GIP和GLP-1共激动剂化合物

本申请是申请日为2016年1月5日的、发明名称为“GIP和GLP-1共激动剂化合物”的中国专利申请201680005007.X(PCT/US2016/012124)的分案申请。

发明领域

本发明涉及医药领域。更具体地说，本发明涉及激动人葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的双重肠促胰岛素肽模拟化合物，并且可用于治疗2型糖尿病(T2D)。

背景技术

T2D是最常见的糖尿病形式，约占所有糖尿病的90％。T2D的特征在于由胰岛素抗性引起的高血糖水平。目前针对T2D的护理标准包括饮食和运动以及可用的口服和注射降糖药物。然而，许多T2D患者仍然没有得到充分控制。目前市售的肠促胰岛素模拟物或二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂仅利用单一确立机制用于血糖控制。需要一种利用双重作用机制的针对T2D的化合物。

GIP是42个氨基酸的胃肠调节肽，其通过在葡萄糖存在下刺激从胰腺β细胞分泌胰岛素以及保护胰腺β细胞，在葡萄糖内稳态中发挥生理作用。GLP-1是37个氨基酸的肽，其刺激胰岛素分泌、保护胰腺β细胞、并抑制胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄入，导致体重减轻。GIP和GLP-1被称为肠促胰岛素；肠促胰岛素受体信号传导对葡萄糖内稳态发挥关键的生理相关作用。在正常生理学中，GIP和GLP-1在餐后从肠道分泌，这些肠促胰岛素增强对食物的生理反应，包括饱腹感、胰岛素分泌和营养物质处置。T2D患者具有受损的肠促胰岛素反应。

已经发现，GLP-1类似物的给药受到副作用(如恶心和呕吐)的限制，因此最常见的是给药不能实现全效血糖控制和体重减轻。单独的GIP在2型糖尿病人中具有非常适度的葡萄糖降低能力。天然GIP和GLP-1两者可以被普遍存在的蛋白酶DPP IV快速灭活，因此只能用于短期代谢控制。

胰高血糖素是由胰腺产生的29个氨基酸的肽，当与胰高血糖素受体结合时，发出信号使肝脏释放葡萄糖，导致血糖升高。已知GLP-2(与GLP-1类似，从胰高血糖素原加工产生的肽)与肠道中的细胞增殖有关。因此，T2D患者的长期治疗期间，应最小化对胰高血糖素和GLP-2受体的刺激，以便最大程度地降低葡萄糖并降低潜在的长期致癌风险。

在WO 2013/164483、WO 2014/192284和WO 2011/119657中已经描述了某些GIP类似物表现出GIP和GLP-1两者活性。

DPP IV在蛋白水解酶的外肽酶类中。在序列中引入非天然氨基酸可以增加任何给定肽的蛋白水解稳定性。虽然使用非天然氨基酸可有助于肽对抗DPP IV蛋白水解和其他形式降解的稳定性，但是作为本发明的一部分，本申请人发现非天然氨基酸可以对GIP和GLP-1之间激动剂活性的平衡产生意想不到的影响。非天然氨基酸还增加了肽可能被视为外源物并引起不需要的免疫反应(例如人免疫原性和注射位点反应)的可能性。

脂肪酸通过其白蛋白结合基序，可以例如通过延长半衰期来改善肽的药代动力学。虽然使用脂肪酸可以改善肽的半衰期，但作为本发明的一部分，申请人发现，脂肪酸链的长度、组成和位置、以及肽和脂肪酸链之间的接头可以对GIP和GLP-1激动剂活性的平衡具有意想不到作用。

已经发现某些GLP-1类似物的耐受性可以防止一剂GLP-1类似物达到更好的血糖控制和体重减轻的功效。GLP-1类似物最常见的副作用是恶心和呕吐，但有些化合物也可能影响心率。HPA轴是生理应激反应的一部分，已经发现GLP-1刺激大鼠的HPA轴，导致增加的皮质酮水平，提供与不良事件(例如心率增加)的潜在联系。作为本发明的一部分，申请人意想不到地发现，本发明的化合物不导致升高的皮质酮水平(如大鼠模型中使用索马鲁肽(semaglutide)所见)，因此与GLP-1R选择性试剂相比，其可能给药达到更高功效水平。

