一种组合物的功效成分检测方法

技术领域

本发明属于药物的成分检测领域，涉及一种组合物的功效成分检测方法和制剂上的应用。

背景技术

国家药监部门鼓励多靶点的药物开发，多靶点的药物往往是多组分的药物，多组分药物是发挥整体作用，不是单一成分的简单相加。对于组合物的质量控制，有两种路径，一种是控制功效成分，一种是控制含量成分，在药物开发的实践中，经常通过图谱主要特征峰的峰位，面积或比例，来反映出化学成分的种类、含量。

据世界卫生组织调查显示，全球约有10～49％的人患有不同程度的睡眠障碍，对基层医疗就诊的病人进行调查,约27％的患者有睡眠问题。我国20％～30％的人群患有不同程度的睡眠疾病,老年群体睡眠疾病的发病率更是高达40％，睡眠不足和睡眠质量问题已经成为重要的世界性公共健康问题之一。2001年，国际精神卫生组织主办的全球睡眠和健康计划将每年的3月21日定为“世界睡眠日”，2003年，中国睡眠研究会把“世界睡眠日”正式引入中国。

酸枣仁，为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou 的干燥成熟种子。性甘、酸，平。归肝、胆、心经。养心补肝，宁心安神，敛汗，生津。用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴，为养心安神、治虚烦不眠要药，被医生和患者赞为“东方睡果”。《本草纲目》中记载，枣仁“熟用疗胆虚不得眠，烦渴虚汗之症；生用疗胆热好眠，皆足厥阴少阳药也。现代药理证明，酸枣仁总皂苷能够增加总睡眠时间，总黄酮具有镇静催眠作用，多糖具有降低自主活动性的作用。

灵芝，为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体。性甘，平。归心、肺、肝、肾经。补气安神，止咳平喘。用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食。自古有“仙草”、“瑞草”、“还阳草”、“灵草”等美称。东汉《神农本草经》将灵芝列为上品，灵芝安神、益精气、增智慧、治胸中结，久服轻身不老。《中华人民共和国药典》收载灵芝(赤芝、紫芝)子实体为法定中药材。2000年版《美国草药药典和治疗概要》收载了灵芝。灵芝对中枢神经系统有明显镇静作用，能使动物的自发性活动减少，肌肉轻度松弛，并能增强巴比妥类药物的中枢抑制作用，但本身并无催眠或麻醉作用。

电喷雾检测器(CAD)是近年发展较快的一种检测器，由于其与传统紫外检测器、蒸发光检测器和示差折光检测器相比具有灵敏度高、重复性好、信号响应一致、动态检测范围宽、操作直观简单等优势，在药学和保健食品功效成分检测中应用越来越广泛。

目前，保健食品中的酸枣仁一般采用《中国药典》2015年版一部HPLC法检测酸枣仁皂苷A，或《保健食品检验与评价技术规范》2003年版检测总皂苷。灵芝一般采用《中国药典》2015年版一部检测多糖，或NY/T 2278-2012《灵芝产品中灵芝酸含量的测定高效液相色谱法》检测灵芝酸。总皂苷和多糖的检测采用分光光度法，针对某一类成分分析，虽然快速简便，但准确度相对不高，没有专属性。在本保健食品配方中同时含有酸枣仁和灵芝，分别检测操作繁琐、耗时，如果能发明一种检测方法能同时检测产品中的酸枣仁和灵芝，将大大简化分析时间，减少分析成本。

在现有技术中，虽然有文献报道一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，但是，活性成分的来源都仅仅限于酸枣仁，因此，该文献的检测方法不能对本发明构成技术启示。

在现有技术中，虽然有文献报道一种采用麦芽、百合、灵芝、酸枣仁配伍得到的安神茶；虽然有文献报道采用黄芪、灵芝、酸枣仁、伏苓、大枣、甘草、猪血为原料配伍得到中药成药，其适应症包括适用于心脾两虚所致的心悸，失眠健忘，多梦易醒等；虽然有文献报道采用拟黑多刺蚁干粉、赤灵芝干粉、炒酸枣仁干粉配伍得到深睡眠促进剂；虽然有文献报道采用灵芝多糖和酸枣仁总皂甙制备得到改善睡眠和治疗失眠症的药物组合物；虽然有文献报道由灵芝、茯苓和酸枣仁组成的助眠保健食品，虽有文献报道由五味子的木脂素提取物、灵芝的水提物和酸枣仁的醇提物组成的改善睡眠功效组合物。但采用不同提取方法得到的提取物的药效成分都是不同，由于这些文献没有公开如何对有效成分进行检测，因此，从现有技术中得到效率高、稳定强、专属性强的有效成分分析方法并用于开发改善睡眠的组合物，这是难以预料得到。

