一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白

技术领域

本发明涉及糖蛋白制备技术领域，尤其涉及一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白。

背景技术

人体内共生着大量的微生物，尤其是肠道微生物是人体最重要的“内生环境因素”，拥有100余菌属，400余菌种，其数目是人体自身细胞的10倍左右，肠道菌群作为构成人体胃肠道必不可少的一部分，其中超过90％的物种分属于拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。现代研究表明，人体的健康与肠道微生物有密不可分的联系。

蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与，而多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，中药多糖在调节肠道菌群方面具有许多优越性，其存在广泛、稳定性强、较易保存和价格较低等。

因此提供一种具有调节肠道菌群结构，尤其是能够调节多种原因导致的肠道菌群紊乱，能够用于不同疾病状态下肠道菌群结构的调节，功效更加全面，且安全性高、无不良反应的组合物。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白，该糖蛋白由以下原料制成：马铃薯水提物30％-40％、甘露糖5％-8％、麸皮水提物8％-12％大米水提物10％-12％、KH2PO4 1％-5％、MgSO4 2％-6％，FeSO42％-8％、ZnSO4 3％-8％、NaHCO3 1％-6％和水20％-40％。

优选的，所述糖蛋白制备方法包括如下步骤：

S1、菌种活化；

S2、液体种子液的制备；

S3、液体种子培养；

S4、深层发酵培养基的制备；

S5、液体发酵培养；

S6、组合物的制备。

优选的，所述S1步骤的菌种活化包括如下步骤：

A1、在超净台中，从鸡腿蘑菌种试管中用接种针挑取3块至4块绿豆大小般的菌丝，接种于PDA培养基上；

A2、对培养基进行密封，并放置到培养箱中；

A3、设定培养箱温度为20摄氏度至30摄氏度，进行活化培养，至斜面长满菌丝；

A4、取出培养物，放置到冰箱内部，设定温度为2摄氏度至5摄氏度，低温保存，即可得到活化菌种。

优选的，所述S2步骤的液体种子液的制备包括如下步骤：

B1、将马铃薯切成1立方厘米至1.5立方厘米的小块，加入自来水中，小火微沸30分钟至40分钟，使其煮烂；

B2、将煮烂的马铃薯经8层纱布过滤，加入麸皮，再次小火煮沸15分钟至20分钟；

B3、再次经过8层纱布过滤，然后加入甘露糖、KH2PO4和MgSO4，搅拌均匀进行溶解，并且不足水分；

B4、将培养基转入100毫升规格的锥形瓶中，装液量为40毫升至60毫升，加塞子、报纸包装好，置于高压灭菌锅中灭菌20分钟至25分钟，即可得到液体种子液。

优选的，所述S3步骤的液体种子培养包括如下步骤：

C1、在超净台中，从鸡腿蘑活化菌种上挑取6—8块绿豆般大小的菌丝；

C2、将菌丝接种于种子培养液中，均匀接种；

C3、将培养液放置到摇床中，设定转动速率为150转每分钟至200转每分钟，温度为25摄氏度至30摄氏度，持续3天至5天，进行培养，即可完成液体种子培养。

优选的，所述S4步骤的深层发酵培养基的制备包括如下步骤：

D1、将马铃薯切成1立方厘米至1.5立方厘米的小块，加入到自来水中，小火微沸30分钟至40分钟；

D2、经8层纱布过滤后，加入麸皮，小火微沸15分钟至20分钟；

D3、再次经8层纱布过滤后，加入大米，小火微沸30分钟至35分钟；

D4、第三次经过8层纱布过滤后，按比例加入甘露糖、MgSO4、KH2PO4、FeSO4、ZnSO4和NaHCO3，搅拌使其溶解，补足水分，即可得到深层发酵培养基。

优选的，所述S5步骤的液体发酵培养包括如下步骤：

E1、将液体种子以10％的接种量接种于发酵培养基中，放置到摇床中培养；

E2、设定转动速率为150转每分钟至200转每分钟，温度为25摄氏度至30摄氏度，持续3天至5天，即可完成液体发酵培养。

优选的，所述S6步骤的组合物的制备包括如下步骤：

F1、发酵结束后，抽滤将菌丝体和发酵液分离，菌丝体50摄氏度至55摄氏度条件下烘干；

F2、称取菌丝体10克于烧杯中,加100mLTris-HCl缓冲液,搅拌混匀,在50摄氏度至55摄氏度条件下，水浴浸提1小时至1.5小时；

F3、对浸提液进行过滤，然后浓缩至20毫升至25毫升，得到浓缩液；

F4、在浓缩液中加入1/5量的sevage试剂，搅拌20分钟至25分钟，在10000转每分钟至12000转每分钟速率下，冷冻离心，持续10分钟至15分钟，得到上层液；

