天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用。

背景技术

刀豆氨酸是从刀豆分离的一种非天然氨基酸，广泛存在于豆科植物及其种子中，刀豆氨酸的结构与精氨酸类似，因此会导致刀豆氨酸代替精氨酸合成蛋白质，刀豆氨酸在蛋白质合成过程中会被错误掺入到新合成的蛋白中，干扰RNA和DNA的正常代谢反应，影响正常蛋白质的合成及精氨酸的正常代谢，可在农业和制药工业有广泛应用，由于刀豆氨酸与精氨酸结构的不同，所形成蛋白质的功能也会出现异常，导致蛋白失活，具有抗代谢活性，因此对刀豆氨酸的快速检测是非常重要的。

中慢生型天山根瘤菌能够在甘草的根部共生结瘤固氮,提供植物生长所需的氮源。这种共生关系的建立依赖于根瘤菌与宿主植物之间复杂的信息交流，在天山根瘤菌中存在着刀豆氨酸的外运系统MsiAR系统能够特异性的识别胞内的刀豆氨酸，MsiR蛋白能够启动msiA基因的表达进而将胞内的刀豆氨酸分泌到胞外，刀豆氨酸作为辅助诱导物。

豆科植物在长期进化过程中把刀豆氨酸作为“生化武器”，用于防御食草性昆虫和动物以及有害微生物。相关的研究也表明刀豆氨酸具有抗肿瘤活性，开发快速、高效检测刀豆氨酸的方法对于研究其生理功能、合成机制、抗癌机理具有重要价值。目前已报道的L-刀豆氨酸的检测方法有化学分光光度计检测法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、氨基酸分析法和核磁共振检测法等，但这些方法存在着前处理复杂、灵敏度低，专一性不强、操作繁琐、耗时长、通量低等缺点。

转录调控因子(Transcription Factor)是微生物体内一种重要的调控蛋白，它以特定的代谢物作为配体，通过与被调控蛋白的启动子区域结合后对下游基因进行调控，并且所需配体的量在一定范围内与调控作用存在正相关性。基于上述原理，微生物中的转录调控因子可以被设计为能够识别特定目标代谢物的生物传感器(Biosensor)，从而实现对目标代谢物的快速检测。与传统的理性设计相比较，该方法具有检测速度快，灵敏性高等优点，目前还未有L-刀豆氨酸单细胞生物传感器的相关报道，因此，急需一种实时、准确、灵敏的L-半胱氨酸检测方法。

通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，筛选到了可显著提高MsiR突变蛋白对刀豆氨酸的转录调控活性的关键氨基酸位点，发明人发现，对野生型的MsiR突变蛋白中的关键位点进行改造后，转录调控蛋白MsiR突变蛋白较野生型对刀豆氨酸响应的荧光值提高了两倍，且ITC结果表明是该突变大幅提高了MsiR蛋白与刀豆氨酸的亲和力，通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明基于转录调控因子MsiR，将L-刀豆氨酸浓度与荧光强度相偶联，构建了可检测L-刀豆氨酸浓度的生物传感器，可实现对L-刀豆氨酸的特异性定量检测，同时通过对该蛋白的突变蛋白的筛选提高了MsiR转录调控蛋白的调控活性。

本发明的目的之一在于提供天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且突变蛋白具有特异性响应刀豆氨酸的能力，突变蛋白在野生型的MsiR的1个与刀豆氨酸结合相关的核心氨基酸发生突变：第133位由天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)，突变蛋白的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

进一步的，所述转录调控蛋白MsiR来源于天山中慢生根瘤菌。

本发明的目的之二在于提供一种多核苷酸，所述的载体含有权利要求3所述的多核苷酸，其中多核苷酸编码的C端核苷酸序列如SEQ ID NO.3，多核苷酸编码的C端蛋白序列如SEQ ID NO.4。

本发明的目的之三在于提供两种载体，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸

本发明的目的之四在于提供两种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

本发明的目的之五在于提供一种产生突变蛋白的方法，在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，表达出转录调控蛋白MsiR突变蛋白；和/或分离所述转录调控蛋白MsiR突变蛋白。