γ-氨基丁酸，简称GABA，是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，作为中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，广泛存在于人体大脑的皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中，起信息传递作用，具有极其重要的生理功能。它能健脑益智，延缓脑衰老机能，抗癫痫，促进睡眠。随着年龄的增长和精神压力的加大，GABA在人脑中的合成减少，当人体内缺乏时，会产生焦虑、不安、疲劳、失眠等症状，一般长久处于高压力竞争环境中的人群，都很容易缺乏GABA，需要及时补充，以降低神经元活性，防止神经细胞过热，以便舒缓压力。国内外大量研究表明，补充GABA后可缩短入睡时间，延长深度睡眠的时间，并有抗焦虑，镇静等作用。因其可促使大脑冷静下来，又被称为“大脑天然镇静剂”。

美国食品药品监督管理局(FDA)根据毒理学实验结果指出食品中添加GABA是安全的，使用范围包含饮料、咖啡、茶和口香糖等，但不允许在婴儿食品、肉制品或含肉产品中添加。

中国卫生部2009年12号公告，批准GABA为新资源食品，GABA是以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料淀粉、喷雾干燥等步骤生产而成。但是， GABA摄入量不得超过500mg/d，使用范围为饮料、可可制品、巧克力及其饮料、糖果、焙烤食品和膨化食品，但婴儿食品中不能添加。

通过保健食品处方数据库检索可知，目前改善睡眠类保健食品以酸枣仁及其提取物为主要原料的批文有229个，以灵芝及其提取物为主要原料的批文有85个，而以γ-氨基丁酸为主要原料的批文只有1个，尚无三者复配的保健食品。因此，通过深度开发涉及三者复配的保健食品是有价值的，这些产品的开发需要需要监控包括GABA、酸枣仁活性成分、灵芝活性成分的含量，这是本发明所要解决的技术问题。

发明内容

本发明公开了一种同时检测酸枣仁皂苷A和灵芝酸A含量的方法，采用的技术方案如下：

1、标准溶液的配制

酸枣仁皂苷A储备液：精密称取10mg酸枣仁皂苷A对照品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，备用。

灵芝酸A储备液：准确称取10mg灵芝酸A标准品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，备用。

2、供试品溶液的制备

精密称取供试品800mg于索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)适量加热回流2h，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，加入70％乙醇20mL，加热回流2h，滤过，滤渣用70％乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，备用。

3、色谱条件

色谱柱：Acclaim

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

Corona Ultra CAD检测器雾化室温度：35℃

流动相梯度洗脱：

4、样品测定

将标准溶液进行HPLC分析，积分计算得到该标准溶液的保留时间、色谱峰面积，以标准溶液浓度为横坐标，标准溶液峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。将供试品溶液进行同样条件的HPLC分析，以标准液的保留时间定性，再积分计算得到该供试品溶液的色谱峰面积，代入标准曲线方程，得到供试品溶液浓度，并计算待测物质的含量。

本发明的目的在于解决以上问题，提供一种含γ-氨基丁酸、酸枣仁和灵芝提取物的组合物，以解决单一成分改善睡眠效果差的问题，所述的组合物采用特定比例的γ-氨基丁酸、酸枣仁、灵芝，三者复配使用有协同作用，大大增强了改善睡眠的功效。