仍然需要提供一种化合物，其是GIP和GLP-1受体的平衡共激动剂，但与相关的胰高血糖素和GLP-2受体比较，表现出选择性。此外，仍然需要提供一种化合物，其具有GIP和GLP-1受体的平衡共激动剂活性，鉴于在动物模型中发现的活性，其可以提供体重减轻。此外，仍然需要提供一种化合物，其具有GIP和GLP-1受体的平衡共激动剂活性，其提供对抗DPP IV和其他降解形式的足够稳定性，但仍然保持低的免疫原性潜力。此外，仍然需要提供一种化合物，其具有GIP和GLP-1受体的平衡共激动剂活性，其支持在人中每周一次给药的可能性。

发明内容

因此，与本领域中的某些GIP-GLP-1共激动剂化合物相比，本发明的某些化合物具有较低的免疫原性潜力和注射部位反应。本发明的某些化合物具有基于动物能量消耗数据在患者中产生体重减轻的潜力。此外，本发明的某些化合物对GIP和GLP-1受体具有平衡共激动剂活性并且与胰高血糖素和GLP-2受体相比表现出选择性、具有低免疫原性潜力、和支持在人中每周一次给药的药代动力学(PK)特征。

因此，本发明的一个实施方案提供式I的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，

其中X

在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中X

在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中X

在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中X

在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中X

在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供下式的化合物或其药学上可接受的盐：

YX

其中X

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。

在一个实施方案中，本发明提供治疗2型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗2型糖尿病的方法，该方法还包括同时、分开或相继地与有效量的一种或多种选自二甲双胍(metformin)、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、二肽基肽酶4抑制剂和钠葡萄糖共转运蛋白中的试剂组合施用。

在一个实施方案中，本发明提供一种改善2型糖尿病成人中血糖控制的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物作为饮食和运动的辅助剂。在一个实施方案中，本发明提供了一种在具有初始体重指数(body mass index)≥27和2型糖尿病的成人中长期体重管理的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物作为低热量饮食和增加的身体活动的辅助剂。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗代谢综合征的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗与胰岛素抗性和糖尿病相关的血脂异常、肥胖和/或肝脂肪变性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物。另外，本发明提供了治疗虚弱或增加骨强度的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物。

在一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物用于治疗。在另一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物用于治疗2型糖尿病。在另一个实施方案中，本发明提供，本发明的化合物，与选自二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、二肽基肽酶4抑制剂和钠葡萄糖共转运蛋白中的一种或多种试剂，同时、分开或相继组合用于治疗2型糖尿病。

在一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物作为饮食和运动的辅助剂用于2型糖尿病成人中的血糖控制。在一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物在具有初始体重指数≥27和2型糖尿病的成人中作为低热量饮食和增加的身体活动的辅助剂用于长期体重管理。

在一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物在制备用于治疗2型糖尿病的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物与选自二甲双胍、噻唑烷二酮类、磺酰脲类、二肽基肽酶4抑制剂和钠葡萄糖共转运蛋白中的一种或多种试剂同时、分开或相继组合用于制备用于治疗2型糖尿病的药物中的用途。

本发明提供显示平衡的GIP和GLP-1活性的化合物。本文所用的对GIP和GLP-1的平衡活性是指，在体外结合测定法中化合物对GIP受体和GLP-1受体的亲和力的摩尔比接近1:1，如1:1 GLP-1/GIP、2:1GLP-1/GIP、3:2 GLP-1/GIP、1:2 GLP-1/GIP或2:3 GLP-1/GIP。

本发明提供，与胰高血糖素和GLP-2受体相比，对GIP和GLP-1受体显示出选择性的化合物。在本文中用于与胰高血糖素活性相比提及GIP和GLP-1活性时，术语“选择性”或“(与……相比)选择性”是指，当来自相应的体外结合测定法的数据归一化后，化合物对GIP和GLP-1显示出比对胰高血糖素高1000、500或约100倍的效力。当在本文中用于与GLP-2活性相比提及GIP和GLP-1活性时，术语“选择性”或“(与……相比)选择性”是指，当来自相应的体外功能测定法的数据归一化后，化合物对GIP和GLP-1显示出比对GLP-2高250、200、100或约50倍的效力。

