtgctca gtgcatattt gactgactct gtgaatgctt 660

acccatttca cagatggtag acctgaggcc cagccacagt tggtggagct aggtagcctg 720

actcctggtg ccctccatct attcatttgt gtctgtattc attcatgtca tgattataag 780

gtatctgctg tgtgttctaa gtgctgggaa tacacagaga gcagggcaga caaaaccctt 840

gccctcgtgg agtctgcatt ttaacggtgg atgcagacag atacattagg agatgtgtgg 900

tcctgtctat ctgtaagtgc tgtagaaaga caaggtcagg taaggcgggg gagacagaac 960

gggacatact gttttacaca gggtggtctg ggaaggtctc tctgaggagg tgacatttgg 1020

gcagagccct gcaggaggtg agggagcagg tcatgcatgt atacagggaa cagtgtgcca 1080

ggaggaagca acagcatgtg cgaaggcctt gaagtcggag cctgtttggt gagttggagg 1140

aacagcaggg ccagcatgtg tggcccagga tgagcgaagg cgagtacggt aggggaggag 1200

gaggaaggag tgagcaggga ccatggtaag gagtttagat tttattctgt ctgggagcca 1260

atggagggct ttgagccgtt accttgagat gtaggtgggc atatgagtac ctgtcaccgt 1320

ccctagccat tttaagacat cctagggaaa gtgactctct tctttctttt attaactgga 1380

agggtctctt taagaagtta ctagagaggc tgaggtgggc ggaccaccgg aggccaggag 1440

tttgagacca gcctggccaa catggtggaa cccgtctcta ctaagaatac aaaaaaatag 1500

ctgggcataa tggcaggcac ctgtaatccc agctacttgg gaggctgagg caggagaatt 1560

gcttgagcct gagaggcaga ggttgcagtg agccgagatt gtgccactgc actctagcct 1620

gggccacaga gtgagattct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagca gctactgagt 1680

