一种DNA杂交增强液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及原位杂交的分子分析领域，涉及一种DNA杂交增强液及其制备方法与应用，具体涉及一种DNA杂交增强液和可与DNA分子探针结合使用的一种DNA杂交增强液的制备方法。

背景技术

原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门技术。

原位杂交技术可分为基因组原位杂交技术、荧光原位杂交技术、多彩色荧光原位杂交技术和原位PCR。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。

FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。

FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。

在目前肿瘤学中使用的分子分析技术中，荧光(FISH)原位杂交被广泛应用于检测染色体的畸形，如扩增、非整倍体、断裂、缺失、重排。FISH的敏感性和特异性主要取决于三个因素中的至少一个：(A)变性条件；(B)杂交条件；以及(C)杂交后洗涤条件。变性之后的杂交是最耗时间的，在传统的荧光原位杂交(FISH)协议中，杂交需要14到24小时，甚至可能需要72小时。

甲酰胺的使用干扰核酸碱基的Watson-Crick结合位点，从而干扰互补核酸碱基之间的氢键，是降低互补链退火温度(TM)的唯一途径，这是变性步骤所必需的。然而，尽管交变剂的使用降低了TM，但甲酰胺明显延长了杂交时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA杂交增强液及其制备方法与应用，本发明能大幅度的促进DNA分子杂交的效率和克服荧光原位杂交中杂交时间过长。

本发明提供的一种DNA杂交增强液，该DNA杂交增强液包括如下浓度组分组成：

缓冲剂的溶液作为溶质；

杂交促进剂：聚合物2～60g/100ml，有机溶剂体积百分比10～80％，蛋白质质量体积百分比0.5～10g/100ml；

盐类：1mM～750mM。

上述的DNA杂交增强液中，所述缓冲剂可包括SSC、HEPES、TRIS、磷酸钾和柠檬酸中的至少一种，提供杂交反应体系中所需的pH值；

所述DNA杂交增强液中所述缓冲剂的质量体积终浓度可为0.4％～8.8％。

进一步的，所述DNA杂交增强液的最终pH值可为6～8。

上述的DNA杂交增强液中，所述聚合物选自Ficoll、PVP、肝素、葡聚糖硫酸盐中的至少一种；

所述蛋白质包括牛血清白蛋白BSA；

所述有机溶剂选自乙二醇、甘油、1,3-丙二醇、丙二醇、甲酰胺、二甘醇甲酰胺、二甲基甲酰胺和DMSO中的至少一种；

所述盐类包括氯化钠、氯化镁、磷酸钠和磷酸镁中的至少一种；

所述盐类的浓度为10mM～500mM。

上述DNA杂交增强液具体由如下浓度组分组成：

2×SSC缓冲液或Tris缓冲液作为溶剂；

葡聚糖硫酸盐质量体积百分比为40g/100ml、甲酰胺体积百分比为10％及BSA质量体积百分比为1g/100ml；

氯化钠300mM和氯化镁10mM。

上述DNA杂交增强液中，所述溶剂为所述2×SSC缓冲液或Tris缓冲液组成；

所述2×SSC缓冲液由氯化钠、柠檬酸钠(或二水柠檬酸钠)和水组成，具体可为氯化钠17.6g，柠檬酸钠(或二水柠檬酸钠)8.8g，双蒸馏水定容到1L制成；

所述Tris缓冲液由Tris 3～60g，双蒸馏水定容到1L制成，具体可为Tris6.058g双蒸馏水定容到1L。

在本发明所述增强液中，所述有机溶剂如甲酰胺在杂交阶段起着变性剂的作用，干扰互补核酸碱基之间的氢键，在杂交过程中明显延长了杂交时间，降低甲酰胺的含量可以缩短杂交时间；杂交促进剂能与水结合，从而减少了杂交液的有效容积，相对提高了探针的浓度，大大提高了杂交速率；葡聚糖硫酸盐和BSA可以改善信号强度和背景染色；一般情况下，随着葡聚糖硫酸和BSA浓度的增加，信号强度增大，背景降低。

本发明中，所述盐类为300mM氯化钠和10mM氯化镁的组合，核酸分子的杂交依赖盐离子的浓度，减少寡核苷酸所带电荷，增加寡核苷酸之间的接触机会。

本发明还提供了一种上述的DNA杂交增强液的制备方法，包括如下步骤：所述缓冲液中加入所述杂交促进剂混合，最后入所述盐类混合，即得到所述的DNA杂交增强液。

本发明具体方法为2×SSC的缓冲液中加入杂交促进剂40％葡聚糖硫酸盐、10％甲酰胺及1％BSA，再加入盐类使氯化钠的终浓度300mM、氯化镁终浓度10mM，即得到本发明的杂交增强液。