本发明的目的之六在于提供一种构建刀豆氨酸单细胞生物传感器的方法，包括以下步骤：

(1)基于转录调控因子MsiR，以天山中慢生根瘤菌的msiR基因敲除菌株为出发菌株，构建PTCV141和PTM5质粒，其中PTCV141是用于构建msiR基因突变的载体；PTM5是将mCherry基因克隆到MsiR蛋白所调控的启动子PmsiA下游，用于定量的检测不同MsiR突变蛋白对Pmsi A转录调控的影响，构建成筛选菌株TC4M302，msiA启动子的表达情况用mCherry荧光值与OD600 nm的比值来表示；

(2)构建的荧光信号与刀豆氨酸浓度相偶联的单细胞生物传感器，对其线性范围进行了检测，在0mmol/L至5.68mmol/L的刀豆氨酸浓度下，荧光信号强度与半胱氨酸浓度之间具有良好的线性关系。

进一步的，所述刀豆氨酸单细胞生物传感器由来源中慢生型天山根瘤菌的转录调控因子MsiR编码基因及其启动子区和终止子区，来源天山中慢生根瘤菌中基因msiA的启动子区、红色荧光蛋白编码基因mCherry和质粒骨架pYC12质粒组成。

本发明的目的之七在于提供一种权利要求1所述的突变蛋白的用途，所述的MsiR突变蛋白用于响应刀豆氨酸的生物传感器的构建或体外刀豆氨酸的检测。

进一步的，所述的单细胞生物传感器用于检测L-刀豆氨酸浓度包括以下步骤：

(1)在28℃的温度下对含有PTCV141质粒和PTM5质粒的天山根瘤菌进行预培养12小时以上直至进入稳定期；

(2)将预培养的天山根瘤菌以1:50的接种量接种到含有不同浓度L-刀豆氨酸的新鲜的TY培养基中；

(3)菌液OD600至0.6-0.8时，培养48-72小时后测定荧光强度。

相对于现有技术，本发明取得的优点和积极效果为：本发明所述的突变蛋白，由来源于野生型的天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR，第133位氨基酸由天冬氨酸(D)突变为丙氨酸，基于转录调控因子MsiR，构建了可检测L-刀豆氨酸浓度的生物传感器，可实现对L-刀豆氨酸的特异性定量检测，突变蛋白较野生型对刀豆氨酸响应的荧光值提高了2倍，且MsiR突变蛋白C端效应物结合区域与刀豆氨酸结合的亲和力提高了1.5倍；同时通过对该蛋白的突变蛋白的筛选提高了MsiR转录调控蛋白的调控活性。

附图说明

图1为本发明所述的MsiR突变蛋白的单细胞生物传感器的原理示意图；

图2为本发明所述的MsiR突变蛋白经过纯化后的SDS-PAGE电泳图谱；

图3为本发明所述的MsiR突变蛋白msiA启动子的表达情况；

图4为本发明所述的MsiR突变蛋白MsiR(D133A)-CTD与刀豆氨酸的等温滴定量热实验测定的实验结果；

图5为本发明所述的MsiR–CTD与刀豆氨酸的等温滴定量热实验测定的实验结果；

图6为本发明所述的阴性对照缓冲液与刀豆氨酸的等温滴定量热实验测定的实验结果。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：转录调控蛋白MsiR(Msir1-297aa)和MsiR-CTD(Msir83-297aa)重组表达质粒和重组表达转化体的制备

(1)MsiR-CTD(Msir83-297aa)为转录调控蛋白MsiR的C端，MsiR-CTD(Msir83-297aa)的蛋白基因序列合成后，将该蛋白基因序列连接到pET 21b空载体(即所述载体)上，，同时用限制性内切酶BamHI和NdeI双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收，将回收的酶切目的片段和空载体pET 21b在T4 DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pET21b-Msir-CTD，进一步转化至感受态细胞BL21(DE3)挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET21b-msir-CTD。

(2)MsiR(Msir1-297aa)为转录调控蛋白MsiR的全序列，MsiR(Msir1-297aa)的蛋白基因序列合成后，将该蛋白基因序列连接到pYC12 plasmid空载体(即所述载体)上，同时用限制性内切酶Hind3和KpnI双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收，将回收的酶切目的片段和空载体pYC12 plasmid在T4 DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pYC12 plasmid-MsiR后，将重组质粒pYC12plasmid-MsiR转化到BW20767大肠杆菌(即宿主细胞)进行表达，，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliBW20767/pYC12-msir，即PTCV141。