caactttttt ttaaggtttc cgttggtgtt ctctgtccct ggaatgcctg ctttccaggc 1740

ccatgccctt gtccttgata ggataccagg gactacattc ttactacctg ttccccctat 1800

cattcatgcc cctagctgga gaatattagc catctatcaa gaaggaagaa actggcaagc 1860

tagttcttac taaagtgtga ttgactgata atagggctcc agtggtggag gttcaagcat 1920

ctggaaagag cagagaggaa tctatttttg agcagaaggg gttcagaaat gacgtgatag 1980

ctggtacaat actagatggg agatgattct gaggaattgg aactccacag aatagccttc 2040

ccagctgggc tttagaactc tggactttgt ggggacagtg gatgagccca gggtcctggc 2100

agaaggctcg cccagctgag acctctggcc cttgtttcct caggccaaca tgcaaaagtc 2160

ttctgtacca agacctcgga caccgtgtgt gactcctgtg aggacagcac atacacccag 2220

ctctggaact gggttcccga gtgcttgagc tgtggctccc gctgtagctc tggtgagtag 2280

gttcagagaa aaagggggcc cttacacccc tgcctccaac ttcccccggc aactccagcc 2340

tctttggctt ccagctgtct ggagttaccc caggctggtt gttggaagtg gcacaggtgc 2400

agctgtttac ccctaccact ggcattttcc tcctctgtct caccaaagcc tcttcacagc 2460

cccacggggc aggcggtggg agaactgtgc ccacgtgagg gttgaggagg tggtgcgtgg 2520

gagagtggtg cgcatgctcg tgctgcgagg agcaggactg cggggaggag cgaaactgct 2580

gggaagagcg ggactgcggg gaagagcggg acttcgggga ggagcggcac tgcggggagg 2640

agcaggactg cagggaggag cgggactgtg gggaggagcg ggacttcggg gaggagcggg 2700

actgcggggg acgagcgcga ctgcggggga cgagcaggac tgcggagagt agcgggactg 2760

cggagagtag cgggactgcg gagagtagca ggactgccgg tcctgcccct ggactctggc 2820

cggtgttgtg tgtgccccat gctgaggcgg tccgccagcc tcctggagat ccgctgtctg 2880

agagtgctgg gctgtctggg agggcagcgt gggtgtggcg gaggcaggcg tgaccgtttg 2940

ccgccctctc gctgctctag accaggtgga aactcaagcc tgcactcggg aacagaaccg 3000

catctgcacc tgcaggcccg gctggtactg cgcgctgagc aagcaggagg ggtgccggct 3060

gtgcgcgccg ctgcgcaagt gccgcccggg cttcggcgtg gccagaccag gtacggggtg 3120

gggctcaggt ccttggggac gcccatgggc ctctcctttg tagacatcct tgcagtgtca 3180

cgggcatcaa cccattaatt agtccagcag ggagcactgt tagtggtggc caggtgcctg 3240

ctacccatcc gtctgtccac ctgtccaccg ttcattcttc ctgccagcac tcccgattag 3300

gcacctctta tgtactggaa ccaggagacc cagagatgga tcagaccaag ccctaagcta 3360

ggaaagttat gtgatgctgc aagatgaact cacataactc tacagcccaa tcccgtgcat 3420

gtgtgtacag gaatctgtgt gtgtgcatgt gtgtacaggc atctgtgtgt gtgtgtgtgt 3480

gtgtgtgtgt gtgtaagggg tggaggtgca gacagagctc cttgggcccc tcagacctct 3540

cctagggctc tagtgccaag gcccagctgt cccgcagagt gtctgagtgg ttgacaagtt 3600

cggattgttc cctgaaggaa ctgaaacatc agacgtggtg tgcaagccct gtgccccggg 3660

gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg ccccaccaga tgtgagtagc 3720

