一种低温菌IL-2及其应用

技术领域

本发明是关于低温菌及其应用，具体地说，是关于冬季北方污水处理中处理废水中含氮化合物的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2的其相关应用。

背景技术

随着国家工业化的发展与人民生活水平的提高，用水量的日益提升与污染物的排放使得水资源污染问题亦变得越来越严重。在水资源污染中，氮源污染问题是目前急需解决的重点问题。其中，生物脱氮是一种高效、经济、环保的脱氮方法，在水体处理过程中经常利用反硝化细菌进行硝酸盐的脱除。但是反硝化细菌活性受环境影响较大。如碳源、硝酸盐浓度、pH和温度等。有研究表明，低温能够抑制酶的活性，减缓微生物的生长，导致反硝化作用明显减弱。反硝化细菌生长的最佳温度为25～35℃，但是在冬季，我国北方气温通常低于10℃，低温成为冬季微生物反硝化脱氮的限制性因素，进而导致冬季排水不达标等问题。此外，在低温条件下硝化菌群和反硝化菌群增值速度慢，要靠延长水力停留时间来提高氮去除率。低温好氧反硝化既可以适应恶劣的低温环境，又可以在不增加水力停留时间的条件下提高氮去除率。传统的观点认为，反硝化只能在厌氧条件下进行。近年来，关于有氧条件下微生物进行反硝化作用的研究被报道。因此，筛选低温好氧反硝化菌株并应用于冬季污水厂污水处理构筑物对于解决冬季污水厂生物脱氮效果具有十分重要的意义。

发明内容

为解决上述的问题，本发明提出一种罗氏假单胞菌IL-2菌制剂，罗氏假单胞菌，用于降解冬天北方污水处理厂出水氮化合物，优选用于降解市政污水、印染废水、制药废水、养殖废水、食品废水、石化废水、景观水中的氮化合物。本发明还提该菌制剂应用及筛选方法。本发明提供一种如下的技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2，分类命名：罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)。

本发明的第二目的是提供上述的罗氏假单胞菌IL-2的应用，所述的罗氏假单胞菌IL-2用于降解冬天北方污水处理厂出水氮化合物，优选用于市政污水、印染废水、制药废水、养殖废水、食品废水、石化废水、景观水中的氮化合物。

本发明提供的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2可以以氮化合物作为唯一氮源进行生长繁殖。

优选的，所述的氮化合物为硝态氮以及亚硝态氮。

优选的，应用罗氏假单胞菌IL-2降解氮化合物可以是在好氧环境下进行，也可以在兼氧条件下降解硝态氮化合物。

一种菌制剂，所述的菌制剂采用上述的罗氏假单胞菌IL-2制备而成，该菌制剂也用于降解氮化合物，同时所述的菌制剂还包括有营养培养基。营养培养基选自牛肉膏蛋白胨培养基、LB营养培养基、以及添加有碳源的无机盐培养基中的任意一种，其中，碳源优选为乙酸钠。

牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量为：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0-8.0，优选pH＝7.2-7.6。

LB营养培养基的成分及含量为：酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、蛋白胨10.0g/L，pH＝7.2-7.6。

无机盐培养基的成分及含量为：乙酸钠2g/L、硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、七水合硫酸亚铁0.05g/L、氯化钙1g/L、七水合硫酸镁1.0g/L，pH＝7.2-7.6。

本发明提供了所述的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2或菌制剂在降解市政污水中的应用，其应用步骤如下：

a)、将所述的罗氏假单胞菌或菌制剂与待处理市政污水混合；罗氏假单胞菌添加量为添加量占废水处理体系总体积的5％-40％，废水处理体系中的碳氮比为4-16。优选的，添加量为废水体积的20％-40％，废水处理体系中的碳氮比为8-12。

罗氏假单胞菌或菌制剂与待处理市政污水混合后，混合体系中活菌数为1×10

b)、混合后投加三水合乙酸钠1.05-1.81g/L作为碳源，然后放置于2-30℃，优选4℃，180rpm的恒温摇床中反应，反应一定时间后取样；

pH值为7-9，优选为7.5-8.5，更优选为8，有利于罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2在市政污水中生长繁殖，从而加快对市政污水中的硝态氮化合物的降解。

