一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法

技术领域

本发明属于医学和生物技术领域，具体涉及一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)，或称细胞外囊泡(EV)，是数种起源与功能不同的，具有双层膜结构，直径为30nm～200nm的囊泡结构。其功能有参与细胞之间的信息传递与物质交换、对宿主-病原体相互关系的调节、炎症反应的介导等。外泌体的成分包括DNA、RNA、糖类、脂类与蛋白质等，由于其参与多种生理与病理过程，其成分可以作为对多种传染性疾病与肿瘤诊断的生物标志物。利用外泌体来源的生物标志物进行诊断，已经成为现代医学最受关注的新领域。通过NGS技术对外泌体来源的核酸进行测序，是这一领域目前最广泛使用的手段。

尿液作为一种人类体液，在液体活检和生物医学诊断中具有其独特优势-方便获得与收集，且收集过程对受检者无伤害，这一特征是血液、恶性积液、穿刺组织等无可比拟的。当前，尿液外泌体技术具有广泛应用前景，而对其应用研究较为缺乏。

分离、提取人类体液样本RNA并建立合格的文库已成为当前外泌体研究领域亟待解决的问题。外泌体研究的第一步是外泌体的分离。外泌体作为生物医学诊断中液体活检的重要的生物标志物来源和生物医学治疗的重要给药手段，受到临床研究者的广泛关注。但由于多种因素影响，临床上采用各种人类体液作为外泌体检测来源时均存在分离技术问题，如血浆和血清含有大量非EV脂质结构(低/极低/高密度脂蛋白)，乳汁充满含脂肪的液泡，尿液含有尿调节素(Tamm-Horsfall蛋白)，支气管肺泡灌洗液含表面活性剂。在外泌体分离后，对外泌体RNA的提取和文库构建同样是使用NGS技术进行诊断的难点。

由于外泌体在体液中存在的浓度很低，同时部分Tamm-Horsfall蛋白一同聚沉造成肉眼下外泌体沉淀假阳性，且影响提取效率，提取外泌体RNA需要稳定的试剂和标准流程，现有的提取方法非常复杂，对人员和仪器设备均有很高要求且耗时，同时RNA提取过程中多次纯化造成RNA损失及多样性降低，这一技术限制了外泌体在临床上的利用。常规RNA提取方法则由于繁琐的冷冻、回溶操作，同样对人员和设备有很高要求，且RNA在提取中损失很大，对RNA含量较低的样本有很大局限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改进的用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，该方法有效解决了低RNA含量样本，提取的RNA质量差、总量低，无法有效建库的问题。

本发明的目的还在于提供一种改进的用于NGS平台的尿液外泌体RNA文库构建方法，构建的外泌体RNA文库满足测序要求，克服了尿液外泌体难以利用NGS平台测序的难题。

本发明提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，包括以下步骤：

1)尿液样本去除细胞或细胞碎片后，与助沉试剂混合，分离外泌体；

2)用Trizol试剂与所述外泌体混合，静置，得到混合液；

3)将所述混合液和溴氯丙烷混合，静置，收集水相，依次经异丙醇和体积浓度75％的乙醇水溶液纯化，离心收集上清液得到外泌体RNA。

优选的，所述助沉试剂包括PEG 8000分离液。

优选的，所述PEG 8000分离液为300～600g/L PEG8000和0.5～2.5M NaCl的水溶液。

优选的，尿液样本与助沉试剂的体积比为2：0.5～1.5。

优选的，Trizol试剂的体积和外泌体的质量比为1mL：5～30mg。

优选的，所述混合液和溴氯丙烷的体积比为1：0.2～0.3。

本发明提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA建库方法，包括以下步骤：

A.A.将外泌体的RNA进行片段化处理后，依次经逆转录、纯化，得到cDNA；

B.将所述cDNA进行末端修复加A反应，连接接头，纯化；

C.将步骤B得到的纯化产物进行片段分选，得到分选DNA片段；

D.将所述分选DNA片段进行文库扩增，纯化，得到外泌体RNA文库。

优选的，步骤A中所述外泌体的RNA为采用所述方法提取得到的外泌体RNA。

优选的，步骤A中所述片段化处理的条件为在70～100℃下进行金属离子处理片段化处理5～20min。

优选的，步骤D中所述扩增的反应程序：98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，13个循环；72℃5min；

