用于治疗心脏病的microRNA靶向剂

本发明通过施用可调节microRNA的活性或表达的寡核酸试剂来治疗和预防心脏病。更准确而言，本发明提供了通过抑制microRNA miR27b-5p的表达和/或活性来治疗或预防心脏病的方法。

背景技术

目前尚不清楚应激信号通过怎样的机制来促进内复制，并由此在细胞周期的S期使DNA复制，而无需随后通过有丝分裂和/或胞质分裂来提高细胞大小的阈值。虽然对细胞周期调节、生长信号通路以及转录和翻译网络的分析提供了对上游控制网络的洞察，但上述调节因子能够在其中发挥作用所依据的机理这一基础能量学中更基本的问题仍未得到解答。细胞的能量状态不仅决定倍性(即细胞中染色体组的数量)，而且还决定细胞的大小和功能，以建立允许特定输出的环境，这些输出被信号级联和转录调节因子共同选择，以实现特定的生长或功能性终点。新出证据将ADP:ATP稳态失调与人类肥厚型心肌病(HCM)和主动脉瓣狭窄(AS)的发展联系起来。HCM和AS代表了心脏过度生长的表型，其特征是内复制，由此导致多倍体和多核化(具有两个或更多个核的细胞)，以及在线粒体ATP合成抑制的环境中病理性心肌细胞的生长。矛盾的是，能量不足的心肌细胞通过线粒体氧化表现出了产生能量和辅因子的能力降低，却能够驱动合成代谢过程来支持心肌肥大。与此一致的是，线粒体肌病的主要特征是心脏过度生长。

鉴于心脏肥大的代谢特征是线粒体ATP的合成减少，我们于是开始系统地分析人HCM和AS患者的活检组织中ATP合酶复合物的所有亚基的表达。我们确定了在HCM和AS活检组织中下调的ATP5A1(编码ATP合酶催化F

由于本发明人可通过miR27b-5p的过表达，将心脏代谢性内复制确定为一种迄今未知的用以指示能量缺乏型心肌中病理性生长进展的机制，因此本领域需要能够抑制miR27b-5p表达的治疗方法，以通过内复制和核苷酸的从头生物合成来预防病理性生长。

基于上述现有技术，本发明的目的是提供用于治疗心脏病(尤其心肌病)的手段和方法。该目的是通过本说明书的权利要求的主题实现的。

本发明基于以下发现：通过施用寡核酸试剂(SEQ ID NO 001)抑制miRNA miR27b-5p，可利用诸如ATP合酶之类的调节因子来改变心肌的病理性生长，且ATP合酶驱动线粒体ADP积累并将其重新定向至亚甲基四氢叶酸脱氢酶1L(MTHFD1L)和核苷酸的从头生物合成。

在本发明的上下文中，术语“miRNA”涉及未熟的、早熟的和成熟的miRNA。

miRNA27b的茎环序列有两个成熟的亚种，即miRNA27b-3p和miRNA27b-5p。

在本发明的上下文中，“能够形成杂交体”涉及在哺乳动物细胞的细胞溶质条件下能够与其靶序列选择性地结合的序列。此类杂交序列可以与靶序列连续反向互补，或可包含缺口、错配或其他不匹配的核苷酸。能够形成杂交体的序列的最小长度取决于其组成，其中C或G核苷酸比A或T/U核苷酸对结合能和主链化学性质的贡献更大。

在本说明书的上下文中，术语“寡核酸试剂”是指能够与miR27b-5p特异性地结合并导致miR27b-5p的生理作用显著降低的寡核苷酸。本发明的寡核酸试剂的实施例是由DNA(在其主链中具有硫代磷酸酯修饰键)、核糖核苷酸寡聚物、包含桥连或锁定的核苷酸的RNA制成的反义寡聚物，特别是其中核糖环通过2’-O与4’-C原子之间的亚甲基桥连接起来，且RNA在其主链中具有硫代磷酸酯修饰键，或者由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基组成的任何混合物作为寡聚物。

在本说明书的上下文中，术语“反义寡核苷酸”或“寡核苷酸试剂”是指能够与miR27b-5p特异性地结合并导致miR27b-5p的生理作用显著降低的任何寡核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的实施例是由DNA(在其主链中具有硫代磷酸酯修饰键)、核糖核苷酸寡聚物、包含桥连或锁定的核苷酸的RNA制成的反义寡聚物，特别是其中核糖环通过2’-O与4’-C原子之间的亚甲基桥连接起来，且RNA在其主链中具有硫代磷酸酯修饰键，或者由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基组成的任何混合物作为寡聚物。

术语“寡核酸试剂”和“反义寡核苷酸”或“寡核苷酸试剂”在本说明书中可互换使用。

在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸包括核酸的类似物，例如磷酸酯、2’O-甲基硫代磷酸酯、肽核酸(PNA；通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元，其核碱基附着在甘氨酸的α碳上)或锁核酸(LNA；由2’O、4’C亚甲基桥连的RNA结构单元)。反义序列可以部分地由任何上述核酸类似物组成，其余的核苷酸是自然界中存在的“天然”核糖核苷酸，或者可以是不同类似物的混合物，或者可完全由一种类似物组成。

术语“缺口聚物”以其在分子生物学领域中已知的含义使用，是指与其靶序列互补的反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸寡聚物的中央嵌段，其侧接有短核糖核苷酸寡聚物。侧翼的核糖核苷酸寡聚物由核酸酶和蛋白酶抗性核糖核苷酸组成。在某些实施方式中，抗核酸酶和蛋白酶的核糖核苷酸包含2’-O修饰核糖核苷酸，特别是在核糖部分的2’-O与4’-C之间具有桥的桥连核酸。

在本发明的上下文中，“核苷酸”是核酸或核酸类似物的结构单元，其寡聚物能够基于碱基配对与miRNA寡聚物形成选择性杂交体。在本文中，术语“核苷酸”包括经典的核糖核苷酸结构单元，即腺苷、鸟苷、尿苷(和核糖胸腺素)、胞苷，以及经典的脱氧核糖核苷酸，即脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷。它还包括核酸的类似物，例如磷酸酯、2’O-甲基硫代磷酸酯、肽核酸(PNA；通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元，其核碱基附着在甘氨酸的α碳上)或锁核酸(LNA；由2’O、4’C亚甲基桥连的RNA结构单元)。杂交序列可以由任何上述核苷酸或其混合物组成。

在本说明书的上下文中，术语“序列同一性”和“序列同一性百分比”是指通过比较两个比对的序列而确定的值。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。用于比较的序列的比对可通过局部同源算法(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981))、全局比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970))、相似性搜索方法(Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988))或这些算法的计算机化工具来进行，这些计算机化工具包括但不限于CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。用于进行BLAST分析的软件是可公开获得的，例如通过国家生物技术信息中心网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。用于比较氨基酸序列的一实施例是使用默认设置的BLASTP算法：预期阈值：10；字长：3；查询范围中的最大匹配项：0；矩阵：BLOSUM62；缺口成本：存在11，扩展1；成分调整：条件合成分数矩阵调整。用于比较核酸序列的一个这样的实施例是使用默认设置的BLASTN算法：预期阈值：10；字长：28；查询范围中的最大匹配项：0；匹配/不匹配得分：1-2；缺口成本：线性。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性值是指使用BLAST程序套件(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))获得的值，其中使用上述确定的默认参数分别进行了蛋白质和核酸比较。

具体实施方式

本发明的第一方面提供了一种在治疗或预防心脏病的方法中使用的针对microRNA miR27b-5p的寡核酸试剂。

换言之，本发明的寡核酸试剂针对miRNA miR27b-5p(SEQ ID NO 002)或能够与miRNA miR27b-5p(SEQ ID NO 002)形成杂交体。

在某些实施方式中，寡核酸试剂以其成熟形式针对miR27b-5p miRNA。

在某些实施方式中，当将寡核酸试剂引入到哺乳动物的细胞中时，寡核酸试剂能够将细胞中的miR27b-5p miRNA水平降低(以百分比表示)至少10％至20％、至少30％至40％、至少50％至60％、至少70％至80％、至少90％至98％或至少99％。在某些实施方式中，在治疗或预防心脏病的方法中使用的寡核酸试剂包含序列ACC AAT CAG CTAAGCT(SEQ IDNO 001)或基本上由其组成。

本发明的寡核酸试剂由其序列限定；然而，本领域技术人员理解，通过交换一个或两个位置，特别是在通过引入核苷酸类似物增加与mRNA的结合的同时，可获得足够的结合特异性以实现本发明的效果。

在某些实施方式中，寡核酸试剂包含与miR27b-5p杂交的序列。试剂序列与SEQ ID001至少95％相同，特别是96％、97％、98％、99％或100％相同。在某些实施方式中，杂交序列包含脱氧核苷酸、硫代磷酸酯脱氧核苷酸、LNA和/或PNA核苷酸或其混合物。

在某些实施方式中，寡核酸试剂是反义寡核苷酸。

在某些实施方式中，寡核酸试剂包含LNA部分或基本上由其组成，并且包含约20个或更少的核苷酸。

在某些实施方式中，寡核酸试剂基本上由LNA部分组成，并由序列ACC AAT CAGCTA AGC T(SEQ ID NO 008)描述。在一特定的实施方式中，SEQ ID NO 008的核苷类似物通过磷酸酯连接。在一特定的实施方式中，SEQ ID NO 008的核苷类似物通过硫代磷酸酯连接。

在某些实施方式中，在治疗或预防心脏病的方法中使用的寡核酸试剂包含一个或多个肽核酸(PNA)部分或基本上由其组成。

在某些实施方式中，本发明包括一种对有此需要的受试者治疗或预防心脏病的方法，该方法包括向该受试者施用针对miRNA miR27b-5p的寡核酸试剂。

序列特异性化学修饰寡核苷酸可抑制miRNA miR27b-5p。在某些实施方式中，本发明的寡核酸试剂可包含锁核酸(LNA)，其中核酸的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰，该桥将核糖锁定在3’内构象中。类似地，本发明的寡核酸试剂可包含PNA部分。LNA和PNA与碱基匹配的DNA或RNA具有更高的结合能，从而导致更紧密的结合。这种结合可能会增加对互补miR27b-5p miRNA靶标的反义抑制。在某些实施方式中，本发明的寡核酸试剂可包含膦酸酯、硫代磷酸酯或磷酸酯-磷酸盐主链修饰。在某些实施方式中，本发明的寡核酸试剂可包含核糖核苷酸。可选地，本发明的寡核酸试剂可包含脱氧核糖核苷酸。在某些实施方式中，寡核酸试剂的杂交序列包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、硫代磷酸酯脱氧核苷酸、硫代磷酸酯核糖核苷酸和/或2’-O-甲基修饰硫代磷酸酯核糖核苷酸。在某些实施方式中，所述寡核酸试剂包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，特别是修饰的核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的修饰的一非限制性实施例是寡核苷酸主链中的硫代磷酸酯修饰键。核糖核苷酸的修饰的一非限制性实施例是2’-O至4’-C桥。在某些实施方式中，2/4C桥是五元、六元或七元桥连结构。

在某些实施方式中，所述寡核酸试剂是以中央DNA嵌段为特征的缺口聚物，所述中央DNA嵌段的序列与所述miR27b-5p miRNA互补，并且所述中央DNA嵌段的两侧(5’和3’)侧接有同样与所述miR27b-5p miRNA互补的抗核酸酶LNA序列。中央DNA嵌段含有RNase H激活域，即其是导致靶DNA水解的部分。在某些实施方式中，侧翼LNA被完全硫代磷酸化。

在某些实施方式中，寡核酸试剂包含12-20个核苷酸。在某些特定的实施方式中，寡核酸试剂包含14-16个核苷酸。

在某些实施方式中，根据本发明得到的寡核酸试剂的杂交序列包含14、15或16个核苷酸。

在某些实施方式中，缺口聚物的中央脱氧核糖核苷酸寡聚物嵌段包含至少5个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方式中，缺口聚物的中央脱氧核糖核苷酸寡聚物嵌段包含5-10个通过磷酸酯键或硫代磷酸酯键连接的脱氧核糖核苷。

在某些实施方式中，缺口聚物的中央脱氧核糖核苷酸寡聚物嵌段包含脱氧核糖核苷之间的磷酸盐主链。

在某些实施方式中，所述寡核酸试剂包含通过磷酸酯键连接的脱氧核糖核苷酸(5-10个)的中央嵌段或基本上由其组成，该中央嵌段的两侧侧接有2’-O修饰的核糖核苷酸或PNA寡聚物。在某些实施方式中，所述寡核酸试剂包含侧接有LNA核苷类似物的脱氧核糖核苷(5-10个)的中央嵌段或基本上由其组成。在某些特定的实施方式中，所述LNA核苷类似物通过硫代磷酸酯部分连接。

在某些实施方式中，本发明的寡核酸试剂包含序列ACCA-atcagcta-AGCT(SEQ IDNO 005)或基本上由其组成，其中大写字母表示核苷类似物(特别是LNA，更特别是通过硫代磷酸酯连接的LNA)，小写字母表示通过磷酸酯连接的DNA核苷，而核苷类似物与DNA核苷之间的连接是通过磷酸酯和硫代磷酸酯实现的。

在某些实施方式中，寡核酸试剂是核糖核酸试剂，特别是siRNA或shRNA。

在本说明书的上下文中，RNA干扰(RNAi)试剂是指导致其增强子RNA(eRNA)靶序列降解的核糖核苷酸寡聚物。

在某些实施方式中，本发明的RNAi试剂包含以下物质或由其组成：

-单链或双链干扰核糖核酸寡聚物或其前体，其包含与靶向增强子RNA分子互补的序列段；或者

-单链或双链反义核糖核酸或脱氧核糖核酸，其包含与靶向增强子RNA分子互补的序列段。

在某些实施方式中，与靶向增强子RNA分子互补的序列段是长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸的连续序列段。

