一种微纳量子点的内源性光热治疗器件系统及其制备方法
文献发布时间:2023-06-19 10:43:23
技术领域
本发明属于微创医疗的微纳量子点光电器件领域,具体涉及一种新型的CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点微纳量子点的内源性光热治疗器件系统及制备方法。
背景技术
癌症是全世界发病率和死亡率的主要原因,每年约有1400万癌症患者,800万人死于与癌症有关的疾病。肿瘤热疗(hyperthermia)被广泛地认为是一种微创的癌症治疗策略。它是指应用不同的物理因子(射频、微波、超声和激光等)提高肿瘤组织或全身的温度,利用高温杀伤及其继发效应治疗肿瘤的一种手段。肿瘤热疗分为浅部热疗、深部热疗、全身热疗和体腔灌注热疗。肿瘤热疗是继手术、放疗、化疗及生物治疗之后的第5种肿瘤治疗手段,亦是重要的肿瘤辅助治疗方法之一,临床应用无毒、安全,被称为绿色治疗,近年来越来越受到重视。截至2019年,全球共有218项热疗临床试验在开展,由中国学者牵头的临床试验多达34项,其中Ⅱ~Ⅲ期临床研究26项。
在肿瘤热疗中,很多新兴的治疗策略产生,有免疫疗法、基因治疗、声动力治疗、光动力疗法、光热疗法等都是研究热点。激光免疫治疗由激光热疗联合免疫佐剂组成,利用激光热效应杀伤靶向肿瘤组织,利用联合免疫佐剂激发个体特异性的抗肿瘤免疫反应。光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是利用光敏剂对靶细胞的优先聚集特性,用特定波长的光照射肿瘤部位,光敏剂吸收光子的能量后部分电子被激发,受激发的光敏剂将能量传递给氧,生成一些活性氧物质,活性氧通过氧化作用杀伤靶细胞。光热疗法(PhotothermalTherapy,PTT)就是利用近红外区域的光热转换试剂将光能转换成热能用于肿瘤治疗。其中光热疗法因其精确定位肿瘤治疗范围,能够最小化的破坏周围健康组织的突出优点。在许多情况下,治疗策略是选择综合疗法,即光热疗法与其他方案协同作用,这些联合疗法具有克服肿瘤异质性和复杂性、逆转多药耐药性、减少不必要的副作用等优点,可以更高效地实现癌症的诊断与治疗。
为解决光热疗法的组织穿透深度低和光转换试剂自聚集难的问题,设计一种新型光热疗法治疗模式机制,发明研制出一种新型的微纳量子点的内源性光热治疗器件系统,该系统以新型CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点为光增益介质,构建光纤环状谐振腔,得到高强度近红外光辐射输出;该光源器件还可携带近红外光热试剂同步直达病灶区域,通过光热试剂调控机制作用范围,实现高精度靶向癌症的可控微区光热治疗。激光环形谐振腔结构,进一步增强光源强度;微纳光器件尺寸、量子点和光试剂携带量,确保了微区病灶作用区域精准,避免正常组织损伤;简便封装技术,彻底解决了量子点毒性副作用。该系统为光热疗法应用提供新思路和新型微纳半导体光器件系统,为癌症治疗领域提供新型光学诊疗方法和仪器。
发明内容
本发明目的是发明一种新型的微纳量子点的内源性光热治疗器件系统及其制备方法。
一种微纳量子点的内源性光热治疗器件系统,其特征在于,以CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点为光增益介质,填充到液芯光纤或超细毛细管构建的光纤环状谐振腔中,得到高强度近红外光辐射输出光源器件即CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点液芯光纤探头;带有CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点液芯光纤探头的光纤经由导光光纤或导光光纤、光纤跳线与激发光源连接,形成CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点内源性光热治疗器件系统。
所述的CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点为:是以CdTe纳米晶体为核心,CdTe核心的外层为CdSe中间壳层,CdSe中间壳层的外层为ZnS外壳。通过尺寸调谐可以产生680-820nm的近红外荧光光谱,具有较高的荧光量子产率和良好的光稳定性,量子点在三个维度的尺寸均小于10nm,可以实现直径在微米尺度的液芯光纤或超细毛细管中照射区域的精准把控,进行组织体内精准的微区治疗。