步骤D中所述扩增的反应体系为50μL，其中分选DNA片段20μL，PCR引物混合物5μL，扩增反应缓冲液25μL。

本发明提供的用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，以尿液样本制备的外泌体作为检测对象，采用适当的助沉试剂分离外泌体，不仅能有效从样本中沉降出外泌体，而且不会引起假阳性，具有经济实用，操作方便快捷的忒点，得到大量外泌体为提取RNA提供材料基础；同时，本发明加入Trizol直接抽提RNA，缩短实验流程且去除多余回溶、纯化步骤，减少了RNA在提取过程中的损失。因此，本发明提供的外泌体RNA提取方法，不仅获得理想浓度的RNA，而且提取过程操作简便，成本低，适合在NGS检测中临床应用。

同时本发明提供的外泌体RNA提取方法，是以尿液为检测对象，不仅降低提取成本而且取样方面，降低了临床检测给患者带来痛苦，易于临床推广应用。

本发明提供的用于NGS平台的尿液外泌体RNA建库方法，包括先对RNA片段化，再进行逆转录扩增cDNA和纯化，再进行末端修复和纯化、接头连接和纯化、双筛、prePCR和纯化等步骤。本申请针对常规NGS建库方法中涉及纯化的繁琐操作而提出的，常规方法不仅损失大量核酸，而且分子多样性受不可避免的不利影响，本发明通过优化建库流程，调整了操作顺序，省略了部分纯化的步骤，提出了针对微量尿液外泌体RNA样本的cDNA的NGS文库构建方法，该方法构建的NGS文库不仅满足NGS的测序要求，而且操作简便，为针对外泌体的靶向用药提供关键的临床诊断靶标突变位点信息，为患者制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间提供了保障。

附图说明

图1为本发明提供的外泌体分离的图片。

具体实施方式

本发明提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取方法，包括以下步骤：

1)尿液样本去除细胞或细胞碎片后，与助沉试剂混合，分离外泌体；

2)用Trizol试剂与所述外泌体混合，静置，得到混合液；

3)将所述混合液和溴氯丙烷混合，静置，收集水相，依次经异丙醇和体积浓度75％的乙醇水溶液纯化，离心收集上清液得到外泌体RNA。

本发明将尿液样本去除细胞、细胞碎片后，与助沉试剂混合，分离外泌体。

在本发明中，所述尿液样本去除细胞或细胞碎片的方法优选依次采用离心和过膜的方法进行。所述离心的转速优选为10000～12000g，更优选为12000g。所述离心的时间优选为15～20min，更优选为15min。所述过膜用滤膜的孔径优选为0.22μm。

在本发明中，所述助沉试剂优选包括PEG 8000分离液。所述PEG 8000分离液优选为300～600g/LPEG 8000和0.5～2.5MNaCl的水溶液，更优选为450g/LPEG 8000和1.5MNaCl的水溶液。尿液样本与助沉试剂的体积比优选为2：0.5～1.5，更优选为2:1。所述混合后，优选将混合后的体系置于4℃下静置孵育。所述助沉试剂能够有效将溶液中外泌体沉降下来。将沉降后的体系进行离心，收集沉垫为外泌体。

得到外泌体后，本发明用Trizol试剂与所述外泌体混合，静置，得到混合液。

在本发明中，Trizol试剂的体积和外泌体的质量比优选为1mL：5～30mg，更优选为1mL：10mg。本发明对所述Trizol试剂的配方不做具体限定，采用本领域所熟知的Trizol试剂即可。所述静置的时间优选为10min。所述静置有利于Trizol试剂直接作用外泌体，使其充分破裂释放出RNA。

得到混合液后，本发明将所述混合液和溴氯丙烷混合，静置，收集水相，依次经异丙醇和体积浓度75％的乙醇纯化，离心去上清液，挥发乙醇，10μl无核酸水回溶得到外泌体RNA。