在某些实施方式中，本发明的RNAi试剂包含但不限于小干扰RNA(siRNA)、短发夹状RNA(shRNA)、microRNA和非编码RNA等、吗啉代(磷酸二酰胺吗啉代寡聚物)和Dicer底物siRNA(DsiRNA，其被RNAseⅢ类内切核糖核酸酶Dicer切割成21-23个具有2-碱基3’-突出端的碱基双链体)、UsiRNA(UsiRNA是用非核苷酸无环单体修饰的双链siRNA，称为“非锁定核碱基类似物(UNA)”，其中核糖的两个相邻碳原子之间的键被除去)、包括rxRNA

在一些实施方式中，本发明的RNAi试剂包含核酸的类似物，例如磷酸酯、2’O-甲基硫代磷酸酯、肽核酸(PNA；通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元，其核碱基附着在甘氨酸的α碳上)或锁核酸(LNA；由2’O、4’C亚甲基桥连的RNA结构单元)。杂交序列可以部分地由任何上述核苷酸组成，其余的核苷酸是自然界中存在的“天然”核糖核苷酸，或者可以是不同类似物的混合物，或者可完全由一种类似物组成。

在某些实施方式中，寡核酸试剂与纳米颗粒、病毒和脂质复合物缀合或被其包裹。

在某些实施方式中，所述寡核酸试剂为包含中央脱氧核糖核苷酸寡聚物嵌段的缺口聚物，其中所述嵌段的两侧(5’和3’)侧接有核酸酶抗性核糖核苷酸类似物。

在本发明的范围内提供了一种在有此需要的患者中治疗或预防心脏病的方法，该方法包括向该患者施用根据本发明得到的寡核酸试剂。

类似地，提供了一种用于预防或治疗心脏病的剂型，其包含根据本发明得到的寡核酸试剂。

所述剂型可通过肠内给药，例如经鼻、颊、直肠、透皮或口服给药，或作为吸入剂或栓剂。或者，可通过肠外给药，例如采用皮下、静脉、肝内或肌肉注射的形式。任选地，可存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些实施方式中，在细胞环境内，足以减少miR27b-5p miRNA表达的寡核酸试剂的量为1nmol以下、200pmol以下、100pmol以下、50pmol以下、20pmol以下、10pmol以下、5pmol以下、2pmol以下或1pmol以下。

序列

SEQ ID NO 001(miR27b-5p靶向序列；5’-3’，和核苷酸化学)：

ACC AAT CAG CTA AGC T

SEQ ID NO 002(miR27b-5p)

GCAGAAC UUAGCCACUGU GAA

SEQ ID NO 003(AAV9-fl/fl-shMthfd1l；正义)：

TGAATGGTGTCAGAGAATTTTTCAAGAGAAAATTCTCTGACACCATTCTTTTTTC

SEQ ID NO 004(AAV9-fl/fl-shMthfd1l；反义)：

TCGAGAAAAAAGAATGGTGTCAGAGAATTTTCTCTTGAAAAATTCTCTGACACCATTCA

SEQ ID NO 005ACCA-atcagcta-AGCT(大写：核苷类似物，特别是通过硫代磷酸酯连接的LNA；小写：DNA；边界：磷酸酯或硫代磷酸酯)

SEQ ID NO 006(正向引物序列；mir27b)：GCATGCTGATTTGTGACTTGAG-3’

SEQ ID NO 007(反向引物序列；mir27b)：5-CCTCTGTTCTCCAAACTGCAG-3’

SEQ ID NO 008：(miR27b-5p靶向序列；5’-3’，LNA)：

ACC AAT CAG CTA AGC T

在本文中将单个可分离特征的替代方案呈现为“实施方式”；应当理解，这些替代方案可以自由地组合，以形成本文公开的本发明的分立实施方式。

通过以下实施例和附图进一步说明了本发明，从中可得出其他实施方式和优点。这些实施例旨在说明本发明，而非限制其范围。

附图说明

图1A-1B示出了F

图1C-1D示出了患有HCM和主动脉瓣狭窄的患者以及健康对照者(c)或者经假手术和TAC手术的小鼠(d)的左心室活检组织，并对其通过免疫印迹法评估了所指示的蛋白表达。

图1E-1F示出了患有HCM和主动脉瓣狭窄的患者相对于健康对照者的心室活检组织中的ADP/ATP比(e)，以及经TAC手术的小鼠相对于经假手术的动物的心室活检组织中的ADP/ATP比(f)。

图1G示出了患有主动脉瓣狭窄(AS)(n＝3)和肥厚型心肌病(HCM)(n＝3)的患者以及健康对照者(n＝3)的左心室纵切面，其经染色以使DAPI(蓝色)、层粘连蛋白(绿色)和α-肌动蛋白(红色)显现，并通过共聚焦显微镜成像。

图1H示出了如图1G中染色的心脏切面，并对其评估了单核、双核或多核心肌细胞的百分比。

图1I示出了经假手术(n＝3)和TAC手术(n＝3)的小鼠的左心室纵切面，其经染色以使DAPI(蓝色)、层粘连蛋白(绿色)和α-肌动蛋白(红色)显现，并通过共聚焦显微镜成像。

图1J示出了对如(i)中染色的心脏切面评估了其单核和多核心肌细胞的比率(对每个心脏中的2个切面进行了分析，且将每个切面中的2个区域用于定量；每组共分析了3个心脏)。

图1K示出了Cre介导的重组前后AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒的示意图(左图)和实验时间线(右图)。

图1L示出了使用抗指定蛋白质的抗体从用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图1M示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图1N示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图1O示出了如图1N中染色的心脏切面，并对其评估了单核、双核或多核心肌细胞的比率。

图1P示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图1Q示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图1R-1S示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图2A示出了MIR27B在患有肥厚型心肌病(HCM)或主动脉瓣狭窄(AS)的患者中的表达。

图2B示出了用AAV9-fl/fl-mir27b转导的Mlc2v-cre小鼠的实验时间线示意图。

图2C示出了注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

图2D示出了用AAV9-fl/fl-mir27b病毒转导的Mlc2v-cre

图2E-2F示出了注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

图2G示出了成熟的miR27b-5p和miR27b-3p在注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

图2H示出了使用抗指定蛋白质的抗体从如图2C-G中转导的Mlc2v-cre

图2J示出了如图2I中染色的心脏切面，并对其评估了单核和多核心肌细胞的比率。

图2K示出了在经假手术和TAC手术的小鼠中所进行的拮抗剂研究示意图。基线超声心动图测量在第5天进行，假手术或TAC手术在第0天进行，scrRNA和miR27b-5p LNA在手术后第49-52天通过腹腔(i.p)给送，并在指定的时间点通过超声心动图进行监测。

图2L-2M示出了左心室(图2L)和H&E染色(图2M)组织切片的代表性图像。

图2N-2P示出了经假手术或TAC手术并用加扰LNA(scrLNA)或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠的LVW/BW(图2N)、左心室收缩末期内径(LVID；s)(图2O)和射血分数(图2P)的纵向监测结果。

图2Q-2T示出了成熟的miR27b-5p(图2Q)、miR27b-3p(图2R)、Nppa和Nppb(图2S)以及Atp5a1 mRNA(图2T)在经scrLNA或miR27b-5p LNA处理并经通过qPCR所进行的假手术或TAC手术的C57BL/6J小鼠中的相对表达。

图2U示出了使用抗指定蛋白质的抗体从经假手术和TAC手术并用scrRNA或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠的心室裂解物得到的免疫印迹。

图2V示出了经假手术和TAC手术的小鼠的左心室纵切面，其中scrLNA或miR27b-5pLNA经染色以使DAPI(蓝色)、层粘连蛋白(绿色)和α-肌动蛋白(红色)显现，且通过共聚焦显微镜成像。

图2W示出了对如(v)中染色的心脏切面评估了其单核和多核心肌细胞的比率。

图2X示出了Kaplan-Meier存活曲线，比较了经假手术或TAC手术的小鼠与经scrLNA或miR27b-5p LNA处理的小鼠之间的死亡率。在经假手术的动物中未观察到有死亡的。

图3A是从头嘌呤生物合成途径的示意图，其示出了糖酵解和1-碳代谢的贡献。

图3B示出了如所示转导和处理的NRC中甲酸酯的相对量。

图3C示出了如所示转导和处理的NRC中相对的线粒体ADP/ATP比。

图3D示出了在如所示转导和处理的NRC中相对代谢物丰度的热图。与相应的对照处理组相比，所描绘的代谢物在至少一个处理组(每组有n＝4个生物学重复)中满足“log

图3E示出了在如所示转导和处理的NRC中的核酸内掺入的[

图4A-4F示出了用碘化丙啶(PI)将如所示转导和处理的NRC染色，并通过与成像(a,c,e)结合的流式细胞术来评估该NRC的多倍性，且根据图像(b,d,f)来定量该NRC的多核化。

图4G-4I示出了对在如所示转导和处理的NRC中掺入[

图5A示出了经假手术或TAC手术并用AAV9-fl/fl-shMthfd1l转导的Mlc2v-cre小鼠的实验时间线示意图。

图5B示出了经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图5C示出了对如(b)中染色的心脏切面评估了其单核和多核心肌细胞的比率。

图5D示出了经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图5E示出了经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图5F-5G示出了经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图5H示出了使用抗指定蛋白质的抗体从经假手术或TAC手术并如(b-g)中转导的Mlc2v-cre

图5I示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre小鼠的实验时间线示意图。

图5J示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图5K示出了对如(j)中染色的心脏切面评估了其单核和多核心肌细胞的比率。

图5L示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图5N-5O示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图5P示出了使用抗指定蛋白质的抗体从如j-p中转导的Mlc2v-cre

图6A示出了使用抗指定蛋白质的抗体得到的异位表达组成型活性形式的AMPKαl的NRC的免疫印迹。

图6B示出了使用对照IgG或抗AMPKα的抗体得到的异位表达组成型活性形式的AMPKαl的NRC的免疫沉淀(IP)。用p-AMPKα和p-Rb抗体将IP印迹。

图6C示出了使用抗指定蛋白质的抗体得到的异位表达HIF1α△ODD并经DMSO或AMPK抑制剂化合物C(CC)处理的NRC的免疫印迹。

图6D示出了使用对照IgG或抗AMPKα的抗体得到的异位表达HIF1α△ODD并经DMSO或AMPK抑制剂CC处理的NRC的免疫沉淀。用p-AMPKα和p-Rb抗体将IP印迹。

图6E示出了使用抗p-Rb和总Rb的抗体从经假手术或TAC手术并用scrRNA或miR27b-5p LNA处理的小鼠的心室裂解物得到的免疫印迹。

图6F示出了使用抗p-Rb和总Rb的抗体从注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

图6G示出了使用抗p-Rb和总Rb的抗体从注射有AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒的Mlc2v-cre

图6H示出了使用抗p-Rb和总Rb的抗体从经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图6I示出了使用抗p-Rb和总Rb的抗体从用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图6J示出了使用抗p-Rb和总Rb的抗体从患有HCM和主动脉瓣狭窄的患者以及健康对照者的心室裂解物得到的免疫印迹。图6K示出了指定基因在经假手术或TAC手术并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的小鼠的心室裂解物中的相对表达的热图。图6L示出了指定基因在注射有AAV9-fl/fl-mir27b的Mlc2v-cre

图6M示出了指定基因在经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图6N显示了指定基因在患有HCM和主动脉瓣狭窄的患者以及健康对照者的心室裂解物中的相对表达的热图。

图6O示出了E2F荧光素酶报告基因在如所示感染和处理的NRC中的转染。将数据归一化至受感染的对照NRC(设为1.0)。图6P示出了E2F荧光素酶报告基因在如所示感染的NRC中的转染。将数据归一化至受感染的对照NRC(设为1.0)。

图6Q示出了F

图7a示出了图1a(左图)中所示的ATP合酶亚基基因与NPPB表达的皮尔逊相关系数(对于健康对照者，n＝4；对于AS患者，n＝10；对于HCM患者，n＝11)。

图7b示出了经假手术和TAC手术的动物的心室裂解物中ATP水平的定量结果(对于假手术者，n＝5；对于TAC手术者，n＝6；所示数据为平均值±SEM；

图7c示出了将患有HCM(n＝3)和主动脉瓣狭窄(n＝3)的患者以及健康对照者(n＝3)的左心室切面用苏木精和曙红(H&E)染色，并通过光学显微镜成像(检查了每个心脏的2个切面(每个切面有2个区域)，并示出了代表性区域)。比例尺为200μm。图7d示出了将经假手术(n＝3)和TAC手术(n＝3)的小鼠的左心室切面用H&E染色，并通过光学显微镜成像(检查了每个心脏的3个切面(每个切面有3-5个区域)，并示出了代表性区域)。比例尺为200μm。

图7e示出了从经假手术和TAC手术的小鼠中分离出心肌细胞，并将其染色以使DAPI和α-肌动蛋白显现。通过共聚焦显微镜对细胞成像，并示出每组3只小鼠的代表性z轴叠加图像。比例尺为20μm。