优选的，市政污水中的硝态氮浓度为15-30mg/L。

本发明的有益效果在于，对北方冬季市政污水中硝态氮有很好的去除效果，反硝化在好氧条件下进行，对环境无污染，是优选的除氮选择。

附图说明

图1为本发明实施例2中罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2的菌落形态图；

图2为本发明实施例3罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2及同时筛选得到的IL-1、IL-3分别处理市政废水的硝态氮去除情况；

图3为本发明实施例4提供IL-2菌株的不同反应时间比处理市政废水的硝态氮去除情况；

图4为本发明实施例5中罗氏假单胞菌IL-2菌株处理市政废水不同碳氮比的硝态氮去除情况；

图5为本发明实施例6中罗氏假单胞菌IL-2菌株处理市政废水不同转速硝态氮去除情况；

图6为本发明实施例7提供IL-2菌株的不同温度处理市政废水的硝态氮去除情况；

图7为本发明实施例8提供IL-2菌株的不同添加量处理市政废水的硝态氮去除情况；

图8为本发明实施案例9投加与不投加IL-2菌株处理市政废水的硝态氮去除情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体的实施例以及附图对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。

实施例1

筛选获取罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2，其筛选过程如下：

步骤1)、从某市政污水处理厂CASS处理工艺反应池出口取活性污泥；

步骤2)、将10g的活性污泥接种至硝态氮体积分数为0.5％的无机盐培养基中，在温度为4℃、转速为180转/分钟的摇床上培养3天，得到第一菌液；

步骤3)、吸取步骤2)中10％的第一菌液转接至硝态氮体积分数为1.5％的无机盐培养基中，在温度为4℃、转速为180转/分钟的摇床上培养3天，得到第二菌液；

步骤4)、吸取步骤3)中10％的第二菌液转接至硝态氮体积分数为2％的无机盐培养基中，在温度为4℃、转速为180转/分钟的摇床上培养3天，得到第三菌液；

步骤5)、吸取步骤4)中的第三菌液涂布于硝态氮体积分数为2％的无机盐固体培养基中，在温度为4℃的恒温培养箱中培养3天，获得单菌落；

步骤6)、挑取步骤5)中的单菌落置于离心管中，与甘油(体积分数30％)1:1体积混合，制成菌液，并于-80℃超低温冰箱中保存。

实施例2

对实施例1筛选的菌种进行鉴定。

本发明的实施例1中，筛选到三株菌，本发明中分别命名为IL-1、IL-2、IL-3。其中，经鉴定，IL-2为罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)。

罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2在琼脂平板培养基上生长良好，如图1所示，菌落呈规则形状，圆凸透明，大小统一，直径2～4mm，表面湿润，边缘平整，革兰氏染色为阴性，具有运动性，兼氧生长。菌株生长温度为2～30℃，pH 7～9，最适生长条件：生长温度为25℃，pH 8。

对实施例1中的步骤5)获得的单菌落提取DNA，并对菌种进行DNA测序，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明中亦称该菌为罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2。

实施例3

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌的氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2及同时筛选得到的IL-1、IL-3的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2、IL-1、IL-3；

步骤2)、将分别取30mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2及同时筛选得到的IL-1、IL-3按照步骤1离心后分别加入到编号2,3,4的测试瓶中，编号1为不加菌的对照组。并向每个测试瓶中加入硝态氮为22.94mg/L的市政污水及三水合乙酸钠(碳氮比为10)至总体积均为100mL，编号1的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓为0，体积分数为0。编号2、3、4中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2以及同时筛选到IL-1、IL-3原菌液的菌浓在9.0×10

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于4℃下，180转/分钟培养10h，测得10h处理后的硝态氮，并计算处理后的市政污水的硝态氮的去除率。

结果详见表1和图2。

表1不同菌株低温下处理市政污水的硝态氮浓度及去除率

如表1所示，3株脱氮菌选择添加量为30％，处理时间为14h时，IL-2菌以在好氧环境中，对市政污水处理10h时的硝态氮脱除效率达到98.56％，此时硝态氮浓度为0.33mg/L。而IL-1菌与IL-3菌反硝化性能显著低于IL-2菌，硝态氮处理效率分别为63.47％和86.31％。因此，IL-2菌的脱氮效果更优，选择IL-2菌做后续的研究。从图2中可以看出，IL-2菌的脱氮效果和IL-1菌与IL-3菌相比，其效果远远要好于IL-1菌与IL-3菌。