在本发明中，所述混合液和溴氯丙烷的体积比优选为1：0.2～0.3。所述混合优选伴随充分振荡30s。所述静置优选在室温条件下静置10min。收集水相的方法优选为冷冻高速离心。所述冷冻高速离心的温度优选为4℃。所述冷冻高速离心的转速优选为12000g。所述冷冻高速离心的时间优选为15min。将收集的上层水相与异丙醇按照等体积的比例混合。得到的异丙醇混合液再次冷冻高速离心收集上清液。所述上清液与乙醇水溶液混合，涡旋振荡使沉淀悬浮再次冷冻高速离心，去除上清液，再次乙醇水溶液洗涤，离心后得到沉淀即为RNA。所述RNA与NF水(纳滤水)混合，得到RNA水溶液，用于后续建库。对提取的外泌体RNA进行质控检测。所述质控检测优选采用RT-QPCR技术进行。所述RT-QPCR技术检测时引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:：2所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针。所述RT-QPCR技术检测时反应程序优选：50℃15min；95℃30sec，95℃10sec，60℃30sec，45个循环。RT-QPCR检测结果表明，尿液外泌体样本的CT值为33.422～33.956。

本发明提供了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA建库方法，包括以下步骤：

A.将外泌体的RNA进行片段化处理后，依次经逆转录、纯化，得到cDNA；

B.将所述cDNA进行末端修复加A反应，连接接头，纯化；

C.将步骤B得到的纯化产物进行片段分选，得到分选DNA片段；

D.将所述分选DNA片段进行文库扩增，纯化，得到外泌体RNA文库。

优选的，步骤A中所述外泌体的RNA为采用所述方法提取得到的外泌体RNA。

本发明将外泌体的RNA进行片段化处理后，依次经逆转录、纯化，得到cDNA。

在本发明中，所述片段化处理的方法优选为将提取的RNA与Frag/Prime Buffer混合，在片段化处理条件下得到目标片段大小的片段。所述片段化处理的条件优选为在70～100℃下进行金属离子处理片段化处理5～20min，更优选为85℃进行金属离子处理片段化处理6min。

在本发明中，所述逆转录包括合成第一cDNA链和合成第二cDNA链。本发明对所述逆转录的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的逆转录方法即可。得到的逆转录产物优选进行纯化。所述纯化优选采用磁珠纯化即可。在本发明实施例中，纯化用的磁珠优选为VAHTS DNA Clean Beads。本发明对所述VAHTS DNA Clean Beads的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的磁珠即可。

得到cDNA后，本发明将所述cDNA进行末端修复加A反应，连接接头，纯化，得到带接头的产物。

在本发明中，末端修复加A反应中采用的试剂为末端反应混合液。所述末端反应混合液包括双链cDNA 50μL、End Prep Mix 15μL。所述末端修复加A反应的条件优选为在热盖105℃开启条件下，20℃15min，65℃15min，4℃保温。末端修复加A反应后得到末端修复加A产物。

在本发明中，所述连接接头中的接头优选为RNA接头。本发明对所述RNA接头的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的RNA接头即可。所述连接接头的反应体系优选为100μL，其中末端修复加A产物65μL，快速连接缓冲液25μL、快速DNA连接酶5μL、RNA接头1μL、ddH

在本发明中，所述纯化的目的是去除未连接的接头。所述纯化的方案优选采用磁珠纯化，具体操作不做限定。

得到带接头的产物后，本发明将进行片段分选，得到分选DNA片段。

在本发明中，所述片段分选的方法优选采用VAHTS DNA Clean Beads进行分步分选。首先用58μL VAHTS DNA Clean Beads吸附100μL纯化后的扩增产物，室温孵育，在磁场力的作用下，澄清，吸取上清至新离心管中，向所述新的离心中添加10μL VAHTS DNA CleanBeads使DNA结合到磁珠上，在磁场力的作用下，去除上清后，漂洗，干燥磁珠，将干燥后的磁珠与ddH

得到分选DNA片段后，本发明将所述分选DNA片段进行文库扩增，纯化，得到外泌体RNA文库。

在本发明中，在本发明中，所述扩增的反应程序优选：在热盖温度105℃条件下，98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，13个循环；72℃5min。所述扩增的反应体系优选为50μL，其中片段分选产物为20μL，PCR引物混合物5μL，扩增反应缓冲液25μL。所述纯化的方案优选采用磁珠纯化，具体操作不做限定。