tgagtccttt ggttctggag gagcagggag gggctgtccc tgggtgactg tgggtccagg 3780

acacagagca gctcaccaac caccattgtc cagactgctt tatctgaggg tggctcccag 3840

gataaatggc atggtgggca ggaccttgcc ctggaaggca ggactgggtg ggtgcatggg 3900

gaggtggggg agggctagga gggggtggtc ctcagagagg gcacacatcg tcactctcct 3960

atcctgcctg ctggggcccg tgaatgagcc cagccacccc agccactctg tcccctgctg 4020

cctcctgacc aagcctcctc ctcctccagc tgtaacgtgg tggccatccc tgggaatgca 4080

agcatggatg cagtctgcac gtccacgtcc cccacccgga gtatggcccc aggggcagta 4140

cacttacccc agccagtgtc cacacgatcc caacacacgc agccaactcc agaacccagc 4200

actgctccaa gcacctcctt cctgctccca atgggcccca gccccccagc tgaagggagc 4260

actggcgact tcgct 4275

<210> 8

<211> 4910

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

agtcaccagc tagagcgcag ctgaggcact agagctccag gcacaagggc gggagccacc 60

gctgccccta tggcgcccgc cgccctctgg gtcgcgctgg tcttcgaact gcagctgtgg 120

gccaccgggc acacagtgcc cgcccaggtt gtcttgacac cctacgcccc ggagcccggg 180

agcacatgcc ggctcagaga atactatgac cagacagctc agatgtgctg cagcaaatgc 240

tcgccgggcc aacatgcaaa agtcttctgt accaagacct cggacaccgt gtgtgactcc 300

tgtgaggaca gcacatacac ccagctctgg aactgggttc ccgagtgctt gagctgtggc 360

tcccgctgta gctctgacca ggtggaaact caagcctgca ctcgggaaca gaaccgcatc 420

tgcacctgca ggcccggctg gtactgcgcg ctgagcaagc aggaggggtg ccggctgtgc 480

gcgccgctgc gcaagtgccg cccgggcttc ggcgtggcca gaccaggaac tgaaacatca 540

gacgtggtgt gcaagccctg tgccccgggg acgttctcca acacgacttc atccacggat 600

atttgcaggc cccaccagat ctgtaacgtg gtggccatcc ctgggaatgc aagcatggat 660

gcagtctgca cgtccacgtc ccccacccgg agtatggccc caggggcagt acacttaccc 720

cagccagtgt ccacacgatc ccaacacacg cagccaactc cagaacccag cactgctcca 780

agcacctcct tcctgctccc aatgggcccc agccccccag ctgaagggag cactggcgac 840

ttcgctcttc caattggtct gattgttgga gtgacatcac tgggtctgct gatgttagga 900

ctggtgaact gcatcatcct ggtgcagagg aaaaagaagc cctcctgcct acaaagagat 960

gccaaggtgc ctcatgtgcc tgatgagaaa tcccaggatg cagtaggcct tgagcagcag 1020

cacctgttga ccacagcacc cagttccagc agcagctccc tagagagctc agccagcgct 1080

ggggaccgaa gggcgccccc tgggggccat ccccaagcaa gagtcatggc ggaggcccaa 1140

gggtttcagg aggcccgtgc cagctccagg atttcagatt cttcccacgg aagccacggg 1200

acccacgtca acgtcacctg catcgtgaac gtctgtagca gctctgacca cagttctcag 1260

tgctcttccc aagccagcgc cacagtggga gacccagatg ccaagccctc agcgtcccca 1320

aaggatgagc aggtcccctt ctctcaggag gagtgtccgt ctcagtcccc gtgtgagact 1380

acagagacac tgcagagcca tgagaagccc ttgccccttg gtgtgccgga tatgggcatg 1440

aagcccagcc aagctggctg gtttgatcag attgcagtca aagtggcctg acccctgaca 1500

ggggtaacac cctgcaaagg gacccccgag accctgaacc catggaactt catgactttt 1560

gctggatcca tttcccttag tggcttccag agccccagtt gcaggtcaag tgagggctga 1620

gacagctaga gtggtcaaaa actgccatgg tgttttatgg gggcagtccc aggaagttgt 1680

tgctcttcca tgacccctct ggatctcctg ggctcttgcc tgattcttgc ttctgagagg 1740

ccccagtatt ttttccttct aaggagctaa catcctcttc catgaatagc acagctcttc 1800

agcctgaatg ctgacactgc agggcggttc cagcaagtag gagcaagtgg tggcctggta 1860

gggcacagag gcccttcagg ttagtgctaa actcttagga agtaccctct ccaagcccac 1920

cgaaattctt ttgatgcaag aatcagaggc cccatcaggc agagttgctc tgttatagga 1980

tggtagggct gtaactcagt ggtccagtgt gcttttagca tgccctgggt ttgatcctca 2040

gcaacacatg caaaacgtaa gtagacagca gacagcagac agcacagcca gccccctgtg 2100

tggtttgcag cctctgcctt tgacttttac tctggtgggc acacagaggg ctggagctcc 2160

tcctcctgac cttctaatga gcccttccaa ggccacgcct tccttcaggg aatctcaggg 2220

actgtagagt tcccaggccc ctgcagccac ctgtctcttc ctacctcagc ctggagcact 2280

ccctctaact ccccaacggc ttggtactgt acttgctgtg accccaagtg catgtccggg 2340

ttaggcactg tgagttggaa cagctgatga catcggttga aaggcccacc cggaaacagc 2400

tgaagccagc tcttttgcca aaggattcat gccggttttc taatcaacct gctcccctag 2460

catgcctgga aggaaagggt tcaggagact cctcaagaag caagttcagt ctcaggtgct 2520

tggatgccat gctcaccgat tccactggat atgaacttgg cagaggagcc tagttgttgc 2580

catggagact taaagagctc agcactctgg aatcaagata ctggacactt ggggccgact 2640

tgttaaggct ctgcagcatc agactgtaga ggggaaggaa cacgtctgcc ccctggtggc 2700

ccgtcctggg atgacctcgg gcctcctagg caacaaaaga atgaattgga aaggactgtt 2760

cctgggtgtg gcctcagctc ctgtgcttgt gtggatccct aaagggtgtg ctaaggagca 2820

attgcactgt gtgctggaca gaattcctgc ttataaatgc tttttgttgt tgttttgtac 2880

actgagccct ggctgagcca ccccacccca cctcccatcc cacctttaca gccactcttg 2940

cagagaacct ggctgtctcc cacttgtagc ctgtggatgc tgaggaaaca cccagccaag 3000

tagactccag gcttgcccct atctcctgct ctgagtctgg cctcctcatt gtgttgtggg 3060

aaggagacgg gttctgtcat ctcggaagcc cacaccgtgg atgtgaacaa tggctgtact 3120

agcttagacc agcttagggc tctgcaatca gaggaggggg agcagggaac aatttgagtg 3180

ctgacctata acacattcct aaaggatggg cagtccagaa tctccctcct tcagtgtgtg 3240

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtccatg tttgcatgta tgtgtgtgcc 3300