本发明提供了一种用于治疗患者中2型糖尿病的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供了一种用于治疗患者中2型糖尿病的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，其中所述施用是皮下的。本发明还提供了一种治疗患者中2型糖尿病的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，以及同时、分开，或相继施用有效量的一种或多种其他活性成分。在一个实施方案中，其他一种或多种活性成分是目前可获得的口服降低葡萄糖的药物，所述药物来自在施用前被视为护理标准的一类药物(由诸如美国糖尿病协会(American Diabetes Association)的行业指南确定)。

本发明的化合物利用化学缀合至赖氨酸侧链的ε-氨基的脂肪酸。该脂肪酸通过接头缀合至赖氨酸侧链的ε-氨基。接头包含[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)

本发明的化合物优选配制成通过胃肠外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内或透皮)施用的药物组合物。这样的药物组合物及其制备方法是本领域公知的。(参见例如Remington:The Science and Practiceof Pharmacy(D.B.Troy编辑,第21版,Lippincott,Williams&Wilkins,2006)。优选的施用途径是皮下。

本发明的化合物可以与多种无机酸和有机酸中的任意反应形成药学上可接受的酸加成盐。药学上可接受的盐和制备它们的常用方法是本领域公知的。参见例如P.Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use,第二修订版(Wiley-VCH,2011)；S.M.Berge,等人，“Pharmaceutical Salts,”Journal ofPharmaceutical Sciences,Vol.66,No.1,1977年1月。本发明的药学上可接受的盐包括三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。

如本文所用，术语“有效量”是指，本发明化合物或其药学上可接受的盐的量或剂量，其以单个或多个剂量施用给患者时，在诊断或治疗的患者中提供期望的效果。有效量可以由主治诊断医师(作为本领域技术人员)，通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果，容易地确定。在确定患者的有效量时，主治诊断医师将考虑许多因素，包括但不限于：哺乳动物的种类；其大小、年龄和一般健康状况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的累及程度或严重程度；个体患者的反应；施用的具体化合物；施用方式；所施用的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；伴随药物的使用；和其他相关情况。

如本文所用，术语“治疗”包括抑制、减缓、停止或逆转现有症状或病患的进展或严重程度。

如本文所用，“索马鲁肽”是指化学合成的GLP-1类似物，其具有CAS登记号910463-68-2中的肽骨架和整体化合物结构。

本发明的某些化合物通常在宽剂量范围内有效。例如，每周一次给药的剂量可以在每人每周约0.05至约30mg的范围内。本发明的某些化合物可以每天给药。另外，本发明的某些化合物可以每周一次给药。

本发明的氨基酸序列含有二十种天然氨基酸的标准单字母或三字母代码。另外，“Aib”是α氨基异丁酸，“1-Nal”是1-萘基丙氨酸。

本发明还包括可用于合成本发明化合物或其药学上可接受盐的新的中间体和方法。本发明的中间体和化合物可以通过本领域已知的多种方法制备。特别地，在下面的实施例中举例说明了使用化学合成的方法。所描述的每一途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，以制备本发明的化合物或其盐。试剂和原料是本领域普通技术人员容易获得的。应当理解，这些实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

YX

其中X

三氟乙酸盐

除了残基Aib2、Aib13和K20之外，上述结构含有标准单字母氨基酸代码，其中Aib2、Aib13和K20氨基酸残基的结构已经展开。

通过以下生成根据本发明的SEQ ID NO：3的肽：在Symphony自动肽合成仪(PTIProtein Technologies Inc.)上使用Fmoc/t-Bu策略进行固相肽合成，从RAPP AM-Rink酰胺树脂开始，其中使用6当量的用二异丙基碳二亚胺(DIC)和羟基苯并三唑(HOBt)活化的氨基酸(1：1：1摩尔比)在二甲基甲酰胺(DMF)中在25℃下90分钟进行偶联。

对于Pro31、Trp25、Gln24、Val23、Phe22、Lys20、Gly4、Glu3和Aib2，延长偶联(每个4h)对于改善粗肽质量是必要的。使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH构件(building block)进行Lys20偶联(正交保护基团)，以便稍后在合成过程中进行脂肪酸结构部分的位点特异性连接。以下条件用于位置12的Fmoc-Ile-OH偶联：25℃，Fmoc-Ile-OH(6当量)、PyBOP(6当量)和DIEA(12当量)，在DMF中，24小时。如上所述，使用DIC-HOBt方案，以Boc-Tyr(tBu)-OH形式引入N-末端残基。