在本发明中，采用本发明提供的方法构建得到的外泌体RNA文库浓度进行质控，文库浓度为23ng/μL以上，符合NGS测序要求。该质控结果表明，外泌体RNA建库方法质控结果满足测序要求，建库成功。

本发明提供的方法以尿液样本为材料进行建库，有效解决了低RNA含量样本，提取RNA质量差总量低，无法有效建库，利用NGS平台测序的难题，并且构建的外泌体文库能够用于检测检测点突变、插入缺失、基因融合，基因拷贝数变化等基因变异信息，基于此，临床治疗给出最精准的用药指导信息。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

名词解释：

NGS，高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

Trizol，一种RNA提取试剂，主要成分为苯酚和异硫氰酸胍，通常用于细胞组织中总RNA的提取。

实施例1

尿液外泌体分离优化步骤如下：

1.1样本准备

收集新鲜尿液，在50mL离心管中加入20mL尿液，将离心管放入高速离心机中在12000g下离心15min，取上清液通过0.22μm滤膜过滤备用。

1.2试剂准备

用PEG 8000与5M NaCl母液配制PEG分离液，具体为将450g PEG8000用水溶解，加300mL 5M NaCl溶液，定容至1L，即为PEG 8000分离液。

1.3分离外泌体

在每20mL过滤后的尿液样本中加入10mL PEG8000分离液，样本放于4℃冰箱中静置孵育0.5h，在冷冻高速离心机作用下于4℃、12000g离心20min，去除上清液，肉眼可见沉淀即为外泌体沉淀(见图1)。

实施例2

鉴于分离后的外泌体总量较低，且外泌体与其中包含的RNA在常温下均不稳定，同时已有文献报道储存会导致外泌体内容物释放以及RNA降解。因此，外泌体RNA的提取需要快速而得率较高的方法，本发明提供了一种优化的尿液中外泌体RNA提取方法，具体步骤如下：

1.Trizol法提取RNA

将每管装有550μL异丙醇或2mL乙醇的离心管放置于-20℃环境中充分预冷，准备1.5mL离心管，分装若干个1mL Trizol试剂，避光，写好编号。

将分离的外泌体沉淀样本转移至装有Trizol试剂的离心管中，充分震荡，在室温下静置10min，加0.2mL溴氯丙烷至离心管中，充分震荡30s，室温下静置5min，使用冷冻高速离心机于4℃、12000g条件下离心15min，吸取上层水相550μL，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，切勿涡旋振荡，样本放于-20℃冰箱，冷冻沉淀20min，再使用冷冻高速离心机在4℃、12000g条件下离心15min，吸弃上清液，所得沉淀加入1mL预冷的75％乙醇水溶液，震荡涡旋使沉淀悬浮，再使用冷冻高速离心机于4℃、12000g条件下离心5min，小心吸弃上清液，重复一次加75％乙醇水溶液、涡旋、离心弃上清过程，开盖室温放置5min挥发乙醇，加入10μL纳滤水，涡旋，常温放置3min，产物即RNA水溶液。

2.RNA质控

利用

1)配制RT-QPCR反应体系(表1)并按照表2的反应条件进行RT-QPCR测定CT值。

表1 RT-QPCR反应体系

表2 RT-QPCR反应条件

RT-QPCR反应体系中上游引物序列：CATGTACGTTGCTATCCAGGC(SEQ ID NO:1)；

下游引物序列：CTCCTTAATGTCACGCACGAT(SEQ ID NO:2)；

探针序列：GTACCACTGGCATCGTGATG(5'ROX)(SEQ ID NO:3)。

RT-QPCR测定的CT值结果表3。由表3结果可知，该方法成功提取得到外泌体RNA。

表3提取的RNA质控结果

注：DEPC水(编号1和编号2)的样本为DEPC水来源，尿液外泌体样本(编号3和编号4)为DEPC水和尿液的混合液。

实施例3

提取的外泌体RNA微起始量建库方法，具体操作如下：

1.采用实施例2的方法提取尿液外泌体样本RNA；

2.文库构建：

2.1RNA片段化处理

将NR1各组分(Tris Buffer，Beads Binding Buffer，购自诺唯赞公司)从2～8℃环境中取出，静置使其平衡至室温(注：所有试剂在使用之前，均需上下颠倒混匀，请勿高速涡旋或剧烈振荡)。将10μL RNA样本加入19.5μL Frag/Prime Buffer(购自诺唯赞)，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。将样品置于PCR仪中，片段化条件见表4。