实施例4

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌的不同反应时间的氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2；

步骤2)、将0mL、30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2分别加入编号为0、1、2、3、4、5的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为22.73mg/L的市政污水及三水合乙酸钠(碳氮比为10)至总体积均为100mL。编号0(对照)、1、2、3、4、5中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-原菌液的菌浓在9.0X10

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于4℃下，180转/分钟培养0h，4h，6h，8h，10h，12h、14h，测得每个时间点处理后的硝态氮的去除率。

结果详见表2和图3。

表2 IL-2菌株不同反应时间处理市政污水的硝态氮的浓度

如表2所示，在IL-2菌株添加量为30％条件下分别对0h，4h，6h，8h，10h，12h、14h的硝态氮变化考察，结果表明随着处理时间的增加，硝态氮去除率有增加的趋势。其中，处理时间为14h时，IL-2菌脱氮效率最高，且为97.84％。从性价比综合考虑，处理时间为10h时为最佳的反应时间。

实施例5

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌的不同碳氮比条件下的氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2；

步骤2)、将0mL、30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2分别加入编号为0、1的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为2)至总体积均为100mL。编号0(对照)的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓为0，体积分数为0。编号1中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0×10

步骤3)、将30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入编号为2的测试瓶中，并向测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为4)至总体积均为100mL。编号2中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤4)、将30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入编号为3的测试瓶中，并向测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为6)至总体积均为100mL。编号3中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤5)、将30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入编号为4的测试瓶中，并向测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为8)至总体积均为100mL。编号4中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤6)、将30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入编号为5的测试瓶中，并向测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为10)至总体积均为100mL。编号5中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤7)、将30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入编号为6的测试瓶中，并向测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为12)至总体积均为100mL。编号6中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤8)、将30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入编号为7的测试瓶中，并向测试瓶中加入硝态氮为22.32mg/L的市政污水和三水合乙酸钠(碳氮比为14)至总体积均为100mL。编号7中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤9)、将步骤2)，步骤3)，步骤4)，步骤5)，步骤6)，步骤7)，步骤8)中的测量系统置于摇床中，于4℃下，180转/分钟培养10h，测得10h处理后的硝态氮，并计算处理后的市政污水的硝态氮的去除率。

结果详见表3和图4。

表3 IL-2处理市政污水不同碳氮比硝态氮去除效果

如表3所示，在IL-2菌株添加量为30％，反应时间为10h条件下，分别对碳氮比为2，4，6，8，10，12，14的硝态氮的去除效果进行考察，结果碳氮比越高，硝态氮浓度越低，硝态氮去除率越大。碳氮比为2，4，6，8，10，12，14处理后的硝态氮浓度分别为：17.13mg/L，13.78mg/L，8.26mg/L，3.36mg/L，0.46mg/L，0.41mg/L，0.39mg/L。IL-2菌利用NO

实施例6

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌的不同溶解氧的氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2；

步骤2)、将0mL、30.00mL、30.00mL、30.00mL、30.00mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2分别加入编号为1、2、3、4、5的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为21.98mg/L的市政污水及三水合乙酸钠(碳氮比为10)至总体积均为100mL。编号1(对照)、2、3、4、5中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于4℃下，转速分别为0r/min，60r/min,120r/min,180r/min，220r/min,相对应的溶解氧分别大约为0，1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L条件下培养10h，测得每个时间点处理后的硝态氮的去除率。

结果详见表4和图5。

表4 IL-2处理市政污水不同转速硝态氮浓度及去除率

如表4所示，碳氮比为10，转速分别为40r/min,80r/min,120r/min,180r/min对市政污水处理10h。结果表明，当转速为40r/min,80r/min,120r/min时，随着转速的增加，硝态氮脱除效率升高；当转速为180r/min时，IL-2菌脱氮效率最高为98.18％，此时硝态氮浓度为0.40mg/L；继续增加转速，硝态氮去除率略微下降，为97.13％。