在完成上述肽-树脂延伸之后，在存在PhSiH

在含有90:4:2:2:2(v/v)的三氯乙酸(TFA)：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：水：苯甲硫醚的溶液中、在25℃、2小时同时完成从树脂切割和侧链保护基去除，然后用冷乙醚沉淀。在C18柱上用水/乙腈(含有0.05％v/v的TFA)梯度，通过反相HPLC色谱法，将粗肽纯化至>99％纯度(15-20％纯化产率)，其中合并合适的级分并冷冻干燥。

在基本上如上所述进行的合成中，通过分析性反相HPLC检查实施例1的纯度，并使用LC/MS确认了化合物身份(观察值：M+3H

实施例2

YX

其中X

三氟乙酸盐

除了残基Aib2、Aib13、K20和1-Nal22之外，上述结构含有标准单字母氨基酸代码，其中这些氨基酸残基Aib2、Aib13、K20和1-Nal22的结构已经展开。

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：4的肽。以下条件用于位置22的Fmoc-1Nal-OH的偶联：25℃，Fmoc-1Nal-OH(6当量)、PyBOP(6当量)和DIEA(12当量)，在DMF中4小时。

实施例3

YX

其中X

三氟乙酸盐

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：5的化合物。

实施例4

YX

其中X

三氟乙酸盐

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：6的化合物。

实施例5

YX

其中X

三氟乙酸盐

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：7的化合物。

实施例6

YX

其中X

三氟乙酸盐

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：8的化合物。

实施例7

YX

其中X

三氟乙酸盐

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：9的化合物。

实施例8

YX

其中X

三氟乙酸盐

与以上实施例1中所述类似地，合成根据本发明的SEQ ID NO：10的化合物。

测定法

以下提供了几种测定法中用于实施例的条件和数据：体外功能和选择性、免疫原性分析、药代动力学和体内2型糖尿病模型。

对人GLP-1和GIP受体的体外结合效力

使用从过表达人GLP1R cDNA或人GIP-R cDNA的克隆细胞系获得的粗细胞膜，通过测量结合亲和力(K

人葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体结合测定法使用克隆到pcDNA3.1(Promega)-NeoR质粒中的hGIP-R(Usdin,T.B.,Gruber,C.,Modi,W.and Bonner,T.I.,GenBank:AAA84418.1)。将hGIP-R-pcDNA3.1/Neo质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞CHO-S，用于悬浮培养，并在500μg/mL遗传霉素(Invitrogen)存在下选择。

使用来自悬浮培养物的细胞，制备粗质膜。在含有25mM Tris HCl pH7.5、1mMMgCl

GIP通过I-125-乳过氧化物酶法(Markalonis,J.J.,Biochem.J.113:299(1969))进行放射性碘化，并通过反相HPLC(Perkin-Elmer Lifeand Analytical Sciences NEX-402)纯化。比活性为2200 Ci/mmol。通过使用冷hGIP进行同源竞争而非饱和结合，进行K

以化合物存在下I-125-GIP比结合百分数，计算结果。通过I-125-GIP的比结合百分数vs加入的化合物浓度的非线性回归，得出绝对IC

GLP-1受体结合法测定使用从293HEK膜分离的克隆的人胰高血糖素样肽1受体(hGLP-1R)(Graziano MP,Hey PJ,Borkowski D,Chicchi GG,Strader CD,BiochemBiophys Res Commun.196(1):141-6,1993)。将hGLP-1R cDNA亚克隆到表达质粒phD(完全γ-羧基化重组人蛋白C(抗血栓形成因子)的反式激活表达，Grinnell,B.W.,Berg,D.T.,Walls,J.and Yan,S.B.Bio/Technology 5:1189-1192,1987)。将该质粒DNA转染到293HEK细胞中，并用200μg/mL潮霉素选择。

使用来自悬浮培养物的细胞制备粗质膜。在含有25mM Tris HCl，pH7.5、1mMMgCl

胰高血糖素样肽1(GLP-1)通过I-125-乳过氧化物酶法进行放射性碘化，并通过反相HPLC在Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences(NEX-308)纯化。比活性为2200Ci/mmol。因为I-125 GLP-1材料中高的丙醇含量，通过同源竞争而不是饱和结合进行K