图7f示出了对如(e)中染色的成年心肌细胞评估了其单核与多核心肌细胞的比率(从每组n＝3只小鼠中至少定量了130个细胞)。

图7g示出了经假手术和TAC手术的小鼠的HW/BW(对于假手术者，n＝5；对于TAC手术者，n＝6；

图7h、7i示出了经假手术和TAC手术的小鼠的H&E(h)和天狼猩红(i)染色组织切片的代表性图像。比例尺为500μm。

图7j示出了Col1a1、Col3a1和TGFb1 mRNA在经假手术和TAC手术的小鼠的左心室裂解物中的相对表达。将数据归一化至经假手术的动物(设为1.0)(对于假手术者，n＝5；对于TAC手术者，n＝6；所示数据为平均值±SEM；

图8a示出了Atp5a1 mRNA在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图8b示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图8c示出了将注射有AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒的Mlc2v-cre

图8d示出了从注射有AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒的Mlc2v-cre

图8e示出了对如(d)中染色的成年心肌细胞评估了其单核与多核心肌细胞的比率(从每组n＝3只小鼠中至少定量了150个细胞)。

图8f示出了Nppa和Nppb mRNA在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图8g示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1转导的Mlc2v-cre

图8h示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒转导的Mlc2v-cre

图8i示出了Col1a1、Col3a1和TGFb1 mRNA在用AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒转导的Mlc2v-cre

图8j示出了ATP5A1 mRNA在用表达非沉默shRNA(nsRNA)或抗ATP5A1的shRNA(shATP5A1)的慢病毒转导的iPSC衍生人类心肌细胞(iPSC-hCM)中的相对表达。将数据归一化至表达nsRNA的对照NRC(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图8k示出了用表达nsRNA或shATP5A1的慢病毒转导的iPSC-hCM中的ADP/ATP比(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图8l、8m示出了用表达nsRNA或shATP5A1的慢病毒转导的iPSC-hCM中ADP(l)和ATP(m)水平的定量结果(对于两组，n＝3；所示数据为平均值±SD；

图8n示出了用表达nsRNA或shATP5A1的慢病毒转导的iPSC-hCM经染色以使DAPI和鬼笔环肽显现，并通过共聚焦显微镜成像。该图中示出了3个生物学重复的代表性区域。比例尺为20μm。

图8o示出了如(n)中处理的iPSC-hCM中多核细胞百分比的定量结果(n＝3个生物学重复，在每个实验和条件下分析约100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图8p示出了使用ImageJ评估如(n)中处理的iPSC-hCM的细胞大小(n＝3个独立实验，在每个实验和条件下分析约100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图8q示出了Atp5a1 mRNA在用表达nsRNA或shAtp5a1的慢病毒转导的NRC中的相对表达。将数据归一化至表达nsRNA的对照NRC(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图8r示出了通过免疫印迹法评估用nsRNA或shAtp5a1转导的NRC中的Atp5a1蛋白水平。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。图8s示出了如所示用表达nsRNA或Atp5a1 shRNA的慢病毒转导的NRC中的ADP/ATP比(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图8t、8u示出了用表达nsRNA或Atp5a1 shRNA的慢病毒转导的NRC中ADP(t)和ATP(u)水平的定量结果(对于两组，n＝3；所示数据为平均值±SD；

图8v示出了用表达nsRNA或Atp5a1 shRNA的慢病毒转导的NRC经染色以使鬼笔环肽和DAPI显现，并通过共聚焦显微镜成像。该图中示出了n＝3个生物学重复的代表性区域。比例尺为20μm。

图8w示出了如(v)中处理的NRC中多核细胞百分比的定量结果(n＝3个生物学重复，在每个实验和条件下分析约100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图8x示出了用ImageJ评估如(v)中处理的NRC的细胞大小(n＝3个独立实验，在每个实验和条件下分析约100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图8y示出了对在用表达nsRNA或Atp5a1 shRNA的慢病毒转导的NRC中掺入[

图9a、9b示出了Atp5a1 mRNA在经假手术或TAC手术的对照(Hif1αfl/fl)小鼠和Hif1αcKO小鼠(a)或者对照(Vhl fl/fl)小鼠和Vhl cKO小鼠(b)的心室中的相对表达。将数据归一化至对照小鼠(设为1.0)(对于(a)和(b)，每组有n＝5只小鼠；所示数据为平均值±SEM；

图9c示出了对经假手术或TAC手术的对照(Hif1αfl/fl)小鼠和Hif1αcKO小鼠(左图)或者对照(Vhl fl/fl)小鼠和Vhl cKO小鼠(右图)的心室裂解物进行处理，以用抗Hif1α和Atp5a1的抗体执行免疫印迹法。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图9d、9e示出了对照(Hif1αfl/fl)小鼠和经假手术或TAC手术的心室特异性Hif1α条件性基因敲除(Hif1αcKO)小鼠(d)的左心室活检组织中ATP含量(d)和射血分数(e)的定量结果(对于(d)和(e)，每组有n＝5只小鼠；所示数据为平均值±SEM；

图9f、9g示出了心室特异性Vhl条件性基因敲除(Vhl cKO)小鼠和相应对照(Vhlfl/fl)小鼠(g)的左心室活检组织中ATP含量(f)和射血分数(g)的定量结果(对于(f)和(g)，每组有n＝5只小鼠；所示数据为平均值±SEM；

图9h示出了含有推定的HRE的miRNA在其启动子中的表达(在技术性四重测定之间，p<0.0001；在生物性三重测定时，p<0.05，且平均信号强度为背景的1倍)，其中所述启动子来自经TAC手术的Hif1αcKO小鼠相对于经TAC手术的对照动物或者Vhl cKO小鼠相对于对照动物的心室裂解物。

图9i示出了mir27b、Vegfa和Ldha mRNA在经假手术或TAC手术的对照(Hif1αfl/fl)小鼠和Hif1αcKO小鼠的心室中的相对表达。将数据归一化至经假手术的对照小鼠(设为1.0)(每组有n＝5只小鼠；所示数据为平均值±SEM；

图9j示出了mir27b RNA在对照(Vhl fl/fl)小鼠和Vhl cKO小鼠的心室中的相对表达。将数据归一化至对照小鼠(设为1.0)(每组有n＝5只小鼠；所示数据为平均值±SEM；

图9k-9m示出了AmpO(k)、成熟的miR27b-3p、miR23b-3p和miR24-3p(l)以及miR27b-5p、miR23b-5p和miR24-5p(m)在经假手术或TAC手术的野生型C57BL/6J小鼠的心室裂解物中的相对表达水平。将数据归一化至经假手术的对照小鼠(设为1.0)(对于假手术者，n＝5；对于TAC手术者，n＝8；所示数据为平均值±SEM；

图9n-9p示出了AmpO(n)、成熟的miR27b-3p、miR23b-3p和miR24-3p(o)以及miR27b-5p、miR23b-5p和miR24-5p(p)在异位表达空白对照载体或HIF1α△ODD的NRC中的相对表达。将数据归一化至用空白对照载体转导的NRC(设为1.0)(每组有n＝5个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图9q示出了对在用T3或PBS(模拟)处理的NRC中掺入[

图9r-9t示出了AmpO(r)、成熟的miR27b-3p、miR23b-3p和miR24-3p(s)以及miR27b-5p、miR23b-5p和miR24-5p(t)在用PBS(模拟)或T3处理的NRC中的相对表达。将数据归一化至模拟处理的NRC(设为1.0)(每组有n＝5个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图9u示出了Hif1α、mir27b、Glut1和Vegfa mRNA在用T3刺激并用非沉默对照shRNA(nsRNA)或抗Hif1α的shRNA(shHif1α)转导的NRC中的相对表达。将数据归一化至感染了nsRNA的对照NRC(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图9v示出了人、猴、负鼠、大鼠和小鼠的mir27b启动子的序列，其所含有的保守的HRE位于前体mir27b转录起始位点上游的162bp处。HRE以红色显示，且核心HRE基序大写。

图9w示出了与荧光素酶融合的野生型(wt)或HRE突变型(mut)mir27b启动子与不同剂量的空白对照载体或HIF1α△ODD的共转染。将数据归一化至用空白对照载体转染的野生型启动子(设为1.0)(每组有n＝4个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图9x示出了与荧光素酶融合的mir23b和mir24-1启动子与不同剂量的空白载体对照物或HIF1α△ODD的共转染。将数据归一化至用空白对照载体转染的荧光素酶载体(设为1.0)(每组有n＝4个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图9y示出了用表达nsRNA或抗Vhl的shRNA(shVhl)的慢病毒来转导NRC，并将其处理，以用HIF1α特异性抗体(IP:HIF1α)或对照同型匹配抗体(IgG对照)进行染色质免疫沉淀。通过qPCR分析了Hif1α启动子的结合。所示数据相对于用lg对照抗体对表达nsRNA的NRC的核裂解物进行的染色质免疫沉淀(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图9z示出了通过免疫印迹法评估用nsRNA或shVhl转导的NRC中的Hif1α和Vhl蛋白水平。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图10a示出了人和小鼠的Atp5a1的3’UTR中的靶基因识别基序。通过比对指示miR27b-5p种子序列和Atp5a1上的相应靶区。

图10b示出了野生型(wt)或与荧光素酶融合的mir27b结合位点突变型(mut)Atp5a1 3’UTR与不同剂量的对照物、mir27b-3p或mir27b-5p模拟物的共转染。将数据归一化至用对照模拟物转染的野生型启动子(设为1.0)(每组有n＝4个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图10c示出了通过免疫印迹法评估用空白对照载体或异位mir27b转导的NRC中的Atp5a1蛋白水平。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图10d、10e示出了mir27b前体(d)和成熟的mir27b-3p和mir27b-5p(e)在异位表达空白对照载体或mir27b的NRC中的相对表达。将数据归一化至用空白对照载体转导的NRC(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图10f示出了Atp5a1 mRNA在用不同浓度的对照物、miR27b-3p和miR27b-5p模拟物转染的NRC中的相对表达水平。将数据归一化至对照模拟物(设为1.0)(每组有n＝3个重复；所示数据为平均值±SD；

图10g、10h示出了成熟的miR27b-5p(g)和miR27b-3p(h)在用空白载体对照物或HIF1α△ODD转导并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的NRC中的相对表达。将数据归一化至用空白对照载体转导的NRC(设为1.0)(每组有n＝5个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图10i示出了用表达空白对照载体的慢病毒或HIF1α△ODD转导并用加扰对照LNA(scrLNA)或miR27b-5p LNA处理的NRC中Hif1α和Atp5a1表达的免疫印迹。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图10j、10k示出了在存在scrRNA或miR27b-5p LNA的情况下，成熟的miR27b-5p(j)和miR27b-3p(k)在用PBS(模拟)或T3处理的NRC中的相对表达。将数据归一化至模拟处理的细胞(设为1.0)(每组有n＝5个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图10l示出了在存在scrRNA或miR27b-5p LNA的情况下，评估用PBS(模拟)或T3处理的NRC中的Hif1α、miR27b和Atp5a1 RNA水平。将数据归一化至用scrLNA处理的NRC(设为1.0)(每组有n＝4个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图10m示出了通过免疫印迹法评估如(l)中处理的NRC中的Atp5a1蛋白水平。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图10n、10o示出了如所示转导和处理的NRC中ATP合酶的酶活性。将数据归一化至对照组(设为1.0)(每组有n＝5个生物学重复；所示数据为平均值±SEM；

图10p示出了通过免疫印迹法评估用空白对照载体或异位ATP5A1转导的NRC中的Atp5a1蛋白水平。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图11a示出了Nppa和Nppb mRNA在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-mir27b转导的Mlc2v-cre

图11b示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-mir27b转导的Mlc2v-cre

图11c示出了Atp5a1 mRNA在通过qPCR注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-mir27b转导的Mlc2v-cre

图11d示出了将用AAV9-fl/fl-mir27b转导的Mlc2v-cre

图11e示出了从注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

图11f示出了对如(e)中染色的成年心肌细胞评估了其单核与多核心肌细胞的比率(从每组n＝3只小鼠中至少分析了160个细胞)。

图11g示出了用AAV9-fl/fl-mir27b病毒转导的Mlc2v-cre

图11h示出了Col1a1、Col3a1和TGFb1 mRNA在注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

图11i示出了对经假手术或TAC手术并用加扰LNA(scrLNA)或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠的主动脉速度的纵向监测结果。图中的箭头表示LNA注射(对于假scrLNA，n＝5；对于假miR27b-5p LNA，n＝5；对于TAC scrLNA，n＝7；对于TAC miR27b-5p LNA，n＝8；所示数据为平均值±SEM)。

图11j示出了将经假手术或TAC手术并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠的左心室切面用H&E染色，并通过光学显微镜成像(检查了每个心脏的3个切面(每个切面有2-4个区域)，并示出了代表性区域；每组共分析了3个心脏)。比例尺为200μm。

图11k示出了从经假手术或TAC手术并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠中分离出心肌细胞，并将其染色以使DAPI和α-肌动蛋白显现。通过共聚焦显微镜对细胞成像，并示出每组3只小鼠的代表性z轴叠加图像。比例尺为20μm。

图11l示出了对如(d)中染色的成年心肌细胞评估了其单核与多核心肌细胞的比率(从每组n＝3只小鼠中至少分析了150个细胞)。

图11m示出了经假手术或TAC手术并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠的天狼猩红染色组织切片的代表性图像。比例尺为500μm。

图11n示出了Col1a1、Col3a1和TGFb1 mRNA在用scrLNA或miR27b-5p LNA处理并经通过qPCR所进行的假手术或TAC手术的C57BL/6J小鼠的左心室裂解物中的相对表达。将数据归一化至用scrLNA处理并经假手术的小鼠(设为1.0)(对于假scrLNA，n＝5；对于假miR27b-5p LNA，n＝5；对于TAC scrLNA，n＝7；对于TAC miR27b-5p LNA，n＝8；所示数据为平均值±SEM；