本发明所提供的改善睡眠组合物由以下重量份数的成分组成：γ-氨基丁酸1-5份；酸枣仁30-50份；灵芝10-30份。

本发明所提供的改善睡眠组合物由以下重量份数的成分组成：γ-氨基丁酸1-5份；酸枣仁30-50份；灵芝10-30份，甘露糖醇1-3份，硬脂酸镁1-2。

本发明的创新点：

创新点1：改善睡眠组合物的重量份数的优选过程

将ICR小鼠随机分为空白对照组和受试物组，每组12只。经口灌胃30d后，通过直接睡眠、延长戊巴比妥钠睡眠时间、巴比妥钠阈下剂量催眠和巴比妥钠睡眠潜伏期实验评价受试物的改善睡眠作用。研究发现，与空白对照组相比，各受试物的直接睡眠实验结果皆为阴性，单个组分对睡眠均有不同改善作用，三者配伍使用，改善睡眠效果更显著。

创新点2：色谱条件中流动相的优选过程

在30-40min时，流动相为乙腈:0.1％甲酸溶液＝30:70(V/V)，灵芝酸A未达到基线分离(图1)；改为乙腈:0.1％甲酸溶液＝20:80(V/V)后，灵芝酸A达到基线分离，峰型较好(图2)。

附图说明

图1色谱条件中流动相的筛选之一

图2色谱条件中流动相的筛选之二

具体实施方式

实施例1

配制以下重量份原料：γ-氨基丁酸3份；酸枣仁40份；灵芝20份；甘露糖醇2份；硬脂酸镁1份。

制备方法如下：

1、提取：按配方比例称量酸枣仁、灵芝饮片，加水煎煮2次。第1次加水15倍量，回流提取2h；第二次加水10倍量水，回流提取1h。

2、过滤：将两次提取液分别经200目筛网过滤，合并滤液。

3、浓缩：上述滤液于60-70℃，-0.08～-0.1MPa条件下减压浓缩至密度为1.05～1.10g/cm

4、干燥：将浓缩液在进口95～105℃，出口75～85℃条件喷雾干燥。

5、混合：按配方比例将γ-氨基丁酸、甘露糖醇、硬脂酸镁与上述喷干粉混合均匀。

6、压片：用压片机压片，0.45g/片；

7、内包装：60片/瓶；

8、外包装：用符合GB/T 6543运输包装用单瓦楞纸箱和双瓦楞纸箱的纸箱包装；

11、质检：由质检员进行成品检验；

12、入库；入库贮藏。

实施例2

配制以下重量份原料：γ-氨基丁酸1份；酸枣仁50份；灵芝30份；甘露糖醇1份；硬脂酸镁1份。

制备方法同实施例1。

实施例3

配制以下重量份原料：γ-氨基丁酸5份；酸枣仁30份；灵芝10份；甘露糖醇3份；硬脂酸镁2份。

制备方法同实施例1。

实施例4

改善睡眠组合物的重量份数的优选过程

1、材料与试剂

1.1动物

SPF级ICR雌性小鼠，体重18～22g，由中国医学科学院协和医科大学动物研究所提供。

1.2材料与仪器

灵芝酸枣仁氨基丁酸片，实验室自制；

戊巴比妥钠和巴比妥钠均为分析纯，购于上海化学试剂公司。

XS105型电子天平，METTLER TOLEDO。

2、实验内容

2.1动物分组及处理

成人(60kg)推荐摄入量为1.8g/人·d，相当于30mg/kg·d。将小鼠随机分组，每组12只。受试物组灌胃给药，灌胃量20mL/kg，连续给药30d，空白对照组灌胃相同体积的蒸馏水。

2.2直接睡眠试验

各组动物给予受试物，观察灌胃后1h内，小鼠是否出现睡眠现象，以动物的翻正反射消失超过60s 判为进入睡眠，比较空白对照组和受试物各组对小鼠的直接催眠的影响。

2.3延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

参考《保健食品检验与评价技术规范》

2.4戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

参考《保健食品检验与评价技术规范》

2.5巴比妥钠睡眠潜伏期试验

参考《保健食品检验与评价技术规范》

2.6统计学方法

实验结果用Excel软件建立数据库，SPSS 17.0统计软件分析，数据用均数±标准差(x±s)表示，计数资料采用卡方检验，计量资料采用单因素方法分析(one-way ANOWA)或秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1直接睡眠试验

给药结束后，空白对照组小鼠动物全部为清醒状态；实验组部分小鼠出现安静、活动减少及嗜睡的状态，但均未出现睡眠现象(即没有翻正反射消失小鼠)。说明灵芝酸枣仁氨基丁酸片对小鼠无直接睡眠作用，本实验结果为阴性。