液芯光纤或超细毛细管构成直径为百微米量级的环形谐振腔。量子点填充浓度3-25mg/ml。
进一步在CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点液芯光纤探头表面或CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点液芯光纤探头的环状谐振腔内直接携带具有光热转换功能的近红外光热试剂,如贵金属纳米颗粒、碳材料纳米粒子等。
该光纤探头或携带近红外光热试剂的光纤探头同步直达病灶区域,通过光热试剂调控机制作用范围,实现高精度靶向癌症的可控微区光热治疗。
其中双核壳量子点CdTe@CdSe@ZnS的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)CdTe核心的制备:
利用水相合成法制备CdTe核心,将新制备的过量NaHTe溶液添加到含N
进一步地,Cd
NaHTe制备:将1.2mmol-1.5mmol NaBH
(2)CdSe中间壳层的制备:
利用连续离子层吸附反应技术(SILAR)制备CdSe壳;将0.4-0.8mmol过量NaBH
进一步地,制备CdSe壳时,在90℃-100℃温度下,将Cd
进一步地,制备CdSe壳时,所有反应都是在露天条件下进行的,产生气体,保持反应器开放状态。
(3)ZnS外壳的制备:
将谷胱甘肽(GSH)和Zn(NO
进一步地,制备ZnS壳时,将反应混合物等分试样时,保持温度在90℃。
进一步地,制备ZnS壳时,反应混合物中Zn
所述的,量子点光放大器件以CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点为光增益介质,液芯光纤,超细毛细管或光子晶体光纤,构成直径为微米量级的环形谐振腔,其特征在于,包括以下步骤:
(1)量子点进入谐振腔
进一步优选:对于百微米级超细毛细管或液芯光纤可采用虹吸作用,通过控制另一端密封压力控制依次进入谐振腔中CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点的剂量0.01-0.8ml。对于尺寸较小的微米级光子晶体光纤,需要用加压泵将CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点泵进微米级环形谐振腔中;对于近红外光热试剂随CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点一起进入谐振腔内,如同时进入金纳米颗粒的剂量0.005-0.4ml,或固定在表面;
(2)连接泵浦光源
将CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点液芯光纤探头通过由导光光纤(普通光纤)或导光光纤、光纤跳线与泵浦光源连接。
对于较粗的百微米级超细毛细管可采用普通光纤直接插入其中的方式,对于较细的液芯光纤和光子晶体光纤,采用熔接机将普通光纤与之熔接在一起,利用246nm-457nm波长的半导体光纤激光器提供泵浦光源。
(3)封装
蘸取光固化胶,将环形谐振腔端口堵死,利用光固化机照射5-10分钟固化胶体,完成封装。
所述的,微纳量子点的内源性光热治疗器件系统,其特征在于,以新型CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点为光增益介质,填充到液芯光纤中,构建光纤环状谐振腔,得到高强度近红外光放大输出;该光源器件携带近红外光热试剂同步直达病灶区域,通过光热试剂调控机制作用范围,利用生物实验中疗效标定实现高精度靶向癌症的可控微区光热治疗过程。
利用红外热像仪实时检测新型的微纳量子点的内源性光热治疗器件系统在癌细胞和活体中的光热疗法治疗效果,利用细胞显像和荧光双染法检测细胞和活体中最终治疗结果,确定量子点含量、量子点的浓度、孵育时间、激光的输出功率及照射时间与细胞凋亡的区域与存活率的对应关系。实现新的光热疗法治疗模式机制,明确新机制对深层次靶向肿瘤实现微区可控的光热治疗效果,具体包括以下步骤:
选择高分化的肝癌细胞系Huh-7模拟病灶源,经过细胞铺板、量子点辐照、细胞显微拍照和流式细胞术及细胞计数方法确定,研究填充液芯光纤的环形谐振腔结构的微纳量子点的内源性光热治疗器件系统的光输出对细胞光热疗效的作用效果。具体实验时照片可看出,无量子点时,紫外光照射细胞时的颜色偏蓝;有量子点照射时的颜色明显偏红,主要是由于虽然量子点主要发射波段在800nm附近,但光谱范围具有正态分布区域,因此,部分可见红光的发射可被观察到,也可看到量子点在参与光热转换的重要作用。