图12a示出了Mthfd1l mRNA在表达空白对照载体或异位MTHFD1L的NRC中的相对表达。将数据归一化至表达空白对照载体的NRC(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示结果为平均值±SD；

图12b示出了使用抗Mthfd1l的抗体得到的用表达空白对照载体或MTHFD1L的慢病毒转导的NRC的免疫印迹。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图12c-12h示出了如所示转导和处理的NRC中ATP(c,e,g)和ADP(d,e,h)水平的定量结果(每组有n＝4个生物学重复；所示结果为平均值±SD；

图13a示出了对在用T3刺激并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的NRC中掺入[

图13b示出了甲酸酯在用T3刺激并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的NRC中的相对量(每组有n＝5个生物学重复；所示结果为平均值±SEM；

图13c示出了在用T3刺激并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的NRC中的相对ADP/ATP比(每组有n＝5个生物学重复；所示结果为平均值±SEM；

图13d示出了在用T3刺激并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的NRC中相对代谢物丰度的热图。与相应的对照组相比，所描绘的代谢物在至少一个处理组(每组有n＝4个生物学重复)中满足“log

图14a示出了注射有scrLNA或mir27b-5p L C57BL/6J miceNA并经假手术或TAC手术的C57BL/6J小鼠的左心室代谢物的差异分析结果；圆圈反映了-log

图14b示出了一式两份测量(每组有n＝6个生物学重复)的指定样本中代谢物的层次聚类分析结果。

图15a示出了指示队列的主成分分析(PCA)结果。

图15b、15c示出了分别对具有活性的(加扰，b)或LNA介导的抑制的miR27b-5p(c)的经假手术或TAC手术的小鼠的左心室样本进行主成分分析的结果。箭头所示脂质种类可解释PC1所涵盖的15％的差异(非参数Wilcoxon符号秩检验；每组n＝5)。

图15d示出了在所示四个队列中饱和度分布的条形图(平均值+/-标准差)。根据双键(db)的数量将脂质分组，所有超过6db的种类都聚集在一个单独的组中(6+)。分析的脂质包括以下19类脂质：胆固醇酯(CE)、神经酰胺(Cer)、胆固醇(Choi)、心磷脂(CL)、二酰甘油(DAG)、溶血磷脂(LPA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、醚连接的LPE(LPE-O

图15e示出了在四个所示队列中总长度分布的条形图(平均值+/-SD)。将脂质(如d中所分析)根据其酰基链的总长度(即碳原子数)进行分组。显著性比较用星号表示(调节p值<0.001

图15f示出了从用scrLNA处理并经TAC手术的小鼠的左心室活检组织中脂质种类的平均摩尔百分比丰度中减去经假手术的对照小鼠中脂质种类的平均摩尔百分比丰度后所得到的结果。

图15g示出了从注射有miR27b-5p LNA并经TAC手术的小鼠中脂质种类的平均摩尔百分比丰度中减去具有抑制的(LNA)miR27b-5p的经假手术的对照小鼠中脂质种类的平均摩尔百分比丰度后所得到的结果。

图15h示出了所示mRNA在用scrLNA或miR27b-5p LNA处理并经通过qPCR所进行的假手术或TAC手术的C57BL/6J小鼠中的相对表达。将数据归一化至用scrLNA处理并经假手术的小鼠(设为1.0)(对于假scrLNA，n＝5；对于假miR27b-5p LNA，n＝5；对于TAC scrLNA，n＝7；对于TAC miR27b-5p LNA，n＝8；所示数据为平均值±SEM；

图15i示出了在经假手术或TAC手术并用scrLNA或miR27b-5p LNA处理的C57BL/6J小鼠的左心室活检组织中测量了[1-

图16a、16b示出了用PBS或10μM ADP处理了3天的NRC中ADP(a)和ATP(b)水平的定量结果(每组有n＝4个生物学重复；所示结果为平均值±SD；

图16c、16d示出了用PBS或20nM寡霉素处理的NRC中ADP(c)和ATP(d)水平的定量结果(每组有n＝3个生物学重复；所示结果为平均值±SD；

图16e示出了用PBS或10μM ADP处理了3天的NRC经染色以使DAPI和α-肌动蛋白显现，并通过共聚焦显微镜成像。该图中示出了三个独立实验的代表性区域。比例尺为5μm。

图16f示出了用PBS或寡霉素处理的NRC经染色以使DAPI和α-肌动蛋白显现，并通过共聚焦显微镜成像。对每个条件和实验平均选取了4个区域进行成像，并示出了三个独立实验的代表性区域。比例尺为50μm。

图16g、16h示出了对如(e,f)中处理和成像的NRC评估了其多核化(在n＝3个独立实验中，对每个样本至少定量了110个细胞；所示结果为平均值±SD；

图16i、16j示出了用ImageJ评估如(e,f)中处理和成像的NRC的细胞表面积(在n＝3个独立实验中，对每个样本至少定量了110个细胞；所示结果为平均值±SD；

图17a-17d示出了用所示慢病毒转导的NRC经染色以使心脏特异性标记α-肌动蛋白、DAPI和磷酸化组蛋白H3(p-组蛋白H3)显现，用于评估细胞的有丝分裂，并通过共聚焦显微镜成像。对p-组蛋白H3阳性心肌细胞进行了定量。对于每个条件，分析了3个生物学重复(对于每个生物学重复，选取了3-4个区域)，并示出了代表性区域。比例尺为100μm。

图17e示出了Mthfd1l mRNA在表达nsRNA或shMthfd1l的NRC中的相对表达。将数据归一化至表达nsRNA的NRC(设为1.0)(每组中有n＝3个生物学重复；所示结果为平均值±SD；

图17f示出了使用抗Mthfd1l的抗体得到的用表达nsRNA或shMthfd1l的慢病毒转导的NRC的免疫印迹。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图17g、17h示出了用所示慢病毒转导的NRC经染色以使心脏特异性标记α-肌动蛋白、DAPI和磷酸化组蛋白H3(p-组蛋白H3)显现，用于评估细胞的有丝分裂，并通过共聚焦显微镜成像。对p-组蛋白H3阳性心肌细胞进行了定量。对于每个条件，分析了3个生物学重复(对于每个生物学重复，选取了3-4个区域)，并示出了代表性区域。比例尺为100μm。

图18a示出了将经假手术或TAC手术并用AAV9-fl/fl-shMthfd1l转导的Mlc2v-cre

图18b示出了经假手术或TAC手术的Mlc2v-cre

图18c、18d示出了经假手术或TAC手术的Mlc2v-cre

图18e示出了从经假手术或TAC手术并用AAV9-fl/fl-shMthfd1l转导的Mlc2v-cre

图18f示出了对如(e)中染色的成年心肌细胞评估了其单核与多核心肌细胞的比率(从每组n＝3只小鼠中至少分析了150个细胞)。

图18g示出了经假手术或TAC手术并用AAV9-fl/fl-shMthfd1l转导的Mlc2v-cre

图18h示出了Col1a1、Col3a1和TGFb1 mRNA在经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

图18i示出了将用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图8j示出了从用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒共转导的Mlc2v-cre

图18k示出了对如(n)中染色的成年心肌细胞评估了其单核与多核心肌细胞的比率(从每组n＝3只小鼠中至少分析了150个细胞)。

图8l示出了在注射AAV9 11周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图18m-18o示出了Nppa和Nppb(m)、Atp5a1(n)以及Mthfd1l mRNA(o)在注射AAV911周后用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l共转导的Mlc2v-cre

图18p示出了用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒共转导的Mlc2v-cre

图8q示出了Col1a1、Col3a1和TGFb1 mRNA在用AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒共转导的Mlc2v-cre

图19a、19b示出了Ccnd1(a)和Ccne1(b)mRNA在如所示处理的NRC中的相对表达。将数据归一化至用非沉默siRNA转染的对照感染细胞(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图19c示出了用表达空白载体对照物或HIF1a△ODD的慢病毒转导并如所示转染的NRC经染色以使DAPI、Ki67和α-肌动蛋白显现，并通过共聚焦显微镜成像。对每个条件和实验平均选取了4个区域进行成像，并示出了三个独立实验的代表性区域。比例尺为50μm。

图19d、19e示出了如(c)中处理的NRC中多核细胞(d)和Ki67阳性细胞(e)的百分比定量结果(n＝3个独立实验，在每个实验和条件下分析了至少100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图19f示出了使用ImageJ评估如(c)中处理的NRC的细胞大小(n＝3个独立实验，在每个实验和条件下分析了至少100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图19g示出了Cdkn1b mRNA在如所示处理的NRC中的相对表达。将数据归一化至用非沉默siRNA转染的细胞(设为1.0)(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD；

图19h示出了用非沉默siRNA或Cdkn1b siRNA转染的NRC经染色以使DAPI、Ki67和α-肌动蛋白显现，并通过共聚焦显微镜成像。对每个条件和实验平均选取了4个区域进行成像，并示出了三个独立实验的代表性区域。比例尺为50μm。

图19i、19j示出了如(h)中处理的NRC中多核细胞(i)和Ki67阳性细胞(j)的百分比定量结果(n＝3个独立实验，在每个实验和条件下分析了至少100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图19k示出了使用ImageJ评估如(h)中处理的NRC的细胞大小(n＝3个独立实验，在每个实验和条件下分析了至少100个细胞；所示数据为平均值±SD；

图20a示出了Aldh1l1 mRNA在经通过qPCR所进行的假手术或TAC手术的C57BL/6J小鼠的左心室活检组织中的相对表达。将数据显示为相对于Hprt1的2^-dCt(对于假手术者，n＝5；对于TAC手术者，n＝7；所示数据为平均值±SEM；

图20b示出了ALDH1L1 mRNA在患有肥厚型心肌病(HCM)和主动脉瓣狭窄(AS)的患者相对于健康对照者的左心室活检组织中的相对表达。将数据显示为相对于HPRT1的2^-dCt(对于健康对照者，n＝4；对于AS患者，n＝10；对于HCM患者，n＝11；所示数据为平均值±SEM)。

图20c示出了NADPH在如所示处理的NRC中的定量结果。将所有数值均归一化至蛋白质含量(每组有n＝3个生物学重复；所示数据为平均值±SD)。

图20d示出了使用甲基化赖氨酸抗体从患有HCM和主动脉瓣狭窄的患者以及健康对照者的左心室裂解物得到的免疫印迹。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

图20e-20j示出了用甲基化赖氨酸抗体从如所示处理的小鼠的左心室裂解物得到的免疫印迹。将负荷归一化至心脏肌动蛋白。

表1.注射有AAV9-fl/fl-shAtp5a1病毒的Mlc2v-cre

IVS表示舒张期(d)和收缩期(s)时的室间隔厚度；LVID表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室内径；LVPW表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室后壁厚度；FS表示缩短分数；EF表示射血分数；LVW/BW表示左心室重量/体重；HW/BW表示心脏重量/体重。所示数值为平均值±s.e.m.；

表2.注射有AAV9-fl/fl-mir27b病毒的Mlc2v-cre

IVS表示舒张期(d)和收缩期(s)时的室间隔厚度；LVID表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室内径；LVPW表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室后壁厚度；FS表示缩短分数；EF表示射血分数；LVW/BW表示左心室重量/体重；HW/BW表示心脏重量/体重。所示数值为平均值±s.e.m.；

表3.经假手术或TAC手术并注射有scrLNA或miR27b-5p LNA的小鼠的超声心动图分析

LVID表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室内径；LVPW表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室后壁厚度；FS表示缩短分数；EF表示射血分数；LVW/BW表示左心室重量/体重；HW/BW表示心脏重量/体重。所示数值为平均值±s.e.m.；

表4.经假手术或TAC手术并注射有AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

IVS表示舒张期(d)和收缩期(s)时的室间隔厚度；LVID表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室内径；LVPW表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室后壁厚度；EF表示射血分数；LVW/BW表示左心室重量/体重；HW/BW表示心脏重量/体重。所示数值为平均值±s.e.m.；

表5.共注射有AAV9-fl/fl-shAtp5a1和AAV9-fl/fl-shMthfd1l病毒的Mlc2v-cre

IVS表示舒张期(d)和收缩期(s)时的室间隔厚度；LVID表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室内径；LVPW表示舒张期(d)和收缩期(s)时的左心室后壁厚度；FS表示缩短分数；EF表示射血分数；LVW/BW表示左心室重量/体重；HW/BW表示心脏重量/体重。所示数值为平均值±s.e.m.；

为了确定人和小鼠的病理性心脏肥大中ATP耗竭的介质，我们绘制了人HCM和AS患者的活检组织中以及经TAC手术的小鼠中ATP合酶复合物的所有亚基的mRNA水平(图1a、1b和图7a)。在所分析的亚基中，ATP5A1 mRNA和蛋白在人和小鼠心脏肥大中均持续减少，并且与肥大标志物利钠肽A(NPPA)、利钠肽B(NPPB)以及超声心动图测量的心脏形态和功能的疾病指标的上调显著相关(图1a-1d和图7a)。ATP5A1水平的这些变化通过在人和小鼠的患病心肌的Thr172处磷酸化的增强而与AMP活化蛋白激酶(AMPK)的激活相关，由此导致其直接靶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化并使其下游失活(图1c、1d)。至关重要的是，AMPK尽管在历史上被说成是一种AMP活化激酶，但其实际上更敏感，且主要被ADP活化。与抑制的ATP5A1表达和AMPK激活一致，在患病的人和小鼠的左心室活检组织中ADP:ATP比值升高(图1e、1f和图7b)。此外，在人的左心室AS和HCM活检组织中观察到显示多核化的心肌细胞分数增加(图1g、1h和图7c)。在小鼠中，TAC手术后也观察到多核细胞分数的增加(图1i、1j和图7d-7f)。TAC方案通过以手术方式收缩小鼠的主动脉来模拟人的主动脉瓣狭窄，从而导致进入心室的血流速度加快而施加压力超负荷应力，由此导致病理性心脏生长和纤维化，表现为天狼猩红染色物的增加以及纤维化标记基因I型胶原α1(Col1a1)、I型胶原α3(Col3a1)和转化生长因子β1(TGF1b)的表达增加，正如在人类主动脉瓣狭窄中所遇到的那样(Barrick,C.J.等人,2007,Am J Physiol Heart Circ Physiol,292,2119-2130)(图7g-7j)。