表4片段化处理条件

注：从片段化到第一链cDNA合成的过程中不可停留。

2.2第一链cDNA合成反应

将片段化后的样品吸取17μL至新的Nuclease-freePCR管中，并立刻进行第一链cDNA合成反应。

将1st Strand Buffer(购自诺唯赞公司)预先从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在PCR管中配制第一链cDNA合成反应液，反应体系见表5。

表5第一链cDNA合成反应体系

在PCR仪中进行第一链cDNA合成，反应条件见表6。

表6第一链cDNA合成反应条件

2.3第二链cDNA合成反应

得到第一链cDNA后，立刻进行第二链cDNA合成反应。将2nd Strand Buffer(购自诺唯赞公司)预先从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在PCR管中配制第二链cDNA合成反应液(见表7)，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。

表7第二链cDNA合成反应体系

在PCR仪中进行第二链cDNA合成，反应条件见表8。

表8第二链cDNA合成反应条件

2.4双链cDNA纯化

将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2～8℃环境中取出，静置使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，小心吸取90μL(1.8×)加入到第二链cDNA样品中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，重复一次，保持样品始终处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5～10min。将样品从磁力架上取出，加入52.5μL去核苷酸酶的水，使用移液器轻轻吸打充分混匀，在室温下静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取50μL上清至一个新的去核苷酸酶的PCR管中。

2.5末端修复加A反应

将EndPrep Mix从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在PCR管中配制末端修复反应液(见表9)，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。

表9末端修复反应液的体系

转移至PCR仪中进行末端修复反应，反应条件见表10。

表10末端修复反应条件

2.6接头连接

将RNAAdapters(购自IDT公司)从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，将RapidLigationbuffer(购自诺唯赞公司)解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。在PCR管中配制连接反应液(见表11)，移液器轻轻吸打10次充分混匀。

表11连接反应液体系

在PCR仪中进行接头连接反应，连接反应的条件见表12。

表12接头连接反应条件

2.7产物纯化

将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从4℃取出，静置使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取80μL(0.8×)加入到接头连接产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温下孵育30sec，小心移除上清。重复一次。保持样品始终处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5～10min。将样品从磁力架上取出，加入102.5μL去核苷酸酶的水，使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取100μL上清至一个新的去核苷酸酶的PCR管中。

2.8片段分选

颠倒或涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取58μL加入到纯化产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，保持样品始终处于磁力架上，小心缓慢吸取155μL上清至一个新的去核苷酸酶的PCR管中，加入10μL VAHTS DNA Clean Beads，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温下孵育30sec，小心移除上清，重复一次，保持样品始终处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5～10min，将样品从磁力架上取出，加入22.5μL去核苷酸酶的水，使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μL上清至一个新的去核苷酸酶的PCR管中，立刻进行PCR反应。

2.9文库扩增(PrePCR)与纯化

将PCR Primer Mix、Amplification Mix 1(购自诺唯赞公司)从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在PCR管中配制PCR反应液(表13)，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。

表13 PCR反应液的体系

样本置于PCR仪中，进行文库扩增反应，反应条件见表14。

表14文库扩增反应条件

扩增产物纯化：将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温，颠倒或涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取40μL(0.8×)加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温下孵育30sec，小心移除上清，重复一次，保持样品始终处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5～10min，将样品从磁力架上取出，加入22.5μL去核苷酸酶的水，使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μL上清至一个新的去核苷酸酶的PCR管中。

2.10文库质控

通过Qubit

表15外泌体RNA文库浓度结果

外泌体RNA建库方法质控结果满足测序要求，建库成功。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳海普洛斯医学检验实验室

<120> 一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctccttaatg tcacgcacga t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaccactgg catcgtgatg 20