agtgtgtgga ggccagaggt tggctttggg tgtgtttgat cactctcagt tactgaggca 3360

gggctctcat ctgtacccag agcttgcaca ttttctagtc taacttgctt cagggatctc 3420

tgtctgccta tggagtgctc aggttacagg caggctgcca tacctgcccg acatttacat 3480

gaatactaga gatctgaatt ctggtcctca cacttgtata cctgcatttt atccactaag 3540

acatctctcc aagggctccc ccttcctatt taataagtta gttttgaact ggcaagatgg 3600

ctcagtgggt aaggcagttt gcggacaaac ctgatgacct gagttggatc cctgaccata 3660

aggtagaaga gacctgattc ctgcaagttg tcctctgacc accaccccat acatgcttct 3720

gcatatgtgc acacatcaca ttcttgcaca cacactcaca taccataaat gtaataaatt 3780

tttttaaata aattgatttt atcttttaat cattattttt gcttatctgt ttgttcatac 3840

atggagtttt gctgtatacc cagtctggct gcatcctcca ggcaccttga acttggatat 3900

tctcctgcct cagtttcgag agtgctgagt tataggcatg tgcaaccgtg tcaggaccct 3960

tggcgttaca ttatgttttc gaatcttatt tttccatcta agactgacaa ccaccttgcc 4020

aaaggatgac cttgactttt gtatcctctt gcctctactt cccaagtatt gggatgacaa 4080

gtctgtccat cctatgattt gtgtggtgct ggggcttgaa cccaggggcc tcgtgaatgc 4140

taggcaaacg caatcagctg cccaaccccg aacttcactt ttcacctgtg atttcttaac 4200

atggttcctg agcagacagc atgatcctgt tgccttgagg agctctgctc gttgctttga 4260

caatgctcta tttactaaag aatacttata gagttcaaga ctccaaagca gcagttccca 4320

acctgtgggt atgacctctt gggtatccca tatcagatat ttacattaaa cttataacag 4380

aagcaaaatt acagttatgg ggtagcaaca aaataatttt tttttgaggc agggtttatc 4440

tgtgtagctc actttgtaca gactaggctg gccttgaact taaagatctg cctgcctctg 4500

ccttctgaat gctgggatta aatgtgtgtg ccaacatgcc cagtgcagtg aaataatttt 4560

attgttgggt caccaaaaca tgagaaagag tattaaaagg tcatagcgtt aggaaggttg 4620

agaaccactg ccccaaaaga tagtagaaat aggtaatagc attttaaaaa aagattaatt 4680

tctttttccg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 4740

tgtgaagggt gctgaattcc ctaaatctgg gattacagac aattgtgcca aatgggtatt 4800

gggaaccaaa gttgggtttt ctgaaagagc agcaagtgcc cttaactgct gagccctctc 4860

tctagctata ataaactttt ttttaaaaaa attaaaaaaa tttagcactc 4910

<210> 9

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Met Ala Pro Ala Ala Leu Trp Val Ala Leu Val Phe Glu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Trp Ala Thr Gly His Thr Val Pro Ala Gln Val Val Leu Thr Pro Tyr

20 25 30

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

35 40 45

Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys

50 55 60

Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys

85 90 95

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

100 105 110

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

115 120 125

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145 150 155 160

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

165 170 175

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

180 185 190

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser

195 200 205

Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser

210 215 220

Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser

225 230 235 240

Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly

245 250 255

Asp Phe Ala Leu Pro Ile Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ser Leu Gly

260 265 270

Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Asn Cys Ile Ile Leu Val Gln Arg Lys

275 280 285

Lys Lys Pro Ser Cys Leu Gln Arg Asp Ala Lys Val Pro His Val Pro

290 295 300

Asp Glu Lys Ser Gln Asp Ala Val Gly Leu Glu Gln Gln His Leu Leu

305 310 315 320

Thr Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser

325 330 335

Ala Gly Asp Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly His Pro Gln Ala Arg Val

340 345 350

Met Ala Glu Ala Gln Gly Phe Gln Glu Ala Arg Ala Ser Ser Arg Ile

355 360 365

Ser Asp Ser Ser His Gly Ser His Gly Thr His Val Asn Val Thr Cys

370 375 380

Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser

385 390 395 400

Gln Ala Ser Ala Thr Val Gly Asp Pro Asp Ala Lys Pro Ser Ala Ser

405 410 415

Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Gln Glu Glu Cys Pro Ser Gln

420 425 430

Ser Pro Cys Glu Thr Thr Glu Thr Leu Gln Ser His Glu Lys Pro Leu

435 440 445

Pro Leu Gly Val Pro Asp Met Gly Met Lys Pro Ser Gln Ala Gly Trp

450 455 460

Phe Asp Gln Ile Ala Val Lys Val Ala

465 470

<210> 10

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

tccctttggg cagaactggg gcctggtctc tgtcttttag aacggaattc cgaagttcct 60

attctctaga 70

<210> 11

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

aggaacttca tcagtcaggt acataatggt ggatcccata tgagatgcaa gtgtagaaga 60

gttgagtctc 70

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

ctcgactgtg ccttctagtt gccag 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

cctaacctct cttggtgctg agaac 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gatcagtgag acagtccaac ttggc 25

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

gcatgggcca gtgcatagaa ctag 24

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

tgatggtggg atgagtctga agaag 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

gaatgcctca ccctctctgc tatta 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

acctcgagtc agacttctgt aggta 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

ctagggatat aagcagaacg tggct 25

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

ggatcggcca ttgaacaaga tgg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

cagaagaact cgtcaagaag gcg 23

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

tatgctggag cccagagtca tactg 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

ggacatcatt gcagtattga ggagg 25

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

gcatgggcca gtgcatagaa ctag 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

tacttttaat gggagctgag gctgt 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

atagtctgtg agacaaacgg gttca 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 29

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ggccccagcc ccccagctga agggagcact ggcgacttcg ctcttccaat tggtaagtcc 60

tcagtctcaa gagtgacc 78