为了理解ATP5A1耗竭的生理意义，我们使用了一种新的基于腺相关病毒(AAV)9的系统进行体内心室特异性转基因(Mirtschink,P.等人,2015,Nature,522,444-449)。简言之，含有TATA-lox侧翼基因或短发夹状RNA(shRNA)的AAV的递送赋予Cre重组酶(Cre)依赖性，其在递送到组织特异性Cre转基因小鼠后会导致组织特异性异位基因或shRNA表达(Sauer,B.等人,1988,Proc Natl Acad Sci USA,85,5166-5170)。含有靶向Atp5a1的shRNA的AAV9(AAV9-fl/fl-shAtp5a1)被递送至在心室心肌中特异性表达Cre重组酶的Mlc2v-Cre转基因小鼠(Chen，J.等人,1998,Development,125,1943-1949)(图1k)。AAV9-fl/fl-shAtp5a1的递送导致了Atp5a1 mRNA和蛋白质表达的降低(图11和图8a)，同时激活了Ampk并增强了其下游靶Acc的磷酸化(图11)，提高了ADP:ATP水平(图1m和图8b)，促进了心肌细胞多核化和过度生长，且显著降低了心脏收缩力和纤维化(图1n-1s、图8c-8i和表1)。接下来，我们在诱导性多能干细胞(iPSC)衍生的人心肌细胞和原代新生大鼠心肌细胞(NRC)中证实了这些发现。人和大鼠心肌细胞经DAPI染色以使细胞核可视化，并用鬼笔环肽来标记丝状肌动蛋白且勾勒出细胞表面轮廓。如图8j-8y所示，在人和大鼠心脏细胞中用shRNA敲除ATP5A1导致ADP:ATP比值的增加(图8k-8m、8s-8u)，这可通过ADP和ATP耗竭水平的升高(图8t、8u)和心肌细胞的多核化来证实，同时细胞过度生长，正如通过2D细胞大小分析和亮氨酸掺入所量化的那样，其中将蛋白质合成的读数作为对生长的间接量度(图8n-8p、8v-8y)(Fukuzawa,J.等人,2000)。因此，ATP5A1的耗竭足以诱导内复制和多核化，从而驱动病理性心脏生长并损害心功能。

我们在经TAC手术的心室特异性Hif1α条件性基因敲除(cKO)的小鼠和心室肌中缺乏von Hippel Lindau蛋白(Vhl)的小鼠中检测到了心脏Hif1α激活与Atp5a1 mRNA和蛋白表达的反向共调节，由此因抑制了HIF1α通过其氧依赖性亚基所发生的降解而导致了心肌中Hif1α的积累(图9a-9c)。由于HIF1α积累与ATP5A1抑制之间的反向关系，因此心室特异性Hif1αcKO小鼠受到了保护，免受在经TAC手术的对照HIF1αfl/fl同窝幼鼠中观察到的ATP缺乏和收缩功能不全的影响(图9d、9e)，而Vhl cKO小鼠显示出与收缩功能下降相关的低心室ATP水平(图9f、9g)。然而，在计算机和表达研究中多次都未能精确查明能够介导观察到的对Atp5a1 mRNA和ATP水平的效应的直接HIF1α靶基因(数据未显示)。这使我们探索了Hif1α调节的miRNA在介导这些效应中的作用。我们对对照小鼠和经TAC手术的心室特异性Hif1αcKO小鼠以及心室特异性Vhl cKO小鼠的左心室的miRNA进行了表达谱分析。通过比较各组内的表达数据并筛选出包含跨物种保守的缺氧反应元件(HRE)基序的miRNA，我们确定了几种潜在的Hif1α调节的miRNA(图9h)。这些miRNA的子集先前与缺氧和/或Hif1α依赖性有关。在这些miRNA中，mir27b的独特之处在于其在经TAC手术的Hif1αcKO小鼠(与同窝对照Hif1αfl/fl TAC小鼠相比)中的抑制作用与已建立的Hif1α靶基因的表达模式以及其在心室特异性Vhl cKO小鼠中的上调一致(图9i、9j)，表明了Hif1α的潜在调节作用。

mir27b包含在人和小鼠的氨肽酶O(AmpO)基因的内含子15的mir23b-27b-24簇中(Zhou,Q.等人,2011,Proc Natl Acad Sci USA,108,8287-8292)。为了确定mir27b转录对应激和Hif1α的依赖性，我们检测了AmpO和簇内所含的所有miRNA在经TAC手术的小鼠中的表达，并在体外对缺乏氧依赖性降解结构域(ODD)的组成型活性Hif1α突变体(称为HIF1α△ODD)的表达作出响应，或通过用诱导肥大的β-肾上腺素能受体激动剂三碘甲腺原氨酸(T3)产生的刺激(图9k-9t)来进行。对小鼠进行TAC手术会导致AmpO的轻微诱导、成熟的miR23b-3p/5p和miR24-3p/5p的表达基本不变，以及miR27b-3p/5p的约2.5倍诱导(图9k-9m)。

体外异位HIF1α△ODD表达导致AmpO下调以及miR23b-3p/5p和miR24-3p/5p的水平不变(图9n-9p)，而T3刺激诱导AmpO表达，但不诱导miR23b-3p/5p或miR24-3p/5p的表达(图9r-9t)。相反，成熟的miR27b-3p/5p在两个体外模型中均持续上调(图9p、9t)。这些结果表明，对miR27b-3p/5p的调节不受其宿主基因AmpO及其邻近的miRNA的影响，以对应力和Hif1α作出响应。为了确认MIR27B是直接的HIF1α靶，我们用T3刺激了对照非沉默(ns)和shHif1α转导的NRC，并分析了MIR27B的表达，且建立了HIF1α靶基因作为对照(图9u)。对mir27b启动子中的跨物种保守HRE(对应于mir27b转录起始位点(TSS)的-1kb上游)进行的计算机分析揭示了在人和小鼠中接近TSS的保守HRE基序(图9v)。为了评估该HRE的功能，我们用野生型和HRE突变型启动子进行了mir27b启动子-荧光素酶测定。Hif1α仅增加了野生型启动子的荧光素酶报告基因表达，而没有分别增加HRE突变型启动子或对照细胞中的荧光素酶报告基因表达(图9w)。在存在HIF1α△ODD的异位表达的情况下，邻近的miRNAmir23b和mir24的启动子未显示出启动子的活性增加(图9x)。此外，Hif1α与shVhl转导的NRC天然染色质中的mir27b启动子特异地相关，正如核提取物中的Hif1α染色质免疫沉淀(ChIP)所示(图9y)。通过免疫印迹法证实了shVhl耗竭pVhl的效率以及由此产生的Hif1α积累(图9z)。综上所述，这些数据将MIR27B定义为真正的HIF1α靶标miRNA。

Atp5a1在3’UTR中含有miR27b结合位点(保存在人与小鼠之间)(图10a)，其一旦被定点诱变破坏，就会导致对miR27b介导的抑制作用的去抑制(图10b)。与此一致的是，NRC中异位mir27b表达导致了对Atp5a1 mRNA和蛋白质的明显抑制(图10c-10e)。尽管HIF1α上调了miR27b-3p和miR27b-5p RNA，但miR27b-5p具有独特的抑制野生型Atp5a1 UTR报告基因表达的能力(图10b)。用miR27b-5p模拟物处理心肌细胞导致了Atp5a1 mRNA的剂量依赖性下调，而miR27b-3p模拟物则没有(图10f)。用锁核酸(LNA)介导的miR27b-5p抑制在表达异位HIF1α△ODD的心肌细胞中重现了这些观察结果(图10g-10i)。特异性靶向miR27b-5p的LNA导致了对HIF1α△ODD诱导的Atp5a1下调的去抑制(图10g-10i)。在T3刺激下观察到了类似的结果，其中在同时用miR27b-5p LNA处理时，对Atp5a1的抑制得以挽回(图10j-10m)。因此，miR27b对Atp5a1的抑制是由miR27b-5p种类特异性地介导的。

为了确定在这些情况下Atp5a1的下调是否影响了ATP合酶的活性，我们测量了从异位表达mir27b或shAtp5a1的大鼠心肌细胞中分离出的免疫沉淀ATP合酶的ATP再生能力，或者在异位HIF1α△ODD表达与mir27b-5p LNA结合时的ATP再生能力(图10n、10o)。如所指出的，异位mir27b和HIF1α△ODD表达导致了对ATP合酶活性的显著抑制，其活性在用mir27b-5p LNA平行处理时得以挽回(图10n、10o)。Atp5a1失活也模拟了异位mir27b表达的影响，而伴随的用标记的构建体对Atp5a1的过表达(图10p)则挽回了异位HIF1α△ODD表达时ATP合酶活性的降低(图10o)。因此，ATP合酶活性高度依赖于Atp5a1的表达水平。

为了评估MIR27B表达是否与人类心脏病理学相关，我们分析了MIR27B在健康和患病的人类心脏活检组织中的表达。如图2a所示，与健康受试者相比，MIR27B表达在HCM和AS患者的左心室活检组织中升高，因此其与ATP5A1表达呈负相关(图1a)。我们通过将携带pre-mir27b的AAV9(AAV9-fl/fl-mir27b)递送给Mlc2v-Cre转基因小鼠，在体内检测了mir27b与Atp5a1之间的因果关系，以实现异位mir27b在心室肌中的特异性表达。如所指出的，在转导后11周，异位mir27b表达足以驱动心脏过度生长、收缩功能不全以及Atp5a1mRNA和蛋白质抑制(图2b-2h)。此外，与Cre

鉴于ATP合酶失活会提高线粒体内的ADP水平，我们探讨了在没有ATP合酶底物竞争的情况下，ADP是否可以被重新引导至MTHFD1L(MTHFD1L是一种1-碳途径的线粒体内限速酶，占细胞内所产生的甲酸酯的70％至99％)。MTHFD1L利用ADP作为10-甲酰基四氢叶酸酯(CHO-THF)水解成甲酸酯的限速辅因子(图3a)。为了测试这一点，我们测量了遗传性Hif1α、miR27b、Atp5a1和Mthfd1l的功能获得和丧失设置中的甲酸酯、线粒体的ATP和ADP水平(图3b、3c、图12a-12h)。甲酸酯生成和ADP:ATP比值的增加与异位Hif1α或miR27b表达以及shRNA介导的Atp5a1敲除直接相关(图3b、3c)。接下来，我们在与上述类似的环境中进行了代谢组学研究，以研究HIF1α-MIR27B-ATP5A1轴的激活与多核化水平的升高和心肌细胞的生长之间的代谢联系(图3d)。显著的异位Hif1α、miR27b或shAtp5a1表达导致了葡萄糖和糖酵解中间体(磷酸二羟基丙酮酯、3-磷酸甘油酯)的水平升高，表明葡萄糖摄取和糖酵解增加。此外，观察到丝氨酸和甘氨酸、嘌呤生物合成途径的中间体(5-磷酸核糖，FGAR)以及嘌呤和嘧啶衍生物(肌苷、黄嘌呤、dUTP、GTP、尿苷)的水平升高。相反，伴随的miR27b-5p失活、Mthfd1l耗竭或异位ATP5A1表达部分地逆转了这些效应(图3d)。此外，仅异位表达MTHFD1L不足以诱导从头嘌呤生物合成途径，从而支持以下观点：线粒体ADP优选作为ATP合酶的底物，并且线粒体甲酸酯生物合成的诱导高度地依赖于对ATP5A1的抑制(图3d)。用T3观察到类似的结果，导致高度依赖miR27b的生长(图13a)、甲酸酯的产生(图13b)和ADP/ATP增加(图13c)。基于LC-MS的代谢组分析显示，嘌呤和嘧啶衍生物的生成随miR27b表达而增加(图13d)。

因此，ADP的重新引导将能量折中与应激诱导的生物合成途径联系起来。

嘌呤对于核酸合成、内复制和细胞生长至关重要。它的从头合成可追溯到进入细胞并经历糖酵解而形成3-磷酸甘油酯(3-PG)的葡萄糖，并通过丝氨酸生物合成途径进一步代谢而生成丝氨酸和(间接)甘氨酸，然后通过将其碳结合到嘌呤环中而作为关键的1-碳供体(图3a)。由于结合到嘌呤环中的碳原子基本上可追溯到葡萄糖碳，因此我们通过分别标记葡萄糖、丝氨酸和甘氨酸来跟踪碳进入核酸嘌呤环中的通量(图3e)。如图所示，在异位表达HIF1α△ODD、miR27b或shAtp5a1的细胞的核酸片段中观察到来自葡萄糖、丝氨酸和甘氨酸的碳原子的掺入增加(图3e)，而同时发生的异位MTHFD1L表达并未明显增加标记碳对核酸片段的贡献(图3e)，这与获得的代谢组图谱一致(图3d)。在T3诱导的细胞生长和miR27b-5p失活的情况下也观察到了类似的效果(图13e)。这些数据表明，在调节病理诱导的从头核酸合成中，整个上游网络影响了ATP5A1与MTHFD1L之间的串扰。