实施例2：转录调控蛋白MsiR对刀豆氨酸活性筛选系统的构建

以TC4天山中慢生根瘤菌的msi R基因敲除菌株为出发菌株，将PTCV141质粒和PTM5质粒导入到天山根瘤菌(即宿主细胞)，构建成筛选菌株TC4(PTCV141质粒和PTM5质粒)，其中PTCV141是用于构建MSIR基因突变的载体；PTM5是将mCherry基因克隆到Msi R蛋白所调控的启动子Pmsi A下游，用于定量的检测不同Msi R突变蛋白对Pmsi A转录调控的影响，msi A启动子的表达情况用mCherry荧光值与OD600 nm的比值来表示。

实施例3：调控蛋白MsiR和MsiR-CTD突变体构建

通过NCBI数据库进行蛋白同源结构的比对，挑选蛋白结构数据库中相似性最高的3FD3_A作为同源建模的模板，使用DS Modeling2.5搭建MsiR的结构模型，选取其底物结合口袋内

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入限内酶DpnI在37℃消化4h。将消化产物分别转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞和BW20767大肠杆菌中，并分别涂布于含有氨苄抗生素和庆大抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h，将所得到的单克隆菌落挑取到含4ml LB培养基的试管中进行培养，对相应的基因进行测序。

表1

所述突变蛋白在野生型的转录调控蛋白MsiR的1个与刀豆氨酸结合相关的核心氨基酸发生突变。

实施例4：构建调控蛋白MsiR的突变库

根据突变体蛋白丙氨酸扫描结果构建转录调控活性增强的MSIR的133位氨基酸饱合突变体库，采用简并密码子NNK设计突变引物，突变引物：

上游引物为：133-F：5’GGCTACGGTCTCgcggtatgNNKctggtcgtcgacggcgacgttca3’

下游引物为：133-R：5’GGCTACGGTCTCtaccgccgaatggctgcagcgcgga3’

PCR体系及程序同实施例3，将所得到的单克隆菌落，与已转入PTM5质粒的根瘤菌M.tianshanense进行接合，获得接合子后，将接后的菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量调控活性筛选，对荧光值高于野生型2倍以上的突变体，进行相应的基因测序。

实施例5：突变菌株调控活性的检测

挑选出调控活性提高的突变菌株，与阳性对照野生型菌株141TC4和阴性对照12TC4菌株各挑选三个克隆接种到96孔板内，在TY液体培养基28℃培养4天，然后接种到L-刀豆氨酸浓度分别为0.1ug/ml,10ug/ml,100ug/ml,1000ug/m的TY液体培养基中，TY液体培养基与L-刀豆氨酸比例为1:100，菌液OD600至0.6-0.8时，突变菌株在28℃培养4天测定荧光强度,mCherry荧光值和OD600值用酶标仪进行检测，使用biotech公司的型号为SynergyNEO2的多功能检测仪，根据图3可以看出，突变菌株的荧光强度比阳性对照野生型菌株141TC4和阴性对照12TC4提高了2倍以上。

实施例6：调控蛋白MsiR-CTD(Msir83-297aa)突变体的诱导表达及纯化

配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至A6000.6-1.0左右，加入0.5mM的IPTG，并置于20℃，200rpm诱导10～12h。4℃5500rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100mM，pH 7.0)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法纯化回收目的蛋白，目的蛋白经脱盐法除去咪唑后即得MsiR-CTD(Msir83-297aa)突变体纯酶液，结果表明，本实施例的方法能够获得较纯的蛋白突变体，显示纯化所得蛋白条带单一，分子量为25KD，纯度>95％。