使用临近闪烁分析法(SPA)进行受体结合测定，其中事先用1％无脂肪酸BSA(Gibco)封闭小麦胚芽凝集素(WGA)珠。结合缓冲液含有25mM HEPES，pH7.4、2.5mM CaCl

以化合物存在下I-125-胰高血糖素样肽1比结合百分数计算结果。通过I-125-胰高血糖素样肽1的比结合百分数vs.加入的化合物浓度的非线性回归，得出绝对IC

在基本上如本测定法中所述进行的实验中，本发明的某些化合物显示出约0.5-4.0的hGLP-1R/hGIPR比(表1)。将摩尔结合比，相对于天然GIP和GLP-1混合物的相应摩尔比，进行归一化。基于GIP(Ki＝0.175nM)和GLP-1(Ki＝0.793nM)的结合数据，该归一化因子为4.53。1.48的值表明实施例1的平衡共激动剂活性。

表1：受体结合亲和力，Ki，nM(SEM，n)

平均值表示为几何平均值，其中括号中给出平均值的标准误差(SEM)和重复次数(n)。限定符(>)表示数据未达到50％抑制，使用测定中测试的最高浓度计算Ki。

功能性hGIP-R、hGLP-1R和hGCGR测定。

对于人GIP、GLP-1和胰高血糖素受体，在表达这些受体的HEK-293克隆细胞系中测定本发明化合物对这些受体的体外功能活性。在40μl测定体积中，在补充有1X GlutaMAX

在基本上如本测定法所述进行的实验中，本发明的某些化合物表现出对人GIP和GLP-1受体的活性，同时也显示出对这些受体超出对胰高血糖素受体的选择性。在表2中，针对天然hGIP(1-42)NH

表2.对人GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的功能效力(EC

EC

功能激活hGIP-R细胞以在分泌肠促胰岛素的细胞系中产生细胞内cAMP

通过化合物在GLUTag细胞中产生细胞内cAMP的能力来证明本发明化合物的hGIP-R功能活性，GLUTag细胞是稳定的、永生化、相对分化的鼠肠内分泌细胞系，其表达胰高血糖素原基因并以被调节的方式分泌胰高血糖素样肽。在补充有5.5mM葡萄糖、10％FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中，在37℃、5％CO

在基本上如本测定法所述进行的实验中，本发明的某些化合物显示剂量依赖性的、GLUTag细胞中增强的cAMP积累(表3)。天然GLP-1对照在测试的所有浓度下都不能诱导cAMP的任何变化，表明该细胞系统仅表达GIP受体；由此，证明本发明的某些化合物可以通过GIP受体发挥作用。

表3：GLUTag细胞中的EC50。

测量瞬时表达人GLP-2受体的HEK293细胞中的细胞内cAMP

通过测量HEK293细胞中的细胞内cAMP来证明在本发明化合物存在下的hGLP-2R功能活性。将这些细胞在完全培养基中传代，在悬浮液中用Promega Fugene6试剂和pcDNA3.1表达载体中人全长GLP-2RcDNA进行转染，并使其在加湿的37℃、5％CO

在处理前，计数细胞存活力并在37℃平衡约1至2小时。将本发明的化合物溶于DMSO中，并立即稀释于含0.1％级分V BSA和非特异性磷酸二酯酶抑制剂IBMX的DMEM培养基中。在37℃处理时间为30分钟。最终的DMSO浓度不超过1.1％，最终的IBMX浓度为250μM。通过均相时间分辨荧光技术(Cisbio Bioassays，Bedford，MA)，使用Dynamic 2测定法测量环AMP。相应cAMP浓度由比值计算法和外部标准推出。使用四参数逻辑斯蒂方程，检验测试化合物的S形剂量反应，并与天然C