最后，我们用加扰LNA(scrLNA)或miR27b-5p LNA处理确定了在经假手术或TAC手术的小鼠的左心室活检组织中是否可检测到类似的代谢物分布变化(图2k-2p)。如图14a所示，与经TAC手术并用miR27b-5p LNA处理的动物或经假手术并用scrLNA处理的小鼠相比，在心脏左心室中观察到的代谢物变化与上述体外观察到的变化非常相似，包括嘌呤前体(例如N-甲酰甘氨酰胺核糖核苷酸(FGAR)和5-甲酰胺基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(FAICAR))在经TAC手术并用scrLNA处理的小鼠中升高。此外，与经TAC手术并用scrLNA处理的小鼠相比，经TAC手术并用miR27b-5p处理的小鼠中嘌呤黄嘌呤和肌苷的含量明显较低(图14a)。层次聚类分析显示，与经TAC手术并注射有scrLNA的小鼠相比，经TAC手术并注射有miR27b-5pLNA的小鼠的左心室活检组织的代谢特征发生了变化，但与经假手术并用scrLNA和miR27b-5p LNA处理的小鼠的代谢特征相当(图14b)。特别地，与TAC-scrLNA对照小鼠相比，经TAC手术并注射有miR27b-5p LNA的小鼠的左心室活检组织显示出较低水平的游离脂肪酸和其他脂质种类(图14a)。因此，我们还研究了上述体内样本中的脂质体(图15a-15g)。主成分分析(PCA)表明，与经TAC手术并注射有miR27b-5p LNA的小鼠相比，经TAC手术并注射有scrLNA的小鼠的左心室具有独特的脂质标记(图15a)。经假手术或TAC手术并用scrLNA处理的心脏的脂质体部分地重叠，但沿第一主成分(PC1)明显分离，而经假手术或TAC手术的miR27b-5p表达水平降低的心脏的脂质体沿第二主成分(PC2)明显分离(图15b、15c)。仔细观察脂质成分后发现，经TAC手术/注射有miR27b-5p LNA的小鼠的左心室活检组织确实显示出含有6个双键(db)的脂质含量最高，而TAC scrLNA样本明显突出了2db、4db以及含有34和36个碳原子的脂质(图15d、15e)。

分析了从经TAC手术的小鼠的单个脂质种类的丰度中减去相应对照小鼠的脂质种类的平均摩尔百分比丰度后所得到的结果，发现TAC样本中有富集的花生四烯酸(20:4)和亚油酸(18:2)(图15f)。引人注目的是，含有二十二碳六烯酸(22:6)的脂质积聚在miR27b-5p表达受到抑制的经TAC手术的小鼠的左心室中(图15g)。与此结果一致，在非靶向代谢分析中游离二十二碳六烯酸也增加了(图14a)。总之，对心脏脂质体的综合分析揭示了预防压力超负荷引起的左心室生长与富含多不饱和脂质(特别是含有二十二碳六烯酸的脂质，该脂质已被证明具有心脏保护作用)之间的相关性。另一方面，肥大的增加与含有34和36个碳的脂肪酸的脂质的显著上调有关，表明脂肪酸氧化减少。与经TAC手术并用miR27b-5p LNA处理的小鼠(与经TAC手术并用scrLNA处理的小鼠相比)的心脏的更大氧化表型一致(图14a)，用miR27b-5p LNA处理的小鼠的脂质分解代谢显著增强，正如与经TAC手术并用miR27b-5p LNA处理的心脏相比，长链脂肪酸在经TAC手术并用scrLNA处理的心脏中富集所证明的那样(图15a-15g)。此外，在经TAC手术并用miR27b-5p LNA处理的心脏中观察到脂质分解代谢介质的表达增加(与经TAC手术并用scrLNA处理的小鼠相比)，这对应于经TAC手术并用miR27b-5p LNA处理的心脏中棕榈酸酯氧化能力的增加(图15h、15i)。

总之，这些分析揭示了经TAC手术并用miR27b-5p LNA处理的心脏的独特脂质标记，该心脏的特征是含有心脏保护性二十二碳六烯酸的脂质显著上调，并且脂肪酸的氧化能力增强。

心肌细胞内复制先于病理性心脏过度生长(Ahuja,P.等人,2007,Physiol Rev,87,521-544)。为了了解所确定的轴是否确实通过ADP促进了心肌细胞的多核化和生长，本发明人通过用寡霉素(一种F

为了更好地定义潜在的机制，本发明人分析了在Hif1α、miR27b、Atp5a1和Mthfd1l的功能获得和丧失设置中的心肌细胞倍性和细胞大小(图4a-4i和图17a-17h)。如成像耦合流式细胞术和用碘化丙啶(PI)染色的DNA的流式细胞术所示，异位HIF1α、mir27b或shAtp5a1表达足以增加多核多倍体细胞的数量(图4a-4f)，这是一种在同时发生miR27b-5pLNA介导的失活(图4a、4b)、异位ATP5A1表达(图4c、4d)或通过表达shMthfd1l的慢病毒的共转导而使Mthfd1l耗竭(图4e、4f)时逆转的效应。为了直接观察内复制的多核细胞，将心肌细胞染色以使丝氨酸10处的磷酸化组蛋白3(p-组蛋白H3)显现，并通过共聚焦显微镜成像(图17a-17h)。磷酸化组蛋白H3标志着浓缩的染色体，这些染色体有核细胞的特征。与流式细胞术数据一致，异位HIF1α△ODD表达导致磷酸化组蛋白H3染色的细胞核增加，这在用LNA平行抑制miR27b-5p时得以挽回(图17a、17b)。此外，与相应的对照物相比，mir27b过表达或Atp5a1抑制同样导致了有核细胞数量的增加(图17c、17d)。shRNA介导的Mthfd1l抑制导致了其mRNA和蛋白质的有效耗竭(图17e、17f)，并导致了与对照细胞相当的磷酸化组蛋白H3染色(图17g、17h)。值得注意的是，异位ATP5A1和mir27b的同时表达或者NRC与shMthfd1l和shAtp5a1慢病毒的共转导同样减少了磷酸化组蛋白H3染色的广泛模式，正如在单独异位表达mir27b或shAtp5a1时所观察到的那样(图17c-17h)。为了验证从头嘌呤生物合成和多核化的增加与细胞生长直接相关，本发明人在相同的处理条件下进行了亮氨酸掺入试验。如图4g-4i所示，异位HIF1α△ODD、mir27b表达或Atp5a1敲除导致了亮氨酸掺入的增加(表明蛋白质合成和细胞生长的增加)，而该现象在同时发生mir27b-5p失活(图4g)或Atp5a1异位表达时未出现(图4h)。与嘌呤生物合成中对MTHFD1L的关键要求一致，当MTHFD1L和ATP5A1同时耗尽时，多核细胞的比例下降了(图4e、4f)，病理性细胞生长也减少了(图4i)。因此，我们的数据支持以下观点：对代谢环境进行的重新规划足以驱动心肌细胞内复制，从而导致多核化和细胞生长。

为了证实MTHFD1L影响心脏的病理性肥大，本发明人给经假手术或TAC手术的Mlc2v-cre

与经TAC手术的Mlc2v-cre

AMPK激活已显示可通过Ser804处的磷酸化来抑制肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)。Rb通过隔离和抑制E2F转录因子(E2F-DP，由二聚体E2F蛋白和二聚化伴侣(DP)蛋白组成)来限制DNA复制以及从G1到S的细胞周期进程。Rb磷酸化导致了对E2F-DP复合物中E2F转录因子的释放和去抑制，最终导致了E2F靶基因诱导和细胞周期再进入。鉴于HIF1α-miR27b-ATP5A1-MTHFD1L轴在有丝分裂后的成年心肌细胞中产生了允许细胞周期再进入和核内有丝分裂的代谢环境，本发明人探究了代谢和生长因子信号传导在心脏病理性肥大中可能存在的协同作用。

首先，本发明人通过AMPK和Rb的共免疫沉淀证实了AMPK与Rb之间的直接相互作用。为此，将AMPKα亚基在心肌细胞中异位表达，并随后免疫沉淀。下拉产物显示AMPKα与磷酸化Rb共沉淀(图6a、6b)。本发明人通过表达异位HIF1α△ODD的细胞中内源性AMPK的下拉证实了这种相互作用。如前所述，用磷酸化Rb在异位表达HIF1α△ODD的心肌细胞中使AMPK免疫沉淀，但在同时用化合物C(CC)(一种有效的AMPK抑制剂)抑制AMPK时并未如此(图6c、6d)。

在证实了AMPK与磷酸化Rb之间的直接相互作用后，本发明人接下来评估了Rb在我们的人体活检组织和各种小鼠模型中是否被过度磷酸化(图6e-6j)。实际上，在经TAC手术并注射有scrRNA的小鼠的左心室活检组织的裂解物中检测到了Rb的过度磷酸化(图6e)，且异位mir27b表达(图6f)和Atp5a1耗竭(图6g)与如前所述在这些条件下AMPK在Thr172处的磷酸化(图11和图2h、2u)一致。在TAC手术后，注射有靶向miR27b-5p的LNA(图6e)或同时用AAV9(携带有抗Mthfd1l和Atp5a1或仅抗Mthfd1l的shRNA)转导的小鼠的左心室免受pRb诱导(图6h、6i)。与小鼠实验和观察到的AMPK的Thr172磷酸化(图1c)一致，AS和HCM患者的心室活检组织裂解物的免疫印迹显示出磷酸化Rb表达也同样增加(图6j)。综上所述，在存在驱动HIF1α-MIR27B-ATP5A1轴的心脏代谢内复制的情况下，pRb是磷酸化AMPK的下游靶标。

为了研究Rb过度磷酸化后E2F1的预测释放是否会导致E2F1的转录活性增强，本发明人进行了qRT-PCR分析，以检测用上述条件处理的小鼠的左心室样本和人类心脏活检组织中E2F1靶基因(细胞周期蛋白A1、A2、D1、E1(Ccnal,Ccna2,Ccnd1,Ccne1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cdk1))的RNA水平的变化(图6k-6n)。这些基因表达分析可证实在小鼠以及AS和HCM患者中出现了磷酸化AMPK介导的Rb抑制的下游体内E2F途径的激活(图6k-6n)。在NRC中进行的E2F荧光素酶报告基因分析进一步证实了在HIF1α△ODD、mir27b或Atp5a1耗竭的异位表达下的E2F转录活性(图6o、6p)。最后，为了从功能上评估细胞周期调节因子对心肌细胞核内有丝分裂和多核化的影响，本发明人灭活了Ccnd1(细胞周期蛋白D1)和Ccne1(细胞周期蛋白E1)，它们是表达异位HIF1α△ODD的心肌细胞中Rb活化的两个关键下游组分。如所证明的那样，Ccnd1和Ccne1的失活抑制了HIF1α介导的核内有丝分裂、多核化和肥大(图19a-19f)。相反，细胞周期抑制剂Cdkn1b(p27/Kip1)的失活足以诱导心肌细胞核内有丝分裂、多核化和病理性生长(图19g-19k)。综上所述，本发明人已证明了心脏内复制和多核化需要同时激活从头嘌呤生物合成(由所鉴定的HIF1α-MIR27B-ATP5A1-MTHFD1L轴促进)以及通过E2F1激活细胞周期。这反映在以下事实上：Mthfd1l的耗竭与Atp5a1抑制的结合足以诱导AMPK活化和E2F转录(图6h、6i、6l、6m)，但未能诱导心脏代谢内复制(图5b、5c、5j、5k)。

动物繁殖与养护

Hif1αfl/fl小鼠来自Randall S.Johnson(美国加州大学圣地亚哥分校)，Vhl fl/fl小鼠由Rudolf Jaenisch(美国麻省理工学院)友善提供。肌球蛋白轻链(Mlc)2v-Cre(Chen,J.等人,1998,Development,125,1943-1949)系来自Ju Chen(美国加州大学圣地亚哥分校)。本手稿中描述的各个心室特异性小鼠系是通过将loxP侧翼Hif1α(Hif1αfl/fl)(Ryan,H.E.等人,2000,Cancer Res,60,4010-4015)或Vhl(Vhl fl/fl)(Haase,V.H.等人,2001,Proc Natl Acad Sci USA,98,1583-1588)小鼠与肌球蛋白轻链Mlc2v-Cre转基因小鼠杂交而产生的。所提供的数据代表了对3-20周大的C57BL/6J背景雄性小鼠的研究结果。对于所述3-20周，本发明人指的是动物实验的整个持续时间。将AAV9病毒施用到3周大的小鼠身上。由于AAV9载体在达到最大表达之前有大约6-10周的延滞期，因此在施用AAV9后的9-11周进行手术，并在至少11周后获取心脏，如图1k、2b、2k、5a中的实验曲线所示。在TAC实验中，实验开始时小鼠的年龄为10-12周。在相应的实验中只使用年龄相近(+/-1周)的小鼠。在用Mlc2v-cre小鼠进行的实验中，使用了同窝幼鼠和年龄相近(+/-1周)的小鼠。在基线超声心动图检查后，将小鼠随机分组，分别进行AAV注射、LNA递送和超声心动图检查。在包括TAC手术在内的实验中，在手术前，实验在基线超声心动图上保持盲法。所有小鼠均在MRC临床科学中心(伦敦帝国理工学院)、苏黎世分子健康科学研究所(ETH Zurich)和/或洛桑大学医学系心血管评估机构(CAF)的一特定的无病原体设施中进行饲养。维护和动物实验符合瑞士联邦兽医局(BVET)的指导方针。