3.2延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

按照《保健食品检验与评价技术规范》，在戊巴比妥钠催眠基础上，若配方干预后小鼠睡眠时间延长，说明配方与戊巴比妥钠有协同作用，结果见表1，空白对照组小鼠睡眠时间为(31.78±3.65)min，氨基丁酸组、酸枣仁提取物组、灵芝提取物组、灵芝酸枣仁氨基丁酸片组干预后睡眠时间为(37.20±2.80)， (36.48±3.50)，(41.93±3.47)，(42.16±4.24)min。与空白对照组比较，各组小鼠睡眠时间分别延长17.05％，14.79％，16.21％，24.48％，均具有统计学差异(P<0.01)。说明一定剂量的配方与戊巴比妥钠具有协同作用，可以极显著延长小鼠睡眠时间，且三者配合使用效果更佳。

表1连续灌胃30天后延长戊巴比妥钠睡眠时间效果

3.3戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

由表2实验结果看出，空白对照组小鼠睡眠发生率为16.67％，符合本实验10％-20％的动物入睡要求，说明30mg/kg·bw可用于戊巴比妥钠符合阈下剂量实验。氨基丁酸组、酸枣仁提取物组、灵芝提取物组、灵芝酸枣仁氨基丁酸片组的睡眠发生率分别为33.33％，33.33％，41.67％和66.67％，均高于空白对照组的睡眠发生率。与空白对照组相比，各组的睡眠发生率增加且具有显著性差异(P<0.05)，且具有剂量效应关系。

表2连续灌胃30天后对巴比妥钠睡眠发生率的影响

3.4巴比妥钠睡眠潜伏期试验

从表3实验结果中可以看出，巴比妥钠睡眠潜伏期实验中，氨基丁酸组、酸枣仁提取物组、灵芝提取物组、灵芝酸枣仁氨基丁酸片组干预后，小鼠睡眠潜伏期分别为(48.12±4.16)，(39.27±6.35)， (42.38±3.87)，(36.69±5.61)min，与空白对照比较，各组睡眠潜伏期时间分别缩短5.72％， 23.06％，16.97％，28.12％，差异均具有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明，各配方促进小鼠入睡作用良好，三者配伍效果更佳，具有缩短巴比妥钠睡眠潜伏期的作用。

表3连续灌胃30天后对小鼠睡眠潜伏期的影响

实施例5

改善睡眠片中酸枣仁皂苷A和灵芝酸同时检测方法：

1、材料与试剂

灵芝酸枣仁氨基丁酸片，实验室自制；

酸枣仁皂苷A、灵芝酸A，中国食品药品检定研究院；

甲醇、甲酸、乙醇、乙腈，MREDA；

石油醚，天津市大茂化学试剂厂；

2、仪器与设备

XS105型电子天平，METTLER TOLEDO；

KQ-500DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；

HH-8数显恒温水浴锅，上海皓庄仪器有限公司；

U3000型HPLC，Corona Ultra CAD检测器，Thermo Scientific。

3、实验方法

(1)标准溶液的配制

酸枣仁皂苷A储备液：准确称取10mg酸枣仁皂苷A对照品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即为储备液。

灵芝酸A储备液：准确称取10mg灵芝酸A标准品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即为储备液。

(2)供试品溶液的制备

精密称取供试品800mg于索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)适量加热回流2h，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，加入70％乙醇20mL，加热回流2h，滤过，滤渣用70％乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，备用。

(3)色谱条件

色谱柱：Acclaim

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

Corona Ultra CAD检测器雾化室温度：35℃

流动相梯度洗脱：

4、方法学考察

①精密度试验

取制备好的供试品溶液，按色谱条件，连续进样6次，结果相对峰面积的RSD小于3％，实验精密度良好。

②重复性试验

精密称取供试品6份，按上述方法制备供试品溶液，色谱条件分别进样，结果相对峰面积的RSD小于3％，实验重复性良好。

③稳定性试验

取制备好的供试品溶液，按色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12、18、24h，8个不同时间点进行测定，结果相对峰面积的RSD小于3％，实验稳定性良好。