在基本上如本测定法所述进行的实验中，对于受体活化，C

表4：HEK293细胞中GLP-2R功能活性测定。

啮齿动物胰岛的胰岛素分泌

为了评估本发明化合物在呈现生理性GLP-1R和GIP-R表达水平的胰岛素分泌系统中对胰岛素分泌的作用，测试了化合物对野生型啮齿动物胰岛的胰岛素分泌的影响。

在雄性C57Bl/6小鼠(22-26 g)或雄性Sprague-Dawley大鼠(约250g)中胆总管插管后，用Hank's缓冲液(3ml用于小鼠或10ml用于大鼠，其含有2％BSA和0.75mg/ml Clzyme胶原酶(VitaCyte))扩张胰腺。随后，在37℃在Hank's缓冲液中消化组织11-13分钟(小鼠)或14-16分钟(大鼠胰腺)。在含有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中培养纯化的胰岛(Histopaque-1100梯度[Sigma-Aldrich]，以750x重力，18分钟)过夜，并在补充有0.1％BSA和2.8 mM葡萄糖的Earle’s平衡盐溶液(EBSS)中通过饥饿预调节。然后将胰岛在补充有0.1％BSA、2.8-11.2mM葡萄糖和递增水平的化合物的EBSS(Invitrogen)中孵育(6批，4个胰岛/条件)。GLP-1(7-36)酰胺(30nM)用作阳性对照。使用MSD胰岛素测定法(Meso Scale，Gaithersburg，MD)经90分钟测定上清液中的胰岛素。

如表5所示，本发明的某些化合物剂量依赖性地增加自大鼠和小鼠胰岛的胰岛素分泌。

表5.啮齿动物胰岛的胰岛素分泌

使用计算机(in silico)预测程序(如Epivax计算机分析)，评估本发明化合物的免疫原性风险。还通过离体法测定在本发明化合物存在下培养的T细胞应答(

使用Epivax免疫信息工具，对本发明的化合物进行计算机评估以预测施用后的免疫应答。该分析利用9-mer框架结合给定的人白细胞抗原白细胞抗原(HLA)等位基因的概率，然后检测这些Epi-Bars。对于实施例1，约+1.13的EpiMatrix评分表明，与天然GIP肽骨架(EpiMatrix评分为+15.4)相比，诱导免疫应答的潜力低得多。来自WO 2011/119657的GIP/GLP-1共激动剂实施例的评分为+29.5。

此外，通过在代表全球HLA同种异型群的50名健康供体组群中表征CD4+T细胞增殖和IL-2细胞因子分泌，检查本发明化合物的预测临床免疫原性。本发明的某些化合物显示，暴露后的T细胞刺激和IL-2分泌程度不超过与已知或阳性免疫原性化合物相关的阈值，表明产生临床免疫原性的风险低。

食蟹猴中的药代动力学。

使用食蟹猴(Cynomolgus monkey)，阐明本发明化合物的体内药代动力学性质。在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH7.0)中以0.21ml/kg的体积，施用单个静脉内或皮下剂量(0.2mg/kg)的化合物。在给药后2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、204、240和312小时，从每只动物收集血液。通过LC/MS法测定本发明化合物的血浆浓度。简言之，从1X PBS(150μl)稀释的100％猴血浆样品(50μl)提取本发明的化合物，并与N-丁醇(400μl)混合。形成三个不同的液体层，其中化合物位于顶层。将200μl的体积转移到v-底96孔板中，使用加热的氮气干燥，并用100μl 30％乙腈/0.1％甲酸重构。将20μl重构样品注射到SupelcoAnalyticalDiscovery Bio宽C5 3μm柱上。将柱流出物导入ThermoQ-Exactive质谱仪中进行检测和定量。

在基本上如本测定法所述进行的实验中，实施例1在皮下给药后约8小时达到平均最大血浆浓度。平均半衰期为55小时，平均清除率为0.73mL/hr/kg。生物利用度约为83％。该数据支持实施例1的每周一次给药的可能性。本发明其他化合物的数据总结在表6中。

表6：向雄性食蟹猴单次皮下给药0./2mgkg后平均药代动力学参数

n＝2，AUC

剂量效价强度估计

使用大鼠中静脉内葡萄糖耐量试验(ivGTT)来估计本发明化合物与索马鲁肽相比的相对效价强度(potency)。向大鼠施用单次皮下(SC)剂量0.1-10nmol/kg的各化合物，并在给药后16小时向每只大鼠施用ivGTT。在ivGTT时测量暴露，并且对于暴露反应建模，将响应于ivGTT的胰岛素AUC用作主要终点。

使用E

静脉内施用葡萄糖后大鼠体内的胰岛素分泌(IVGTT)