本发明所述的DNA杂交增强液应用于在DNAFISH产品中。

上述应用中，所述的杂交增强液与含杂交液的商业探针的体积比可为2～8:1，具体可为4：1。

本发明具有以下优点：

1、本发明DNA分子杂交增强液，在传统的FISH杂交液的基础上，添加了高分子聚合物硫酸葡聚糖，可形成三维孔隙结构，因此能够促进荧光原位杂交的效率，大大缩短了杂交时间，由原来14-24小时缩短到1-2小时。

2、本发明杂交液中添加了硫酸葡聚糖，并调整了传统组分氯化钾、柠檬酸钠、甲酰胺的浓度；得到的杂交混合液具有较好的杂交效果，并且使用本发明杂交后探针结果仍然具有极高的信噪比，并且具有很高的特异性和敏感性。

3、探针用量减少到原来的五分之一，节约了探针成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中DNA杂交增强液与FISH检测试剂ERBB2/CCP17探针3:1使用，在石蜡样本上杂交2小时的检测结果。

图2为本发明实施例2中DNA杂交增强液与FISH检测IGH Break Apart探针3:1在细胞学样本上杂交1.5小时的检测结果图。

图3为对比例1中用FISH检测ERBB2/CCP17探针在石蜡样本上过夜杂交18小时的检测结果。

图4为对比例2中用FISH检测IGH Break Apart探针在细胞学样本上过夜杂交18小时的检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，细胞为正常人EBV转化淋巴细胞，来源是中国科学院昆明细胞库。

下述实施例中，本发明DNA杂交增强液由组成及含量的组分制成：

缓冲液：2×SSC(氯化钠17.6g，柠檬酸钠(二水柠檬酸钠)8.8g，双蒸馏水定容到1L)；

杂交促进剂：葡聚糖硫酸盐质量体积百分比40g/100ml、甲酰胺体积百分比10％及BSA(牛血清白蛋白)质量体积百分比1g/100ml；

盐类：终浓度300mM氯化钠和10mM氯化镁；

本发明DNA杂交增强液制备方法，包括如下步骤：将2×SSC和1×Tris的缓冲液中加入杂交促进剂40％葡聚糖硫酸盐、10％甲酰胺及1％BSA，再加入盐类使氯化钠的终浓度300mM、氯化镁终浓度10mM，即得到DNA杂交增强液。

实施例1、

石蜡切片样本按照如下方法制备：

1、石蜡切片厚度4-5μm，并以原位杂交专用载玻片捞片，切片65℃烤片；切片依次浸没于二甲苯10min×2，无水乙醇5min×2，风干切片2-5min；

2、微波炉加热，将考普林瓶放入微波炉中，以100％的功率加热，直到溶液开始沸腾。当溶液开始沸腾时，立即在微波炉中以10-20％的功率加热15min，使溶液保持在略低于沸点的温度。随即移入室温的纯化水中浸泡3min；

3、玻片浸没于37℃预热的蛋白酶工作液(提供商购于Sigma公司，产品目录号为77160-100G)中孵育20min，镜下观察至细胞轮廓清晰分散均匀，随即移入室温的纯化水中浸泡3min；切片依次浸没于体积百分含量70％、85％、100％的乙醇各2min，随后风干切片2-5min；

4、本发明使用的探针为ERBB2/CCP17 FISH Probe Kit，商购于CytoTest公司，Cat：CT-PAC001-10-OG)，探针和杂交增强液以1:4的比例充分混匀，滴加10μL探针混合物于组织中心，盖上盖玻片使液体浸没组织表面并排尽气泡，以封片胶封住盖玻片边缘；将玻片置于杂交仪中，83℃共变性5min，37℃孵育2h；与只使用探针的常规实验同时杂交；

5、杂交后以眼科镊小心移除封片胶；浸没于室温的缓冲液(2×SSC)并轻轻晃动使盖玻片与之分离；浸没于70℃的洗液(0.3％NP-40)中2min并轻轻晃动；浸没于室温的洗液(0.1％NP-40)中1min并轻轻晃动；依次浸没于70％、85％、100％的乙醇各1min并轻轻晃动，随即室温避光自然晾干；