④线性关系考察

酸枣仁皂苷A标准曲线的绘制：准确吸取适量标准溶液用甲醇稀释，配制质量浓度为10、25、50、 100、200μg/mL的标准工作液，按色谱条件测定，以酸枣仁皂苷A的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

样品中酸枣仁皂苷A的含量，按公式I计算。

式中：

ω——试样中酸枣仁皂苷A的质量分数，mg/g；

ρ——根据标准曲线计算的供试品溶液中酸枣仁皂苷A的质量浓度，μg/mL；

V——供试品溶液定容体积，mL；

m——试样的质量，mg。

灵芝酸A标准曲线的绘制：准确吸取适量标准溶液用甲醇稀释，配制质量浓度为10、25、50、100、 150μg/mL的标准工作液，按色谱条件测定，以灵芝酸A的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

样品中灵芝酸A的含量，按公式II计算。

式中：

ω——试样中灵芝酸A的质量分数，mg/g；

ρ——根据标准曲线计算的供试品溶液中灵芝酸A的质量浓度，μg/mL；

V——供试品溶液定容体积，mL；

m——试样的质量，mg。

结果显示，16.2min处为酸枣仁皂苷A的保留时间，32.5min处为灵芝酸A的保留时间，其保留时间稳定，峰型较好。

实施例6

色谱条件中流动相的优选过程：

实验方法同实施例5中的3。在30-40min时，流动相为乙腈:0.1％甲酸溶液＝30:70(V/V)时，灵芝酸A未达到基线分离(如图1)；改为乙腈:0.1％甲酸溶液＝20:80(V/V)后，灵芝酸A达到基线分离，峰型较好，(如图2)。

实施例7：改善睡眠片中GABA的检测方法

虽然，深度开发涉及三者复配的保健食品的关键在于同时检测酸枣仁皂苷A和灵芝酸，这样能提高检测效率，但是，依然需要监控GABA的含量，这样能提高检测的成分的全面性。

1、材料与试剂

灵芝酸枣仁氨基丁酸片，实验室自制；

γ-氨基丁酸，美国草药药典；

乙醇、乙腈，HPLC级，MREDA；

碳酸氢钠、三水合乙酸钠，AR级，天津市光复科技发展有限公司；

4-二甲基胺基偶氮苯-4磺酰氯，AR级，北京伊诺凯科技有限公司。

2、仪器与设备

XS105型电子天平，METTLER TOLEDO；

KQ-500DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；

VM-2500多管旋涡混合仪，美国安胜科技有限公司；

HH-8数显恒温水浴锅，上海皓庄仪器有限公司；

U3000型HPLC，Thermo Scientific。

3、实验方法

(1)标准溶液的配制

γ-氨基丁酸标准储备液：精确称取10mgγ-氨基丁酸标准品于10ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即为储备液。

γ-氨基丁酸标准使用液：将标准储备液逐级稀释成2.0、5.0、10.0、50.0、100.0mg/L即得。

(2)试液配制

碳酸氢钠溶液：称取0.4g碳酸氢钠，用水溶解并稀释至10mL。

DABS-Cl溶液：称取20mg 4-二甲基胺基偶氮苯-4磺酰氯，用乙腈溶解并稀释至10mL。

三水合乙酸钠溶液：称取3.4g三水合乙酸钠，用水溶解并稀释至500mL，0.45μm滤膜过滤。

(3)供试品溶液的制备

称取供试品250mg于100mL容量瓶中，加入适量提取液(乙醇+水＝4+1)超声30min，冷却至室温，定容，摇匀备用。

(4)衍生化

准确吸取1mL供试品溶液或标准使用液于具塞试管中，加入0.2mL碳酸氢钠溶液和0.4mL DABS-Cl 溶液，混匀后在70℃水浴中衍生反应20min，0.45μm滤膜过滤。

(5)色谱条件

色谱柱：Acclaim

检测波长：436nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

流动相：乙腈+三水合乙酸钠溶液(35+65)；

流速：1.0mL/min；

结果显示，9.6min处为γ-氨基丁酸的保留时间，其保留时间稳定，峰型较好。

参考文献

[1]中国药典[M].北京:中国医药科技出版社，2015.

[2]保健食品检验与评价技术规范[M].北京:人民卫生出版社，2003.