具有防腐功效的石斛多肽提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然产物提取应用领域，具体的涉及一种具有防腐功效的石斛多肽提取物及其制备方法和应用。

背景技术

霍山石斛(学名：Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)俗称米斛，是兰科石斛属的草本植物，中国国家地理标志产品。主产于大别山区的安徽省霍山县，大多生长在云雾缭绕的悬崖峭壁崖石缝隙间和参天古树上，生于山地林中树干上和山谷岩石上。2020年版的《中华人民共和国药典》新增霍山石斛，拥有多种生物活性，不仅可以益胃生津，增强机体免疫力。

生物活性肽(Bioactive peptide)是由20个天然氨基酸构成的小到两个氨基酸大到数百个氨基酸的并具有特殊生物功能的多肽类化合物。肽虽然是由氨基酸组成的，但是具有许多单个氨基酸所不具备的功能。生物活性肽可以通过水解蛋白质得到，其生物活性也在水解过程中被释放出来。随着研究的深入，生物活性肽的多种生物活性已经被大量的研究证实，常被提及活性的有降血糖活性、抑菌活性、抗癌活性、抗病毒活性、免疫调节活性等。可以预测，在不久的将来生物活性肽将成为人类筛选药物的天然资源宝库。

化妆品市场上的产品大部分都添加化学防腐剂，如苯氧乙醇，尼泊金酯类等，这些化学防腐剂，在发挥防腐作用的同时可能会导致皮肤潜在危害，如影响皮肤屏障，皮肤松弛，过敏，角质层增厚等问题。因此寻找纯天然，植物体系，安全有效的防腐剂是目前的热点，虽然有较多的天然来源的成分具有防腐抗菌作用，但是涉及对皮肤的刺激性，纯度，气味以及溶解性等问题，导致众多植物提取物不能或者不适合添加到化妆品中作为防腐剂使用；部分植物提取物作为防腐剂添加到化妆品中，其防腐抗菌效果也不理想。

发明内容

发明目的：本发明的目的是针对现有的技术存在上述问题，提供了一种具有防腐功效的石斛多肽提取物的制备及其在化妆品中应用，本发明方法环保，高效，可以制备防腐功效的石斛多肽提取物应用于护肤品，替代化学防腐剂，适合工业化生产。

技术方案：一种具有防腐功效的石斛多肽提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)酶解提取：选取石斛药材碎至20～40目，按固液比1：6～15加入纯化水，加入石斛重量0.05％～0.3％的复合酶进行酶解，酶解过程调节PH至7.0～7.5，控制温度45～55℃，进行搅拌酶解8～12h；酶解结束后，过滤得到酶解提取液；

(2)石斛多肽纯化：将酶解提取液置于水浴灭活后，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏，加入5～8倍重量的乙醇，静置沉淀，过滤除去多糖沉淀，将滤液过低分子纳滤膜，将截留液浓缩，烘干，得到石斛多肽提取物。

其中，步骤(1)中，所述的石斛为霍山石斛。

本发明步骤(1)中，若pH过高或者过低，均影响酶的活力，导致石斛蛋白成分水解不完全。

步骤(2)中，所述的低分子纳滤膜截留分子量为1000Da。可以去除黄酮，氨基酸，无机盐等小分子非肽类杂质。

步骤(1)中，所述的复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；

复合酶的用量过低，会影响催化反应的速度，导致石斛蛋白成分水解不完全；复合酶的用量过高，将增加纯化的成本。所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶质量比为1:1～4，优选为1:1.5～2.5，最优选1:2。

本发明还提供了所述的制备方法制备得到的石斛多肽。

本发明还提供了所述的石斛多肽在制备化妆品中的应用。本发明制备得到的石斛多肽提取物，制备得到的石斛多肽提取物可用于化妆品，作为无添加防腐剂，具有防腐抑菌的功效。

本发明具有的积极有益效果：本发明制备得到的石斛多肽提取物分离于霍山石斛，具有防腐抑菌的功效，安全无毒副作用，可用于化妆品，作为无添加防腐剂。按质量分数计，为0.05～0.3％，添加量少，具有很好的抑菌防腐效果

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明。

实施例中，石斛为霍山石斛。

多肽含量测定：

多肽含量测定采用分光光度法，使用紫外分光光度计，分析方法是首先绘制对照品的吸收标准曲线，将待测的样品稀释至一定浓度，测定其吸光度，利用标准曲线计算得到多肽的含量。

标准曲线制备：精密称取酪氨酸对照品适量，制成浓度为5mg/ml的对照品贮备液。

取上述对照品贮备液分别置于5个10ml的量瓶中，加5％(W/V)TCA制成浓度分别为0.0mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的酪氨酸标准溶液。然后分别取6.0ml标准溶液，加入4.0ml双缩脲试剂(1％(W/V)硫酸铜溶液+10％NaOH溶液)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于238nm下测定OD值(以第一管做空白对照)。以多肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线。得回归方程为y＝10.035x-0.145R2＝0.999。