F5、重复两次，直至中间无变性蛋白,弃下层氯仿,合并上层液至透析袋,进行透析,得到鸡腿蘑发酵菌丝体糖蛋白液；

F6、将鸡腿蘑发酵菌丝体糖蛋白液进行冷冻干燥，即可得到鸡腿蘑菌丝体糖蛋白。

优选的，所述鸡腿蘑糖蛋白为内服剂型，且可以制作片剂、丸剂、分散剂、颗粒剂、中药饮片或喷雾剂。

本发明提供的一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白，通过大量实验筛选，以固定的发酵提取方式组合后，能有针对性地改变肠道菌群，调节肠道菌群结构，改善肠道健康，可以特异性增殖机体肠道中的双歧杆菌，从而使肠道环境改变为酸性，抑制有害菌群的增殖，促进肠蠕，能促进乳酸杆菌增殖，从而保护肠道功能、调节免疫功能，能够抑制大肠杆菌和肠球菌增殖，保护肠道菌群健康，对多种原因导致的肠道菌群紊乱均显示出了很好的调节作用，取得了非常好的技术效果，在制备调节肠道菌群结构的药物或特殊医学用途配方食品或保健品中都有良好的应用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：

一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白，该糖蛋白由以下原料制成：马铃薯水提物30％-40％、甘露糖5％-8％、麸皮水提物8％-12％大米水提物10％-12％、KH2PO4 1％-5％、MgSO4 2％-6％，FeSO4 2％-8％、ZnSO4 3％-8％、NaHCO3 1％-6％和水20％-40％。

作为优选的，所述糖蛋白制备方法包括如下步骤：

S1、菌种活化；

S2、液体种子液的制备；

S3、液体种子培养；

S4、深层发酵培养基的制备；

S5、液体发酵培养；

S6、组合物的制备。

作为优选的，所述S1步骤的菌种活化包括如下步骤：

A1、在超净台中，从鸡腿蘑菌种试管中用接种针挑取3块至4块绿豆大小般的菌丝，接种于PDA培养基上；

A2、对培养基进行密封，并放置到培养箱中；

A3、设定培养箱温度为20摄氏度至30摄氏度，进行活化培养，至斜面长满菌丝；

A4、取出培养物，放置到冰箱内部，设定温度为2摄氏度至5摄氏度，低温保存，即可得到活化菌种。

作为优选的，所述S2步骤的液体种子液的制备包括如下步骤：

B1、将马铃薯切成1立方厘米至1.5立方厘米的小块，加入自来水中，小火微沸30分钟至40分钟，使其煮烂；

B2、将煮烂的马铃薯经8层纱布过滤，加入麸皮，再次小火煮沸15分钟至20分钟；

B3、再次经过8层纱布过滤，然后加入甘露糖、KH2PO4和MgSO4，搅拌均匀进行溶解，并且不足水分；

B4、将培养基转入100毫升规格的锥形瓶中，装液量为40毫升至60毫升，加塞子、报纸包装好，置于高压灭菌锅中灭菌20分钟至25分钟，即可得到液体种子液。

作为优选的，所述S3步骤的液体种子培养包括如下步骤：

C1、在超净台中，从鸡腿蘑活化菌种上挑取6—8块绿豆般大小的菌丝；

C2、将菌丝接种于种子培养液中，均匀接种；

C3、将培养液放置到摇床中，设定转动速率为150转每分钟至200转每分钟，温度为25摄氏度至30摄氏度，持续3天至5天，进行培养，即可完成液体种子培养。

作为优选的，所述S4步骤的深层发酵培养基的制备包括如下步骤：

D1、将马铃薯切成1立方厘米至1.5立方厘米的小块，加入到自来水中，小火微沸30分钟至40分钟；

D2、经8层纱布过滤后，加入麸皮，小火微沸15分钟至20分钟；

D3、再次经8层纱布过滤后，加入大米，小火微沸30分钟至35分钟；

D4、第三次经过8层纱布过滤后，按比例加入甘露糖、MgSO4、KH2PO4、FeSO4、ZnSO4和NaHCO3，搅拌使其溶解，补足水分，即可得到深层发酵培养基。

作为优选的，所述S5步骤的液体发酵培养包括如下步骤：

E1、将液体种子以10％的接种量接种于发酵培养基中，放置到摇床中培养；

E2、设定转动速率为150转每分钟至200转每分钟，温度为25摄氏度至30摄氏度，持续3天至5天，即可完成液体发酵培养。

作为优选的，所述S6步骤的组合物的制备包括如下步骤：

F1、发酵结束后，抽滤将菌丝体和发酵液分离，菌丝体50摄氏度至55摄氏度条件下烘干；

F2、称取菌丝体10克于烧杯中,加100mLTris-HCl缓冲液,搅拌混匀,在50摄氏度至55摄氏度条件下，水浴浸提1小时至1.5小时；

F3、对浸提液进行过滤，然后浓缩至20毫升至25毫升，得到浓缩液；

F4、在浓缩液中加入1/5量的sevage试剂，搅拌20分钟至25分钟，在10000转每分钟至12000转每分钟速率下，冷冻离心，持续10分钟至15分钟，得到上层液；