将雄性Wistar大鼠(Harlan Labs，Indianapolis，IN)按体重随机分组，并在葡萄糖施用前16小时s.c.给药1.5ml/kg，然后禁食。剂量为赋形剂(vehicle)、0.1、0.3、1、3和10nmol/kg。将动物称重，然后用戊巴比妥钠(Nembutal Sodium solution；OvationPharmaceuticals)i.p.给药(65mg/kg，30mg/ml)麻醉。在零时间收集血样到EDTA管中，之后施用葡萄糖(0.5mg/kg，5ml/kg)。在葡萄糖后2、4、6、10、20和30分钟收集血样。使用Hitachi分析仪(Roche)测定血浆葡萄糖水平，并通过MSD胰岛素测定法(Meso Scale，Gaithersburg，MD)测量血浆胰岛素。

如表7所示，本发明的某些化合物剂量依赖性地增强i.v.注射葡萄糖之后的胰岛素分泌。在表7中给出胰岛素的ED

表7.大鼠IVGTT测定中胰岛素分泌的增强

在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中对体重减轻、身体组成和肝脂肪变性的影响

在C57/BL6 DIO小鼠中评估本发明化合物对DIO小鼠的体重减轻、身体组成和肝脂肪变性的影响。这些动物虽然不是糖尿病，但是在给予高脂肪(60％Kcal来自脂肪)饮食12周后，显示胰岛素抗性、血脂异常和肝脂肪变性，这些都是代谢综合征的特征。

在本研究中，使用23-24周龄的雄性饮食诱导的肥胖(DIO)C57/B16雄性小鼠，每只体重41-49g，具有初始脂肪量为10.5-17.5g。动物分别安置在温度控制(24℃)的设施中，12小时光/暗循环(照明在22:00)，并可自由获得食物和水。在适应该设施2周后，根据体重将小鼠随机分配至处理组(n＝5/组)，因此每组具有相似的起始平均体重。

赋形剂对照、本发明的化合物(剂量范围10-100nmol/kg)或长效GLP1类似物索马鲁肽(30nmol/kg)溶解在赋形剂(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH7.0)中，在黑暗周期开始前30-90分钟，通过SC注射施用给自由摄食的DIO小鼠，每三天一次，持续15天。在第1、4、7、10和13天进行SC注射。在整个研究中测量每日体重和食物摄取量。通过减去在第一次注射化合物之前相同动物的体重来计算体重的绝对变化。在第0天和第14天，使用回波医疗系统(Houston，TX)仪器通过核磁共振(NMR)测量总脂肪量。

在第15天，使用Accu-Chek血糖仪(Roche)从尾静脉血测量血糖，然后处死动物，取出肝脏并冷冻。在Hitachi Modular P临床分析仪上测量肝脏甘油三酯(从处死时收集的肝匀浆物确定)和血浆胆固醇。使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)以及随后通过Dunnett's多重比较检验，进行组间的统计学比较。使用非线性拟合工具在GraphPadPrism中确定体重减轻降低的ED

在基本上如该测定法所述进行的实验中，本发明的某些化合物以剂量依赖的方式降低体重和脂肪量(表8-13)，与索马鲁肽相比，在降低体重方面可以是3-5倍更有效。实施例1的体重减轻百分比的ED

表8.DIO小鼠中体重或脂肪量变化的百分数

**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001相对于对照组(One-Way ANOVA，Dunnett’s).结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。

表9.DIO小鼠的体重或脂肪量变化的百分数

****p＜0.0001相对于对照组(One-Way ANOVA，Dunnett’s).结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。

表10.DIO小鼠中体重或脂肪量变化的百分数

****p＜0.001相对于对照组(One-Way ANOVA，Dunnett’s).结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。

表11.DIO小鼠的血糖、血浆胆固醇和血浆甘油三酯

*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001相对于对照组(One-WayANOVA，Dunnett’s).结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。

表12.DIO小鼠的血糖、血浆胆固醇和肝脏甘油三酯

*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001相对于对照组(One-WayANOVA，Dunnett’s).结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。

表13.DIO小鼠的血糖和血浆胆固醇

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001相对于对照组(单因素方差分析，Dunnett's)。结果表示为每组5只小鼠的平均值±SEM。