实施例7：调控蛋白MsiR突变体及其MsiR野生型C端效应物结合区域与刀豆氨酸亲和力的测定

等温滴定量热实验在25℃条件下测定，使用的是MicroCal Auto-iTC200等温滴定量热仪(GE Healthcare Life Sciences,USA)。实验过程中，首先用HiTrap Desaltingcolumn对纯化好的MsiR-CTD、MsiR(D133A)-CTD进行脱盐实验，脱盐到缓冲液20mMphosphate buffer pH 8.0,300mM NaCl，200mM KCl，10％glycerine,5mMβ-mercaptoethanol中。然后，将蛋白浓缩到50uM,接着用脱盐缓冲液将刀豆氨酸溶解到1mmol，之后用小分子滴定蛋白质，每次实验中滴定的体积为0.4ul，滴定时间为0.8s,每次滴定时间间隔120s。利用等温量热仪测定了MsiR-CTD，MsiR(D133A)-CTD以及对照组缓冲液对小分子刀豆氨酸的亲和力。通过软件ORIGIN version 7.0分析小分子与蛋白的结合属于单一位点结合模型，并计算出常见的各个热力学参数(见表2)。通过这些结果可以知道，MsiR突变蛋白C端效应物结合区域与刀豆氨酸结合的亲和力提高了1.5倍。

表2热力学扫描ITC测量结果

表中：Ka、Kd为测定的亲和力，ΔG为熵变，ΔH为焓变，ΔST为疏水作用力。

本发明基于转录调控因子MsiR突变蛋白，构建了荧光信号与刀豆氨酸浓度相偶联的单细胞生物传感器，对其线性范围进行了检测，在0mmol/L至5.68mmol/L的刀豆氨酸浓度下，荧光信号强度与半胱氨酸浓度之间具有良好的线性关系。本发明的转录调控蛋白MsiR突变蛋白较野生型对刀豆氨酸响应的荧光值提高了两倍，且MsiR突变蛋白C端效应物结合区域与刀豆氨酸结合的亲和力提高了1.5倍。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> 天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)

<400> 1

Met Leu Asp Tyr Pro Ala Leu Arg Ala Val Ala Thr Ile Val Gln Thr

1 5 10 15

Gly Ser Phe Glu Arg Ala Ala Thr Ala Leu Asn Val Thr Pro Ser Ala

20 25 30

Ile Ser Gln Arg Val Lys Gln Leu Glu Glu Arg Leu Gly Val Ile Leu

35 40 45

Ile Val Arg Gly Thr Pro Cys Thr Ala Thr Glu Lys Gly Glu Trp Leu

50 55 60

Cys Arg His Met Glu Asn Val Gly Met Leu Glu Ala Glu Leu Phe Gly

65 70 75 80

Gln Leu Pro Ala Leu Val Asp Pro Asp Glu Pro Arg Gln Arg Val Thr

85 90 95

Leu Gln Ile Ala Thr Asn Ala Asp Ser Leu Gly Thr Trp Phe Val Glu

100 105 110

Ala Met Ser Asn Phe Ala Lys Ser Ser Ser Tyr Leu Leu Asn Val Ala

115 120 125

Val Asp Asp Gln Ala His Thr Ala Glu Trp Leu Gln Arg Gly Arg Val

130 135 140

Ile Ala Ala Val Thr Ser Leu Glu Lys Pro Val Arg Gly Cys Arg Arg

145 150 155 160

Phe Ala Leu Gly Val Leu Arg Tyr His Ala Thr Ala Thr Pro Asp Phe

165 170 175

Val Thr Ser His Phe Pro Gln Gly Val Thr Ser Glu Ala Ile Arg Asn

180 185 190

Ala Pro Ala Leu Thr Phe Asn Gln Lys Asp Arg Leu Gln Ser Ser Trp

195 200 205

Ile Arg Arg Thr Phe Gly Arg Asp Leu Asp Tyr Pro Thr His Trp Leu

210 215 220

Pro Ser Pro Gln Ser Phe Val Glu Ala Ser Leu Ser Gly Met Gly Trp

225 230 235 240

Gly Met Asn Pro Thr Gln Leu Thr Arg Glu His Leu Ala Ser Gly Arg

245 250 255

Leu Ile Glu Leu Val Pro Asp Thr Pro Leu Asp Val Pro Leu Tyr Trp

260 265 270

Gln Ile Asn Arg Leu Ala Ala Asp Arg Leu Ala Asp Leu Thr Arg Glu

275 280 285

Val Val Thr Val Ala Lys Arg Ser Leu

290 295

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)