F5、重复两次，直至中间无变性蛋白,弃下层氯仿,合并上层液至透析袋,进行透析,得到鸡腿蘑发酵菌丝体糖蛋白液；

F6、将鸡腿蘑发酵菌丝体糖蛋白液进行冷冻干燥，即可得到鸡腿蘑菌丝体糖蛋白。

作为优选的，所述鸡腿蘑糖蛋白为内服剂型，且可以制作片剂、丸剂、分散剂、颗粒剂、中药饮片或喷雾剂。

作为优选的，所述多糖与蛋白质含量分别为54.8％和20.3％。

作为优选的，所述经液体发酵后的鸡腿蘑糖蛋白中多糖分子量在1KD-1500KD，蛋白质分子量在30-90KD。

实施例二

一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白，该糖蛋白由以下原料制成：马铃薯水提物40％、甘露糖5％、麸皮水提物8％大米水提物8％、KH2PO4 2％、MgSO43％，FeSO4 3％、ZnSO4 4％、NaHCO3 5％和水22％。

S1、菌种活化：在超净台中，从鸡腿蘑菌种试管中用接种针挑取3块至4块绿豆大小般的菌丝，接种于PDA培养基上，密封，于培养箱26℃活化，待斜面长满菌丝，于4℃冰箱保存；

S2、液体种子液的制备：将马铃薯40g切成1cm3小块，加入200mL自来水中，小火微沸30min，使其煮烂(期间应不断抹去泡沫)，经8层纱布过滤后，加入2％麸皮，小火煮沸15min，8层纱布过滤后，加入2g甘露糖、0.1gKH2PO4、0.1gMgSO4，加热搅拌使其溶解，补足水分；然后进行灭菌处理，将培养基转入100mL锥形瓶中，装液量为50mL，加塞子、报纸包装好，置于高压灭菌锅中灭菌20min；

S3、液体种子培养：在超净台中，从鸡腿蘑活化菌种上挑取6—8块绿豆般大小的菌丝，接种于种子培养液中，摇床培养，180r/min，26℃培养4天；

S4、深层发酵培养基的制备：将马铃薯400g切成1cm3小块，加入2000mL自来水中，小火微沸30min，使其煮烂(期间应不断抹去泡沫)，经8层纱布过滤后，加入100g(5％)麸皮，小火微沸15min，过滤后，加入100g(5％)大米，小火微沸30min，过滤后，按如下比例加入2％甘露糖、0.1％MgSO4、0.1％KH2PO4、10mg/mLFeSO4、8mg/mLZnSO4、20mg/mLNaHCO3，搅拌使其溶解，补足水分；

S5、液体发酵培养：将液体种子以10％的接种量接种于发酵培养基中，摇床培养，160r/min，26℃培养5天；

S6、组合物的制备：发酵结束后，抽滤将菌丝体和发酵液分离，菌丝体50℃烘干，称取菌丝体10.0g于烧杯中,加100mLTris-HCl缓冲液,搅拌混匀,55℃水浴浸提1h,过滤,滤液浓缩至20mL,加1/5量的sevage试剂，搅拌20min,10000r/min冷冻离心10min,取上层液,重复2次,直至中间无变性蛋白,弃下层氯仿,合并上层液至透析袋,透析,即鸡腿蘑发酵菌丝体糖蛋白液，将其冷冻干燥后得到鸡腿蘑菌丝体糖蛋白。

实施例三

本实施例的糖蛋白在调节失重环境下肠道菌群失调中的应用，所述糖蛋白按照40mg/mL,20mg/mL,10mg/mL配置溶液。

以正常SPF级昆明小鼠为模型，小鼠体重18g-22g，分为四个组，每组10只小鼠，均为雄性：

正常对照小鼠组(记为A组)；正常小鼠+10mg/mL糖蛋白组(记为B组)；正常小鼠+20mg/mL糖蛋白组(记为c组)；正常小鼠+40mg/mL糖蛋白组(记为D组)。

A组小鼠每只灌胃0.2mL的生理盐水，隔日灌胃一次；B组、c组、D组小鼠隔日灌胃一次，第20天起每间隔1日取上述四组小鼠的粪便，提取总DNA，采用单分子核酸扩增技术(数字PCR扩增技术)，以16srDNA为靶基因，分别对双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌分别进行绝对定量分析，确定小鼠肠道中上述微生物的数量(群落结构)变化。

结果：本实施例的糖蛋白对小鼠肠道中的益生菌具有显著的促进作用，相比较于A组，B组、C组、D组的小鼠有害菌(肠杆菌和肠球菌)减少，益生菌(双歧杆菌和乳杆菌)增加，并且对于有害菌的抑制和有益菌的促进效果与剂量成正相关，为D组＞C组＞B组＞A组。