对DIO小鼠能量代谢的影响

在26周龄的C57/Bl6 DIO雄性小鼠(重量为43-50g)中评估了本发明的化合物对DIO小鼠中能量代谢的影响。小鼠单独饲养在温度控制(24℃)的设施中，12小时光/暗循环(照明在22:00)，并可自由获得食物TD95217(Teklad)和水。在适应设施2周后，将小鼠基于体重随机分配至处理组(n＝6/组)，因此每组具有相似的起始平均体重。将动物放置在PhenoMaster/LabMaster量热计(TSE Systems，Chesterfield，MO)中适应环境3天。赋形剂对照(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH7.0，10 ml/kg)、本发明的化合物或长效GLP1类似物索马鲁肽(30nmol/kg)，在黑暗周期开始前30-90分钟，皮下施用给自由摄食的DIO小鼠，每三天一次，持续22天。使用开路量热系统(open-circuit calorimetry system)，通过如所述的间接量热法，测量热和呼吸商(RER)。RER是产生的二氧化碳体积(Vco

VO2＝FlowML*(V1+V2)/N2Ref*动物体重*100)

VCO2＝FlowML*dCO2/动物体重*100)

热＝(CVO2*VO2+CVCO2*VCO2)/1000；

其中CVO2＝3.941；CVCO2＝1.106

在基本上如该测定法所述进行的实验中，用实施例1处理的小鼠与对照组相比，从第2周开始，其代谢率显著增加10至15％，并在整个处理期间维持该效果。然而，索马鲁肽对代谢率没有影响。对于实施例1，代谢率的增加部分说明了，与索马鲁肽处理相比，通过实施例1的处理观察到的额外体重减轻。

对DIO小鼠胃排空的影响

在23周龄饮食诱导的肥胖(DIO)雄性小鼠(Harlan)中评估本发明的化合物对DIO小鼠胃排空的影响。小鼠禁食16-17小时。在禁食期开始时，小鼠皮下给药赋形剂对照(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH7.0)；递增剂量的本发明化合物(3、10、30和100nmol/kg)或长效GLP1类似物索马鲁肽(30nmol/kg)。第二天，通过经口管饲，给小鼠施用0.5ml(0.5克)新鲜制备的半流体饮食(2分钟间隔)。此时除去水，以防止稀释施用的饮食。在饮食施用后两小时，将小鼠用CO

在基本上如该测定法所述进行的实验中，实施例1以剂量依赖性的方式减缓半流体饮食的胃排空速率。在10nmol/kg+/-剂量下观察到胃排空的最大抑制(表14)。

表14.瘦的C57/BL6 DIO小鼠中半流体饮食的胃排空。

使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)以及随后通过Dunnett's多重比较检验，进行组间的统计学比较。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001相对于对照组。结果表示为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。

在Sprague Dawley大鼠中血浆皮质酮测量

如在某些已发表的研究中所提示的，升高的血浆皮质酮水平是对GIP和GLP-1类似物可能降低的耐受性的指征。使用Sprague Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis)评估血浆皮质酮水平，所述Sprague Dawley大鼠重约220g，在操作前适应环境至少72小时。然后向大鼠s.c.给药赋形剂(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH7)、索马鲁肽(10nmol/kg)或本发明化合物3、10或30nmol/kg，其中每个剂量组8只大鼠。16小时后将大鼠断头。将血液在冰上收集到EDTA管中，然后在Eppendorf 5402台面离心机中以8000RPM离心5分钟。将血浆储存在-80℃直到分析。

对于皮质酮分析，通过在HPLC级甲醇、H

在基本上如该测定法所述进行的实验中，实施例1表明在任何所测试的剂量下血浆皮质酮水平均没有增加，而索马鲁肽与对照组相比有约4倍的增加。

表15：Sprague Dawley大鼠中血浆皮质酮分析

氨基酸序列

SEQ ID NO:1(人GIP)

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ

SEQ ID NO:2(人GLP-1)

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

SEQ ID NO:3

YX

其中X

SEQ ID NO：4

YX

其中X

SEQ ID NO：5

YX

其中X

SEQ ID NO：6

YX

其中X

SEQ ID NO：7

YX

其中X

SEQ ID NO：8

YX

其中X

SEQ ID NO：9

YX

其中X

SEQ ID NO：10

YX

其中X

SEQ ID NO：11

YX

其中X