实施例7

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌的不同温度条件下的含氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌液，分别取30mL、30mL、30mL、30mL和30mL的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2；

步骤2)、将0mL、30mL、30mL、30mL、30mL和30mL的菌液的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌体分别加入编号为1、2、3、4、5、6的测试瓶中，测试瓶用透气的封口膜封住瓶口，并向每个测试瓶中加入硝态氮为23.24mg/L的市政污水和对应的三水合乙酸钠(配成碳氮比为10)至总体积均为100mL。编号1的罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2原菌液的菌浓为0，体积分数为0。编号2、3、4、5、6中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0×10

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于180转/分钟的摇床中，于4℃、8℃、12℃、16℃和20℃，培养10h，测得10h处理后的硝态氮，并计算处理后市政污水的硝态氮的去除率。

结果详见表5和图6。

表5 IL-2处理市政污水不同温度条件下硝态氮浓度及去除率

从评价结果来看：对比4℃、8℃、12℃、16℃、20℃五个处理组可以看出，随着温度的升高，硝态氮的去除率先升高后降低，温度为8℃时硝态氮去除率最高为97.59％。温度升高到8℃以上硝态氮去除效率降低，原因可能是反应体系中酶的活性随着温度的升高受到了抑制，因此影响了反硝化速率。说明该菌株属于耐冷菌，在较低温度下显示出良好的硝态氮去除效果。

实施例8

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌的不同添加量的含氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌液，分别取5mL、10mL、20mL、30mL和40mL的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2；

步骤2)、将0mL、5mL、10mL、20mL、30mL和40mL的菌液的罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2菌体分别加入编号为1、2、3、4、5、6的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为22.75mg/L市政污水和对应的三水合乙酸钠(配成碳氮比为10)至总体积均为100mL，编号1的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓为0，体积分数为0。编号2、3、4、5、6中的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0X10

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于4℃下，180转/分钟培养10h，测得10h处理后的硝态氮，并计算处理后的市政污水的硝态氮的去除率。

结果详见表6和图7。

表5 IL-2处理市政污水不同添加量硝态氮浓度及去除率

如表6所示，碳氮比为10，以体积比分别投加菌液0、5％、10％、20％，30％和40％对市政污水处理10h。结果表明，当菌株添加量为5％-30％时，菌株投加量越大，硝态氮脱除效率越高；当菌株添加量为30％时，IL-2菌脱氮效率最高为96.26％，此时硝态氮浓度为0.85mg/L；继续增加菌体浓度为40％，硝态氮去除率不再升高，为91.34％。

实施例9

对实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2菌处理市政污水的氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2；

步骤2)、将分别取0mL、0mL、1mL的罗氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)IL-2加入到编号3的测试瓶中，编号1为不加菌不加碳源的对照组，编号2为不加菌的对照组。并向1，2,3测试瓶中加入硝态氮为22.15mg/L的市政污水及三水合乙酸钠(碳氮比为10)以及缺氧污泥至总体积均为100mL，泥水比的比例为4：6，编号1，2的罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2原菌液的菌浓为0，体积分数为0。编号3中的罗氏假单胞菌(Pseudomonasveronii)IL-2原菌液的菌浓在9.0×10

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于4℃下，180转/分钟培养2h，测得2h处理后的硝态氮，并计算处理后的市政处理水的硝态氮的去除率。

结果详见表7和图8。

表7 IL-2菌处理市政污水的硝态氮浓度及去除率

如表7所示，对市政污水处理2h时，不加菌剂和碳源组硝态氮脱除效率为39.15％，此时硝态氮浓度为17.16mg/L。不加菌剂加碳源组硝态氮脱除效率为63.12％，此时硝态氮浓度为10.4mg/L，比不加菌剂和碳源组硝态氮脱除效率提高23.97％。加菌剂和碳源组硝态氮脱除效率为85.21％，此时硝态氮浓度为4.17mg/L，比不加菌剂和碳源组硝态氮脱除效率提高46.06％，比不加菌剂加碳源组硝态氮脱除效率提高22.09％。

上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。