多肽含量的测定：按照以上方法测定待测溶液中多肽吸光度A，由回归方程即可求得质量浓度。取待测石斛多肽提取物，制成浓度为0.2mg/ml溶液。取样品溶液1mL，按照上述的制作方法，测定其吸光度，每个样品做三个平行试验，取平均值，计算得到样品中的多肽含量。

实施例1：

(1)酶解提取：选取1kg石斛药材碎至20～40目，加入纯化水10L，加入0.4g中性蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号200810)和0.6g木瓜蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号190220)；酶解过程用10％(W/V)的氢氧化钠溶液调节PH至7.0，控制温度50℃，进行搅拌酶解8h。酶解结束后，过滤得到酶解提取液。

(2)石斛多肽纯化：将酶解提取液置于90℃水浴灭活10min，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏，加入5倍重量的乙醇，静置沉淀，过滤除去多糖沉淀，将滤液过截留分子量为1000Da低分子纳滤膜，将截留液浓缩，烘干，得到石斛多肽提取物2.85g，多肽纯度82.6％。

实施例2：

(1)酶解提取：选取1kg石斛药材碎至20～40目，加入纯化水10L，加入0.6g中性蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号200810)和1.2g木瓜蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号190220)；酶解过程用10％(W/V)的氢氧化钠溶液调节PH至7.2，控制温度55℃，进行搅拌酶解10h。酶解结束后，过滤得到酶解提取液；

(2)石斛多肽纯化：将酶解提取液置于90℃水浴灭活10min，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏，加入8倍重量的乙醇，静置沉淀，过滤除去多糖沉淀，将滤液过截留分子量为1000Da低分子纳滤膜，将截留液浓缩，烘干，得到石斛多肽提取物3.25g，多肽纯度87.2％。

实施例3：

(1)酶解提取：选取1kg石斛药材碎至20～40目，加入纯化水6L，加入0.2g中性蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号200810)和0.4g木瓜蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号190220)；酶解过程用10％(W/V)的氢氧化钠溶液调节PH至7.2，控制温度45℃，进行搅拌酶解8h。酶解结束后，过滤得到酶解提取液；

(2)石斛多肽纯化：将酶解提取液置于90℃水浴灭活10min，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏，加入6倍重量的乙醇，静置沉淀，过滤除去多糖沉淀，将滤液过截留分子量为1000Da低分子纳滤膜，将截留液浓缩，烘干，得到石斛多肽提取物2.71g，多肽纯度84.2％。

实施例4：

(1)酶解提取：选取1kg石斛药材碎至20～40目，加入纯化水15L，加入1.0g中性蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号200810)和2.0g木瓜蛋白酶(北京鸿润宝顺科技，货号190220)；酶解过程用10％(W/V)的氢氧化钠溶液调节PH至7.2，控制温度50℃，进行搅拌酶解8h。酶解结束后，过滤得到酶解提取液；

(2)石斛多肽纯化：将酶解提取液置于90℃水浴灭活10min，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏，加入8倍重量的乙醇，静置沉淀，过滤除去多糖沉淀，将滤液过截留分子量为1000Da低分子纳滤膜，将截留液浓缩，烘干，得到石斛多肽提取物3.08g，多肽纯度81.2％。

实施例5：

1.广谱抑菌测试：

取实施例1-4制得的石斛多肽提取物，测试其最小抑菌浓度(MIC，单位：μg/ml)。在各个试管中加入2mL生理盐水，将实验所用细菌用接种环从培养皿转移到试管中，比浊法计数，用无菌生理盐水调至菌液浓度1.5×10

表1 最小抑菌浓度检测结果

从表1可以看出，本发明实施例1-4制得的肉苁蓉多肽提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的最小抑菌浓度在300～1200μg/ml区间，表明本发明实施例1-4制得的石斛多肽提取物具有好的抑菌效果。

2.皮肤刺激性试验：

选取20名女性志愿者，年龄在20～30岁之间，志愿受试者均符合《化妆品安全技术规范》(2015版)中的受试者选择原则，将20名女性志愿者平均分成4组，按照《化妆品安全技术规范》(2015版)中人体皮肤斑贴试验中的试验方法，将以上4项实施例的产品分别对4组女性志愿者进行人体皮肤斑贴试验，包括手臂和背部的试验，结果显示25名女性志愿者的皮肤反应程度均为“-”即为阴性反应，即表明本发明的产品对人体皮肤无刺激作用。

3.防腐挑战测试：

应用实施例1～4制备得到的石斛多肽提取物添加在精华产品中，进行防腐挑战测试。

精华液基础配方如下

(1)以上述实施例1，2，3制备的抑菌组合分别按质量比0.5％添加在乳液基础配方中，对比例1中在乳液基础配方中添加苯氧乙醇0.5％，对比例2为不添加苯氧乙醇，无防腐剂的乳液基础配方。

将实施例1，2，3、4制作的精华样品和对比例1，2制作的精华样品，每个测试样品分两瓶(10g/瓶)，一瓶加入1ml，10

表2 样品防腐挑战测试试验28天结果：

由表1可见，实施例1～4制备得到的石斛多肽提取物，具有防腐抑菌功效，可以代防腐剂，应用于护肤品产品，

应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。