<400> 2

atgctcgact atcccgctct tcgcgccgtc gcaactattg tccagacagg cagcttcgaa 60

agagctgcga ccgcgttgaa cgtgacccct tcggccattt cgcagcgcgt gaagcagctc 120

gaggagcgtc tcggcgtcat cctcatcgtc agaggcacgc cgtgcacggc gaccgaaaag 180

ggagaatggc tctgccgcca tatggagaat gtcggcatgc tcgaagcaga actcttcggg 240

caactgcccg ccctcgtcga tcccgacgaa ccacgccaaa gggtcacgct tcaaatcgcg 300

acgaacgccg acagcctcgg aacatggttc gtcgaggcca tgtcgaattt tgccaaaagc 360

tcttcctatc tgctgaacgt cgccgtcgac gaccaggctc ataccgccga atggctgcag 420

cgcggacggg tgatcgccgc cgtcaccagc ctggaaaaac cggtccgagg atgccggcgt 480

tttgccctcg gcgttctgcg ttaccatgca acggcaaccc ccgacttcgt cacaagccat 540

tttccgcagg gcgtaacatc agaggcgatc cgcaacgccc cggcgctgac cttcaatcaa 600

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gtgcccgaca cgccactcga tgtcccgctc tactggcaga taaatcgcct cgccgccgac 840

cgcctggcgg atctgacacg cgaagtcgtc accgtggcca agcgcagcct t 891

<210> 3

<211> 647

<212> DNA

<213> 天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)

<400> 3

tgcccgccct cgtcgatccc gacgaaccac gccaaagggt cacgcttcaa atcgcgacga 60

acgccgacag cctcggaaca tggttcgtcg aggccatgtc gaattttgcc aaaagctctt 120

cctatctgct gaacgtcgcc gtcgacgacc aggctcatac cgccgaatgg ctgcagcgcg 180

gacgggtgat cgccgccgtc accagcctgg aaaaaccggt ccgaggatgc cggcgttttg 240

ccctcggcgt tctgcgttac catgcaacgg caacccccga cttcgtcaca agccattttc 300

cgcagggcgt aacatcagag gcgatccgca acgccccggc gctgaccttc aatcaaaagg 360

acaggctgca gagcagttgg atcaggcgaa cattcggacg cgatctcgat tatcccaccc 420

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ccgacacgcc actcgatgtc ccgctctact ggcagataaa tcgcctcgcc gccgaccgcc 600

tggcggatct gacacgcgaa gtcgtcaccg tggccaagcg cagcctt 647

<210> 4

<211> 222

<212> PRT

<213> 天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)

<400> 4

Met Pro Ala Leu Val Asp Pro Asp Glu Pro Arg Gln Arg Val Thr Leu

1 5 10 15

Gln Ile Ala Thr Asn Ala Asp Ser Leu Gly Thr Trp Phe Val Glu Ala

20 25 30

Met Ser Asn Phe Ala Lys Ser Ser Ser Tyr Leu Leu Asn Val Ala Val

35 40 45

Asp Asp Gln Ala His Thr Ala Glu Trp Leu Gln Arg Gly Arg Val Ile

50 55 60

Ala Ala Val Thr Ser Leu Glu Lys Pro Val Arg Gly Cys Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ala Leu Gly Val Leu Arg Tyr His Ala Thr Ala Thr Pro Asp Phe Val

85 90 95

Thr Ser His Phe Pro Gln Gly Val Thr Ser Glu Ala Ile Arg Asn Ala

100 105 110

Pro Ala Leu Thr Phe Asn Gln Lys Asp Arg Leu Gln Ser Ser Trp Ile

115 120 125

Arg Arg Thr Phe Gly Arg Asp Leu Asp Tyr Pro Thr His Trp Leu Pro

130 135 140

Ser Pro Gln Ser Phe Val Glu Ala Ser Leu Ser Gly Met Gly Trp Gly

145 150 155 160

Met Asn Pro Thr Gln Leu Thr Arg Glu His Leu Ala Ser Gly Arg Leu

165 170 175

Ile Glu Leu Val Pro Asp Thr Pro Leu Asp Val Pro Leu Tyr Trp Gln

180 185 190

Ile Asn Arg Leu Ala Ala Asp Arg Leu Ala Asp Leu Thr Arg Glu Val

195 200 205

Val Thr Val Ala Lys Arg Ser Leu His His His His His His

210 215 220