(A)细胞铺板
配置50ml相应完全培养基或使冰箱中贮存的培养基恢复至室温,清洗血球计数板,准备擦镜纸,准备垃圾桶。从CO2培养箱取出4个细胞覆盖率大于80%的Huh7的75cm2培养瓶,在倒置显微镜下观察,观察细胞形态、细胞分布、污染情况。若贴壁细胞需要先洗涤后消化再转移,倒弃培养基后,向原培养瓶中加入5ml 1×PBS溶液,缓慢摇匀后,倒弃液体,加4ml 1×PBS溶液,缓慢摇匀后,加入1ml 0.25%Trypsin-EDTA溶液加入培养瓶中,CO2恒温培养箱中消化5分钟,大部分细胞形态由放射状变为球状时,立即加入5ml培养基并缓慢吹打。将消化后的贴壁细胞悬液或悬浮细胞悬液分别转移至4个15ml离心管中。
分别向原培养瓶中加入3ml 1×PBS溶液,缓慢吹打后移至含沉淀的离心管中,缓慢吹打重悬沉淀缓慢吹打重悬,800rmp离心5分钟,弃上清。分别向4个6孔细胞培养板每个孔中加入2ml新培养基,加入1.2ml培养基于离心管中,缓慢吹打重悬后等分并分别加入孔中,分别于倒置显微镜下观察细胞形态、细胞分布、污染情况,放入CO2恒温培养箱中(5%CO2,37℃)培养(贴壁细胞采取卧式,悬浮细胞采取立式),待进行后续操作。
(B)量子点辐照
分别取3个长满细胞的6孔板,分为对照组、流式细胞组、蛋白质印迹组。打开盖后,用锡箔纸覆盖照射区域以外部分。用毛细吸管或光纤吸取量子点,截断后加入对应样品孔中,同时用微量移液器将近红外光热试剂注射到热疗区域,用蓝色激发光照射30分钟。
在倒置显微镜下,每个孔分别拍摄细胞损伤边界和为损伤部位共6张,流式细胞组照射后0小时、48小时拍摄二次,蛋白质印迹组照射后0小时拍摄一次,对照组照射后0小时、24小时拍摄两次。
于照射后24小时(为保证细胞不因其它因素发生凋亡,应照射实验后立即实验),重新转移并铺板至96孔细胞培养板,向外缘共36孔,加入100μl 1×PBS溶液以防止其余孔中样品完全挥发,六孔细胞培养板中细胞离心后,用1.6ml培养基重悬后,分别向96孔细胞培养板中各加入200μl细胞悬液,剩余细胞悬液重新加入原六孔细胞培养板,培养0小时、24小时后倒置显微镜白光拍照。
(C)治疗效果标记
24小时后,进行bcl-2抗体细胞免疫荧光实验。
照射当天收集细胞于离心管中后放于-80℃冻存,提取蛋白,进行蛋白质印记法实验。
照射后48小时收细胞(为保证细胞不因其它因素发生凋亡,应照射实验后立即实验),进行流式细胞术凋亡测定。
测定结果如下图6和图7所示,同时有量子点和光照两个条件满足,即量子点形成光辐射,肝癌细胞才会凋亡,其他各图细胞几乎没有凋亡。由于光纤照射区域有所限定,通过加入近红外光热试剂能够调控照射范围,所以采用本发明的系统辐照后,细胞凋亡的区域具有区域分化现象。
本发明CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点光放大器对生物热疗方面应用的可行性产生重要影响,解决了现存方案的以下一些问题:
(1)光从体外光源穿越正常组织到达病灶的过程中,光源能量不可大过正常组织损伤阈值,能量穿越过程损耗巨大,治疗效果随着组织深度增加而显著降低,组织穿透深度是其最大掣肘。现阶段成熟的光试剂,大多适用于紫外或者可见光激发,其穿透程度较低(1~3mm)只适用于表皮组织部位的治疗,现在主要在表皮组织部位的治疗中取得显著效果。同时大多数组织的有色体(血红蛋白等)能强烈吸收可见光,大大地干扰了试剂对光能的转化。
本发明直接设计微纳光源进入体内,避开光穿越正常组织,解决光传输损耗和光组织穿透深度太短的问题;
(2)接收或转换光试剂或纳米颗粒在体内病灶处自动聚集,明确区分病灶与正常组织的边界很困难。如果只是表皮组织治疗,进行外部涂抹较易,但深入到深层次肿瘤治疗时,这种聚集和区分边界又成为了光热疗法或光动力疗法的第二大掣肘。
为避免光纤激光能量过大,在病灶处过分烧蚀的问题,本发明采用携带微量量子点转换光源,进而控制光源发射微区范围和发射强度控制;兼容传统光热传导剂或光敏剂的使用,在携带量子点的同时,同步携带光热试剂直达病灶,解决接收或转换光试剂在体内病灶处自动聚集问题。通过外科物理方法,让微纳光源和光热转换试剂,穿越正常组织同步到达病灶处,由外部电开关控制光转换和吸收作用时间,达到对深层次靶向肿瘤实现微区可控的光热治疗效果。
附图说明
图1本发明一种微纳量子点的内源性光热治疗器件系统结构示意图;
图2为CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点结构示意图;