人和小鼠心室活检

Samuel Sossalla(哥廷根Georg-August大学和DZHK，哥廷根，德国)和SebastianStehr(德国莱比锡大学医院)慷慨地提供了人类心脏活检和临床数据。按照当地伦理委员会的要求进行了人类HCM和主动脉瓣狭窄活检，并在纳入前获得了所有受试者的书面知情同意书。心肌样本来自患有严重主动脉瓣狭窄的患者，对这些患者进行了主动脉瓣置换术，并对肥厚的左心室隔膜进行了Morrow切除术。仅包括无明显主动脉瓣反流和保留收缩功能的患者。HCM患者的人左心室活检取自移植心脏的左心室乳头肌。在手术期间直接在手术室中采集了心肌样本，并立即在预冷的心脏停搏液(110mM NaCl、16mM KCI、16mM MgCl

如前所述(Kassiri,Z.等人,2005,Circ Res,97,380-390)，通过缩窄降主动脉对9-14周大的小鼠进行了跨主动脉结扎(TAC)。在手术后长达9周内对小鼠进行了监测，并通过超声心动图测定了其心脏尺寸和功能。如图2k所述，在手术后第49天起连续4天将体内miRCURY LNA Power抑制剂以10mg/kg的剂量经腹腔(i.p.)注射到C57BL/6J小鼠体内。以下体内miRCURY LNA Power抑制剂购自Exiqon：i-mmu-miR-27b-5p(199900)。采用i-Cel-control_inh(199900)作为加扰对照LNA。

体内经胸超声成像

使用Vevo2100彩色多普勒超声仪(VisualSonics)的MS400(18-38MHz)探头进行经胸超声心动图检查。用1％至1.5％的异氟烷轻度麻醉小鼠，使其心率维持在每分钟400-550次。使小鼠以背部朝下的姿势躺在37℃的加热平台上以维持体温。使用局部脱毛剂去除毛发，并使用超声凝胶作为换能器与皮肤之间的耦合介质。在胸骨旁长轴视图中以2D模式对心脏成像。从这个角度看，M型光标垂直于室间隔和乳头肌水平的左心室后壁。测量室间隔舒张期和收缩期直径(IVS；d和IVS；s)、左心室后壁舒张期和收缩期直径(LVPW；d和LVPW；s)以及左心室舒张末期和收缩末期内径(LVID；d和LVID；s)。在三个独立的M型图像中进行测量并取平均值。还计算了左心室缩短分数(％FS)和射血分数(％EF)。根据左心室舒张末期和收缩末期直径的变化百分比，从M型评估缩短分数。％EF是从公式(LV vol；d-LV vol；s)/LV vol；d×100导出的；实验结束时，处死动物，并测量心脏重量与体重之比。

原代新生大鼠心肌细胞的分离与维护

使用制造商推荐的新生心脏分离试剂盒(130-098-373,Miltenyi Biotec)分离原代新生大鼠心肌细胞(NRC)。将分离的细胞用平板培养基(65％DMEM、16％M199、10％胎牛血清(FCS)、5％马血清(HS)、2％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(P/S))预培养1.5h，以耗尽成纤维细胞。将NRC在涂有I型胶原涂层的(Advanced Biomatrix)3cm培养皿(Nunc)上于平板培养基中培养。分离NRC后24h，将平板培养基改为维持培养基(88％DMEM，9％M199，1％HS，2％谷氨酰胺和1％P/S)。用浓度为15nM的3,3’,5-三碘-L-甲状腺素(T3,T5516,SigmaAldrich)处理心肌细胞达6天。用浓度为10μM的外源性ADP(A2754,Sigma Aldrich)刺激NRC达3天。将寡霉素A(75351,Sigma Aldrich)和AMPK抑制剂化合物C(CC；171260,SigmaAldrich)分别以20nM的浓度施用达2天，并以5μM的浓度施用达24h。在隔离后第二天随机选择NRC进行处理。

成年小鼠心肌细胞的分离

将成年小鼠心脏的左心室切成1mm

人心肌细胞培养

人诱导多能干细胞衍生的人心肌细胞(iPSC-CM)购自Cellular DynamicsInternational(CMC-100-010-001)，并按照制造商的建议进行培养。这些细胞显示出清晰的肌节组织，如条纹所示。此外，这些细胞由于不增殖且不能传代，因而终末分化。基因表达分析表明，iPSC-CM表达了200多个心脏基因，其中α-肌动蛋白和心肌肌钙蛋白T的表达谱与成人心脏组织相似。细胞在解冻后24-48h时开始自发搏动，并形成电连接的同步搏动的合胞体层。当这些细胞形成同步跳动的合胞体时，它们被认为适合于研究。在培养6-7天后，随机选择细胞进行慢病毒转导，并在第10天进行实验。

线粒体的分离

用培养细胞的线粒体分离试剂盒(ab110171,Abeam)分离线粒体。简言之，在每个6cm培养皿中接种了1.2×10

慢病毒的产生和感染

用聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂以80％至90％的融合度转染HEK-293T细胞。在每个10cm培养皿中将10μg转基因、7.5μg pMD2.G和6.5μg psPAX2与2ml无血清DMEM和45μg PEI混合。在室温(RT)下培养10min后，将DNA/PEI复合物缓慢添加到在含有0.5％FCS和L-谷氨酰胺的DMEM内培养的细胞中。转染后4h时将培养基更换为NRC维持培养基。转染后48h时收集慢病毒，并保存在-80℃温度下。分离后20h时将NRC感染，并将其在37℃温度下在5％CO

AAV9构建体

为了产生腺相关的病毒构建体，将靶向Mthfd1l的shRNA克隆到pSico载体中，其中以Cre依赖性方式来控制U6启动子驱动的shRNA表达。靶向Mthfd1l的shRNA是使用在线软件pSico-Oligomaker(MIT，1.5版)设计的。使用了以下shRNA序列：

AAV9-fl/fl-sh Mthfd1l，

正义(SEQ ID NO 003)：

TGAATGGTGTCAGAGAATTTTTCAAGAGAAAATTCTCTGACACCATTCTTTTTTC，

反义(SEQ ID NO 004)：

TCGAGAAAAAAGAATGGTGTCAGAGAATTTTCTCTTGAAAAATTCTCTGACACCATTCA。

在通过用Adeno-Cre(Cat No ADV-005,Cell Biolabs)表达来诱导Cre介导的重组和shMthfd1l表达的激活而完成对shRNA敲除效率的体外验证后，将含有U6启动子、shRNA和pSico构建体的TATA-lox位点的区域扩增并连接到Nhel/Xhol线性化AAV-bGH(+)载体中。所有其他病毒都是通过Targeted Transgenesis(靶向转基因)而设计和改造的。将AAV9病毒以每公斤体重1.2×10

锁核酸(LNA)、miRNA模拟物和siRNA的体外施用

将miRCURY LNA Power抑制剂以50nM的最终浓度直接添加到细胞培养基中，并每隔两天添加新鲜的LNA。以下miRCURY LNA Power抑制剂购自Exiqon：i-mmu-miR27b-5p(4101712-101)。阴性对照A(199006-101)用作非靶向LNA。

用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将miRIDIAN microRNA模拟物转染到NRC中。在96孔板中的每孔内，将0.4μL Lipofectamine 2000与25μL OptiMEM(Invitrogen)混合。在室温下培养5min后，将混合物添加到在50μL OptiMEM中含有6.25nM或12.5nM miRNA模拟物的Eppendorf管中，并在室温下孵育20min以形成复合物。将50μl复合物添加到在不含抗生素的100ml培养基中培养的细胞中。转染后4h时更换培养基，并在转染后48h时收集细胞。以下miRIDIAN microRNA模拟物购自Dharmacon：mmu-miR27b-3p(C-310380-05-0005)，mmu-miR27b-5p(C-310810-01-0005)。将miRIDIAN microRNA模拟阴性对照#1(CN-001000-01)用作阴性对照物。

使用制造商推荐的DharmaFECT 1转染试剂(Dharmacon)将siRNA以最终浓度为50nM转染到NRC中。转染后72h时分析基因表达。使用了以下来自Dharmacon的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA：Ccnd1(L-089285-02-0005)，Ccne1(L-101575-02-0005)，Cdkn1b(L-090938-02-0005)。将非靶向siRNA pool(D-001810-10-05)用作对照物。

瞬时转染

根据制造商的说明，在使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)分离后的2天时，将pCMV6 MTHFD1L(RC223034,Origene)或pEBG-AMPK

质粒构建

如前所述(Troilo,A.等人,2014,EMBO Rep,15,77-85)，pLenti-HIF1α△ODD puro慢病毒表达载体是通过将来自pcDNA3-HA-HIF1αAODD(401-603)质粒(Huang,L.E.等人,Proc Natl Acad Sci USA,95,7987-7992)的HIF1α△ODD片段亚克隆到pLenti-pgk puro载体中而产生的。将plenty-pgk puro空载体用作相应的对照物。通过扩增小鼠基因组DNA中mir27b前体转录本两端的前体mir27b序列和侧翼序列158bp，生成了miR27b过表达构建体。通过使用EcoRI和Sail限制性位点，将该序列克隆到由A.Ittner(ETH Zurich)提供的pLKO.1CMV puro构建体中。将空白的pLKO.1CMV puro构建体用作对照载体。

miRNA启动子-荧光素酶构建体的生成

从小鼠基因组DNA中扩增了mir23b、mir24-1和mir27b启动子的1.0kb(kb)片段，并将其克隆到位于Xhol与Hindlll限制性位点之间的pGL3荧光素酶报告基因载体(Stratagene)中。mir27b启动子中的HRE突变是通过重组PCR产生的(Elion,E.A.等人,2007,CurrProtoc Mol Biol,Chapter 3,Unit 3 17)。设计了带有HRE突变的正义和反义引物，分别用于扩增mir27b启动子的5’和3’突变区域。随后，将各自PCR反应产生的5’和3’产物以1:1的比例混合，并使用靶向启动子5’和3’末端的引物来扩增整个片段。通过DNA测序(Microsynth)证实了在mir27b启动子中的野生型构建体和HRE突变。

ATP5A1 3’UTR荧光素酶构建体的产生

从小鼠cDNA中扩增Atp5a1的3’UTR，并将其克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体(Promega)中。通过重组PCR产生在Atp5a1的3’UTR上的mir27b结合位点的突变。产生了带有mir27b结合位点突变的正义和反义引物，分别用于扩增3’UTR的5’和3’突变区域。随后，将各自PCR反应产生的5’和3’产物以1:1的比例混合，并使用靶向Atp5a1 3’UTR的5’和3’末端的引物来扩增整个序列。通过测序(Microsynth)证实了Atp5a1的3’UTR中mir27b结合位点的突变。

Mthfd1l的shRNA敲除

使用在线软件BLOCK-iT RNAi Designer(Life Technologies)设计了靶向Mthfd1l的shRNA，并使用BLAST与大鼠基因组进行了比较。将shRNA克隆到pLKO.1载体中。将正义和反义寡聚物重新悬浮在退火缓冲液(100mM NaCl,50mM HEPES,pH 7.4)中至浓度为20μM。通过将5μL的正义和反义寡聚物在装有沸水的烧杯中孵育，将其进行混合和退火，然后冷却至室温。将退火后的寡聚物连接到Agel与EcoRI限制性位点之间的pLKO.1载体中。将50ng载体、200ng退火寡聚物、1μL T4 DNA连接酶与1μL 10倍连接缓冲液混合，并用PCR级水使最终体积达到10μL。将连接反应物在16℃温度下孵育过夜，并通过热休克转化将2μL的连接反应物转化为感受态Stbl3细菌。使用Ndel和BamHI通过限制性消化来筛选菌落的shRNA插入，并通过DNA测序(Microsynth)确认阳性克隆。

慢病毒和表达构建体

对于慢病毒shRNA的敲除，使用了以下TRC pLKO.1shRNA载体：Atp5a1(shAtp5a1，TRCN0000076239)，Hif1α(shHif1α,TRCN0000232220)和Vhl(shVhl,TRCN0000436052)。将含有非沉默shRNA的pLKO.1载体(nsRNA；SHC002,Sigma)用作对照物。pLenti ATP5A1(RC214840L1)和pCMV6 MTHFD1L(RC223034)质粒来自Origene。pEBG-AMPKαl(1-312)是来自Reuben Shaw(Addgene质粒#27632)的礼物。

RNA分离、逆转录和qRT-PCR

在Trizol(Invitrogen)中采集样本，并按照制造商的建议分离总RNA。按照制造商的说明，使用RNA至cDNA EcoDry Premix(随机六聚体)试剂盒(Clontech,Cat No 639545)将750ng RNA反向转录成cDNA。根据制造商的建议，使用iTaq Universal SYBR GreenSupermix(Biorad,Cat No 1725121)设置实时定量PCR(qRT-PCR)反应，并使其在PikoReal实时PCR机器(Thermo Scientific)上进行。将Ct值归一化至管家基因Hprt1。qRT-PCR引物序列如表6所示。

为了评估成熟的miRNA水平，按照制造商的建议，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(4366596,Applied Biosystems)将10ng总RNA转录成cDNA。按照制造商的说明，使用TaqMan 2×Universal PCR Master Mix(4304437,Applied Biosystems)进行qRT-PCR，并在DNA Engine Opticon 2(Bio-Rad)上进行。将Ct值归一化至管家基因snoRNA(大鼠)或snoRNA202(小鼠)。使用了Thermo Fisher Scientific的以下引物：miR23b-3p(ID000400)，miR23b-5p(ID243680_mat)miR24-3p(ID000402)，miR24-5p(ID000488)，miR27b-3p(ID000409)，miR27b-5p(ID002174)，snoRNA(ID001718)，snoRNA202(ID001232).