6、滴加10～20μL DAPI封片剂于杂交区域中心，盖上盖玻片并排尽气泡，避光放置至少30min，于荧光显微镜下选择合适的滤光模块及放大倍数观察结果。加入杂交增强液的玻片，其红绿信号，具有较好的杂交效果，信号亮度强，特异性好，对比结果见下表1。

表1 石蜡切片样本DNA杂交结果

用本发明上述DNA杂交增强液与FISH检测试剂ERBB2/CCP17探针4:1使用，在石蜡样本上杂交2小时的检测结果，如图1所示。

实施例2、

细胞学样本按照如下方法制备：

1、收获细胞：将培养后或者未培养的细胞收集到刻度离心管中，离心弃上清液；

2、低渗：加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置于37℃恒温水浴箱低渗处理20-30分钟；

3、预固定：加入新配制的固定液(甲醇：冰乙酸＝3:1)，用吸管小心吹打混匀，离心弃上清。固定：加入固定液，吹打混匀后，固定20分钟。离心弃上清液。再固定：重复4步骤2遍或以上，直至细胞沉淀洗白洗干净。

4、细胞悬液的制备：依据细胞数量的多少加入适量新配制的固定液，吹打细胞制成悬液。吸取少量细胞悬液，滴至干净的载玻片上，每片滴2～3滴，充分扩散，室温晾干。

5、玻片浸没于37℃的缓冲液(2×SSC)，平衡5min；切片浸没于37℃预热的蛋白酶工作液中孵育10min镜下观察至细胞轮廓清晰；

6、浸没于缓冲液(2×SSC)，室温洗片5min；浸没于甲醛固定液室温固定5min；浸没于缓冲液(2×SSC)，室温洗片5min；依次浸没于70％、85％、100％的乙醇各2min，随后自然晾干备用。

7、本发明使用的探针为IGH Break Apart FISH Probe Kit，商购于CytoTest公司，Cat：CT-PAC201-10-OG)，探针和杂交增强液以1:4的比例充分混匀，滴加10μl探针混合物于样本，盖上盖玻片使液体浸没组织表面并排尽气泡，以封片胶封住盖玻片边缘；将玻片置于杂交仪中，80℃共变性2min，37℃孵育2h；与只使用探针的常规实验同时杂交；

8、杂交后以眼科镊小心移除封片胶；浸没于室温的缓冲液(2×SSC)并轻轻晃动使盖玻片与之分离；浸没于70℃的洗液(0.3％NP-40)中2min并轻轻晃动；浸没于室温的洗液(0.1％NP-40)中1min并轻轻晃动；依次浸没于70％、85％、100％的乙醇各1min并轻轻晃动，随即室温避光自然晾干；

9、滴加10～20μl DAPI封片剂于杂交区域中心，盖上盖玻片并排尽气泡，避光放置至少30min，于荧光显微镜下选择合适的滤光模块及放大倍数观察结果。加入杂交增强液的玻片，其红绿信号，具有较好的杂交效果，信号亮度强，特异性好，对比结果见下表2。

表2 细胞学样本DNA杂交结果

用本发明DNA杂交增强液与FISH检测IGH Break Apart探针4:1在细胞学样本上杂交1.5小时的检测结果，如图2所示。

对比例1、

与本发明实施例1中方法相同，不同的是只用FISH检测ERBB2/CCP17探针在石蜡样本上过夜杂交18小时，其检测结果如图3所示。

对比例2、

与本发明实施例2中方法相同，不同的是只用FISH检测IGH Break Apart探针在细胞学样本上过夜杂交18小时，其检测结果如图4所示。

通过对本发明实施例1和对比例1以及实施例2和对比例2的结果(由图1与3、图2与4)对比观察，能明显看到实施例1和实施例2的结果在信号强度和背景干扰方面都优于对比例1和对比例2。

北京思尔成生物技术有限公司2020年6月-2020年12月ERBB2/CCP17实验中添加和未添加DNA杂交增强液对比数据统计结果如下表3所示：

表3 ERBB2/CCP17实验中添加和未添加DNA杂交增强液结果

从以上表3中数据可以证实，使用本发明DNA杂交增强液与FISH检测试剂盒一起使用，在对细胞学样本和组织学样本进行FISH检测过程中，对结果的判读无影响，并且可以减少探针使用量，增强信号强度，减少背景干扰的作用是十份有效的。具有以下有益效果：

1、添加本发明的探针大大缩短了杂交时间，由原来14-24小时缩短到1-2小时。

2.、使用本发明的探针结果具有极高的信噪比，并且具有很高的特异性和敏感性。

3、探针用量减少到原来的五分之一，节约了探针成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。