1为光纤环状谐振腔,2为CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点增益介质,3为导光光纤,4为泵浦光源,5为近红外光热试剂,以金纳米颗粒为例,6为CdTe核心,7为CdSe中间层,8为ZnS外层。
图3微纳量子点的内源性光热治疗器件系统示意图。
图4微纳量子点的内源性光热治疗器件治疗过程示意图。
图5肝癌细胞量子点光热疗法光照实验图。
图6肝癌细胞的量子点光热疗法治疗效果的显微结果图。
图7肝癌细胞的量子点光热疗法治疗效果的荧光双染效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
步骤一,利用水相合成法制备CdTe核心
将大于150μL的0.5mmol/mL的过量NaHTe溶液添加到含N
步骤二,利用连续离子层吸附反应技术(SILAR)制备CdSe中间壳层
将0.4mmol NaBH
在90℃温度下,将Cd
步骤三,制备ZnS外壳
将谷胱甘肽(GSH)和Zn(NO
将反应混合物等分试样时,保持温度在90℃。反应混合物中Zn
步骤四,制备光放大器作用端口
采用光纤熔接机将空芯直径为150微米的液芯光纤与普通光纤熔接在一起,进行通光测试,确定光可在液芯光纤中传输3cm以上距离,出射光功率损耗不高于30%以上即可。再将液芯光纤开放端口利用虹吸作用,0.1ml的CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点进入液芯光纤中,蘸取光固化胶,将环形谐振腔端口堵死,利用光固化机照射5-10分钟固化胶体,完成封装。
步骤五,链接完成光放大器装置
将制备好的携带CdTe@CdSe@ZnS双层壳核壳量子点的光纤端口的导光光纤,依次连接光纤跳线和405nm激发光源激光器,形成双层壳核壳量子点光放大器完整装置。
步骤六,细胞铺板
配置50ml相应完全培养基或使冰箱中贮存的培养基恢复至室温,清洗血球计数板,准备擦镜纸,准备垃圾桶。从CO2培养箱取出4个细胞覆盖率大于80%的Huh7的75cm2培养瓶,在倒置显微镜下观察,观察细胞形态、细胞分布、污染情况。若贴壁细胞需要先洗涤后消化再转移,倒弃培养基后,向原培养瓶中加入5ml 1×PBS溶液,缓慢摇匀后,倒弃液体,加4ml 1×PBS溶液,缓慢摇匀后,加入1ml 0.25%Trypsin-EDTA溶液加入培养瓶中,CO2恒温培养箱中消化5分钟,大部分细胞形态由放射状变为球状时,立即加入5ml培养基并缓慢吹打。将消化后的贴壁细胞悬液或悬浮细胞悬液分别转移至4个15ml离心管中。
分别向原培养瓶中加入3ml 1×PBS溶液,缓慢吹打后移至含沉淀的离心管中,缓慢吹打重悬沉淀缓慢吹打重悬,800rmp离心5分钟,弃上清。分别向4个6孔细胞培养板每个孔中加入2ml新培养基,加入1.2ml培养基于离心管中,缓慢吹打重悬后等分并分别加入孔中,分别于倒置显微镜下观察细胞形态、细胞分布、污染情况,放入CO2恒温培养箱中(5%CO2,37℃)培养(贴壁细胞采取卧式,悬浮细胞采取立式),待进行后续操作。
步骤七,量子点辐照
分别取3个长满细胞的6孔板,分为对照组、流式细胞组、蛋白质印迹组。打开盖后,用锡箔纸覆盖照射区域以外部分。用毛细吸管吸取量子点,截断后加入对应样品孔中,用蓝色激发光照射量子点30分钟;用微量移液器吸取量子点,用蓝色激发光照射30分钟。在超净台中,更换培养基。
在倒置显微镜下,每个孔分别拍摄细胞损伤边界和为损伤部位共6张,流式细胞组照射后0小时、48小时拍摄二次,蛋白质印迹组照射后0小时拍摄一次,对照组照射后0小时、24小时拍摄两次。
于照射后24小时(为保证细胞不因其它因素发生凋亡,应照射实验后立即实验),重新转移并铺板至96孔细胞培养板,向外缘共36孔,加入100μl 1×PBS溶液以防止其余孔中样品完全挥发,六孔细胞培养板中细胞离心后,用1.6ml培养基重悬后,分别向96孔细胞培养板中各加入200μl细胞悬液,剩余细胞悬液重新加入原六孔细胞培养板,培养0小时、24小时后倒置显微镜白光拍照。
步骤八,治疗效果标记
24小时后,进行bcl-2抗体细胞免疫荧光实验。
照射当天收集细胞于离心管中后放于-80℃冻存,提取蛋白,进行蛋白质印记法实验。
照射后48小时收细胞(为保证细胞不因其它因素发生凋亡,应照射实验后立即实验),进行流式细胞术凋亡测定。
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