PCR

为了评估BL/6N和BL/6J小鼠中Nnt转录物的完整性，如前所述(Huang,T.T.等人,2006,Hum Mol Genet,15,1187-1194)使用心脏cDNA进行了PCR。

染色质免疫沉淀

根据制造商的说明，使用来自NRC的材料进行ChIP分析，并使用ChlP-IT试剂盒(Active Motif)进行测试，并通过qRT-PCR进行分析。用抗HIF1α的ChlP级抗体(小鼠，ab1，Abeam)进行ChIP。使用Matlnspector和DiAlignTF(Genomatix)进行计算机启动子分析和比对。ChIP中用于mir27b的引物序列为5’-GCATGCTGATTTGTGACTTGAG-3’(SEQ ID NO 006)和5’-CCTCTGTTCTCCAAACTGCAG-3’(SEQ ID NO 007)。

MicroRNA微阵列

分别对Vhl cKO小鼠的3个生物学重复和3个对照小鼠(Vhl fl/fl)以及对经TAC手术的Hif1αcKO小鼠的3个生物学重复和3个经TAC手术的对照小鼠(TAC Hif1αfl/fl)进行了microRNA微阵列分析。通过超声心动图确认了所有小鼠的心脏尺寸和功能。从左心室中分离出总RNA，并使用miRCURY LNA microRNA Power标记试剂盒(Exiqon)标记miRNA，且在miRNA阵列(miRXplore)上杂交，该阵列带有1194个DNA寡核苷酸，其具有成熟miRNA的反向互补序列。这些阵列涵盖728个人、584个小鼠、426个大鼠和122个病毒性miRNA，每个均一式四份地出现在阵列上。将Cy5标记的miRNA归一化至同时用Cy3标记的miRNA参考库。将所有数据均表示为患病动物与对照动物之间的对数之比，并存放在GSE62418之下。

NADPH定量

在3cm培养皿中每孔接种4×10

体内ATP定量

使用配备有两个独立的紫外线-可见光光谱仪(Shimadzu)的HPLC系统，在阴离子交换柱(Nucleosil 4000-7PEI，50/4，来自Macherey-Nagel)上以线性梯度(0-1.5M NaCl溶于10mM Tris-HCI，pH 8.0)分离和定量了ATP。在259nm和220nm处监测了样本的洗脱。使用220nm波长检测了可能存在的痕量污染物。

ADP和ATP分析

对于ADP/ATP比率分析，在3cm培养皿中每孔接种4×10

ATP合酶活性测定

在每个3cm培养皿中接种了4×10

荧光素酶检测

将4×10

为了评估启动子的活性，将20ng pGL3载体与1.25ng Renilla和0-260ng HIF1α△ODD共转染。在转染后36h时，使用制造商推荐的双重荧光素酶报告基因测定系统(Promega)测量荧光素酶的活性。通过使用双重荧光素酶报告基因测定系统(Promega)，根据制造商的说明使用Cignal报告基因测定试剂盒(CCS-003L,Qiagen)测量了E2F反式激活活性。

免疫印迹

将心脏组织溶解在blue wonder样本缓冲液(3.7M尿素、134.6mM Tris pH 6.8、5.4％(v/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、2.3％(v/v)NP-40、4.45％(v/v)对巯基乙醇、4％(v/v)甘油、60mg/L溴酚蓝)中，并使用Ultra-Turrax T10组织均质器(IKA)均化后在95℃温度下使蛋白质变性5min。将NRC用冰冷的PBS洗涤两次，然后将其收集在blue wonder样本缓冲液中。使用Bransonic 5510超声波水浴(Branson)对样本进行超声波处理以降低粘度，并将其煮沸5min。在短暂离心后，将蛋白裂解物装载到8％或10％的聚丙烯酰胺微凝胶(Biorad)中，然后通过湿法转移将其转移到硝化纤维素膜(GE Healthcare)中。将膜用含有5％(w/v)奶粉(Biorad)的TBST封闭，然后将其在室温下用一级抗体(该一级抗体用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的TBST稀释)孵育2h或在4℃温度下过夜。在用含有5％(w/v)奶粉的TBST洗涤三次后，将膜用适当的HRP偶联二级抗体(抗山羊IgG HRP，61-1620；抗小鼠IgG HRP，62-6520；抗兔IgG HRP，65-6120，Invitrogen)以1:5000的稀释度孵育1-2h。然后将膜用TBST洗涤三次，再将其在X射线RX-NlF胶片(Fisher Scientific)上用ECL(Amersham)检测化学发光。使用Image J(版本1.47)通过密度测定法对信号强度进行了量化(Schneider,C.A.等人,012,Nat Methods,9，671-675)。将以下抗体用于免疫印迹：抗α-肌动蛋白(A7811,Sigma)，抗ACC(3676，细胞信号传导)，抗磷酸化ACC Ser79(11818，细胞信号传导)，抗AMPKα(5832，细胞信号传导)，抗磷酸化AMPKαThr172(2535，细胞信号传导)，抗Atp5a1(ab14748,Abeam)，抗心脏肌动蛋白(61075,Progen Biotechnik)，抗Hif1α(NB100-479,Novus Biologicals)，甲基化赖氨酸(二甲基)(ab23366,Abeam)，抗Mthfd1l(ab116615,Abeam)，抗Rb(9309，细胞信号传导)，抗磷酸化Rb Ser807/811(8516，细胞信号传导)，抗Vhl(2738，细胞信号传导)和IgG同型对照抗体(ab171870)。

共免疫沉淀

将每种条件的0.5×10

免疫荧光染色

如前所述进行免疫荧光染色(Krishnan,J.等人,2009,Cell Metab,9,512-524)。用4％的PFA/PBS固定NRC，然后将细胞透化，并将其在室温下用在2％(v/v)HS中稀释的一级抗体孵育1h。用PBS洗涤5min达3次后，将细胞在室温下用4’.6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；D1306,Thermo Fisher Scientific,0.1μg/ml)、鬼笔环肽555(A34055，分子探针)、AlexaFluor 647抗小鼠(A-11001,Thermo Fisher Scientific)和AlexaFluor 488抗小鼠(A-21235,Thermo Fisher Scientific)二级抗体孵育1h。对于成年心肌细胞，将载玻片与一级和二级抗体在4℃温度下的加湿室中孵育过夜。将载玻片和培养皿用一滴ProLongAntifade(Thermo Fisher Scientific)固定在载玻片(Fisher Scientific)上。将载玻片/培养皿用透明指甲油固定，然后晾干。使用了以下一级抗体：肌节α-肌动蛋白(A7811,SigmaAldrich)、Ki67(ab15580,Abeam)和磷酸化组蛋白H3(Ser10)(05-817，细胞信号传导)。使用SP5共聚焦显微镜(Leica)通过放大20倍而获得荧光图像。使用软件Image J(版本1.47)对细胞大小进行了盲法定量。

免疫组织化学

将心脏植入最佳切割温度(OCT)化合物中，并在10μm处切片。将切片用4％PFA/PBS固定10min，然后将其在室温下用2％HS/PBS封闭1h，再用PBS洗涤2min达2次。在用0.2％Triton X-100/PBS渗透10min后，将切片用PBS洗涤5min达3次，然后将其在4℃温度下的加湿室内用抗肌节α-肌动蛋白(A7811,Sigma Aldrich,1:800)的一级抗体和在2％(v/v)HS中稀释的层粘连蛋白(ab11575,Abeam,1:300)孵育过夜。在用PBS洗涤10min达3次后，将切片在室温下用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；D1306,Thermo Fisher Scientific,0.1μg/ml)、AlexaFluor 555抗小鼠(A-21422,Thermo Fisher Scientific,1:500)和AlexaFluor488抗兔(A-11034,Thermo Fisher Scientific,1:500)二级抗体孵育2h。用一滴ProLongAntifade(Thermo Fisher Scientific)固定切片，然后将其用透明指甲油固定并晾干。使用SP8共聚焦显微镜(Leica)通过放大20倍而获得荧光图像。对整个z轴进行成像，并以大约0.2μm的步长生成z轴叠加图像。为了确定每个心肌细胞的细胞核数，本发明人只使用了沿其纵轴切割的心肌细胞。分析中排除了被细胞外基质染色层粘连蛋白包围的细胞核。对核的定量是采用盲法进行的。

将冰冻切片用苏木精和曙红(H&E)或天狼猩红(Sigma)染色。使用带有Moticam 3的Motic AE2000或Axioscan.ZI载玻片扫描仪(Carl Zeiss)对载玻片进行了可视化。

[

[

核酸掺入分析

在每个3cm培养皿中接种了4×10

脂肪酸氧化

如前所述(Huynh,F.K.等人,2014,Methods Enzymol,542,391-405)，使用[1-

流式细胞术

将1×10

甲酸酯测定

在每个3cm培养皿中接种了4×10

代谢组学

在每个3cm培养皿中培养了4×10

脂质组学

用ultra-turax均质器将小鼠心脏样本在冰上在碳酸氢铵缓冲液(150mM碳酸氢铵，pH 7)中均化。用BCA蛋白质检测试剂盒(Thermo Fisher)测定了蛋白质含量。取等当量的20μg蛋白质进行了质谱分析。如前所述(Sampaio,J.L.等人,2011,Proc Natl Acad SciUSA,108,1903-1907)，使用Lipotype GmbH(德国德累斯顿)进行了基于质谱的脂质分析。通过两步氯仿/甲醇程序提取了脂质(Ejsing,C.S.等人,2009,Proc Natl Acad Sci USA,106,2136-2141)。样本中加入了含有以下成分的内部脂质标准混合物：心磷脂16:1/15:0/15:0/15:0(CL)，神经酰胺18:1；2/17:0(Cer)，己糖神经酰胺18:1；2/12:0(HexCer)，溶血磷脂酸酯17:0(LPA)，溶血磷脂酰胆碱12:0(LPC)，溶血磷脂酰乙醇胺17:1(LPE)，溶血磷脂酰甘油17:1(LPG)，溶血磷脂酰肌醇17:1(LPI)，溶血磷脂酰丝氨酸17:1(LPS)，磷脂酸酯17:0/17:0(PA)，磷脂酰胆碱17:0/17:0(PC)，磷脂酰乙醇胺17:0/17:0(PE)，磷脂酰甘油17:0/17:0(PG)，磷脂酰肌醇16:0/16:0(PI)，磷脂酰丝氨酸17:0/17:0(PS)，胆固醇酯20:0(CE)，鞘磷脂18:1；2/12:0；0(SM)，胆固醇D6(Choi)(所有Avanti极性脂质)，三酰甘油17:0/17:0/17:0(TAG)以及二酰甘油17:0/17:0(DAG)(均来自Larodan Fine Chemicals)。萃取后，将有机相转移至输液板，并在高速真空浓缩器中干燥。将第一步干燥的提取物重新悬浮在氯仿/甲醇/丙醇(1:2:4,V:V:V)的7.5mM醋酸铵(Sigma)溶液中，并将第二步干燥的提取物重新悬浮在甲胺/氯仿/甲醇(0.003:5:1,V:V:V)的33％乙醇溶液中(所有液体均为从VWR获得的LC级液体)。使用Hamilton Robotics STARlet机械手平台来执行所有液体处理步骤，该平台具有用于有机溶剂移液的防滴控制功能。

将样本在配备有TriVersa NanoMate离子源(Advion Biosciences)的QExactive质谱仪(Thermo Scientific)上通过直接输注进行分析。在单次采集中，将样本在正离子和负离子模式下进行分析，其中MS的分辨率为Rm/z＝200＝280000，MSMS的分辨率为Rm/z＝200＝17500。MSMS由内含物列表触发，该列表包含以1Da增量扫描的相应MS质量范围

使用基于LipidXplorer的脂质鉴定软件分析了数据(Herzog,R.等人,2012,PLoSOne,7,e29851)(Herzog,R.等人,2011,Genome Biol,12,R8)。使用内部开发的数据管理系统进行了数据后处理和归一化。只有信噪比>5且信号强度比相应空白样本高5倍的脂质鉴定才被考虑用于进一步的数据分析。

所有下游分析均是在R中

生物信息学分析

使用Matlnspector(Genomatix)进行了计算机启动子分析。用BLAST比对进行了序列比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。通过专有算法(靶向转基因)设计了shRNA，或者使用pSico Oligomaker(MIT，1.5版)和BLOCK-iT RNAi Designer(LifeTechnologies)通过计算预测了shRNA。为了预测miR27b的靶标，使用了miRWalk 2.0数据库(http://mirwalk.uni-hd.de)，其中包括许多数据库，例如TargetScan、miRanda和RNA22(Dweep等人,2011,J Biomed Inform,44,839-847)。使用Image J(版本1.47)对共聚焦图像进行了量化(Schneider,C.A.等人,2012,Nat Methods 9,671-675)。

序列表

<110> 基因组生物学

UG

<120> 用于治疗心脏病的 MicroRNA 靶向剂

<130> tar103wo

<160> 8

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核酸试剂

<400> 1

accaatcagc taagct 16

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

gcagaacuua gccacuguga a 21

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核酸试剂

<400> 3

tgaatggtgt cagagaattt ttcaagagaa aattctctga caccattctt ttttc 55

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核酸试剂

<400> 4

tcgagaaaaa agaatggtgt cagagaattt tctcttgaaa aattctctga caccattca 59

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核酸试剂

<400> 5

accaatcagc taagct 16

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gcatgctgat ttgtgacttg ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

cctctgttct ccaaactgca g 21

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核酸试剂

<400> 8

accaatcagc taagct 16