测定凝血时间的方法

技术领域

本发明涉及凝血检查中的控制平均正常凝血酶原时间和提高含有组织凝血活酶的凝血时间测定试剂的保存稳定性的方法。

背景技术

在抗凝疗法的管理中，基于凝血酶原时间(以下，有时称为PT)的监测很重要。PT使用包含组织凝血活酶和钙离子的凝血活酶试剂进行测定。尽管该试剂有多种类型被市售，但是各公司的试剂性能不同，并且试剂以溶液状态保存的情况下的稳定性也较差。

专利文献1中公开了，使镍化合物包含在凝血活酶试剂中并将国际敏感指数(ISI)调整至1.5以下的方法和使用了该方法的组合物。

专利文献2中公开了，含有非离子性表面活性剂、镍离子和组织因子的凝血测定用试剂，记载了组织因子的稳定化需要非离子性表面活性剂和镍离子。

然而，两个文献均未记载与平均正常凝血酶原时间(以下，有时称为MNPT)的控制有关的内容。

因此，需要对MNPT进行控制的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2001-255332

专利文献1：日本特开2008-241621

发明内容

发明所解决的技术问题

本发明提供了凝血检查中的控制平均正常凝血酶原时间和提高含有组织凝血活酶的凝血时间测定试剂的保存稳定性的方法。

解决问题的技术手段

本发明人为了解决所述问题进行了深入研究，结果发现，可通过使特定的金属离子与组织凝血活酶共存来将MNPT控制·调整在期望的时间内，并且在使该特定的金属离子与组织凝血活酶共存的情况下，还可提高凝血活酶试剂以溶液状态保存的情况下的稳定性，完成了本发明。

即，本发明在一方面提供以下内容。

[1]一种将正常血浆的凝固时间调整至预先设定的范围内的方法，其中，

在使用包含组织凝血活酶和钙的试剂进行的凝血时间测定方法中，在凝固反应时使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的离子共存而进行。

[2]一种提高所述凝血时间测定试剂的保存稳定性的方法，其中，

在包含组织凝血活酶和钙的凝血时间测定试剂中，使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的离子在包含磷脂质和钙的试剂中共存。

[3]一种将正常血浆的凝固时间调整至预先设定的范围内的方法，其中，

在使用包含磷脂质和钙的试剂进行的凝血时间测定方法中，在凝固反应时使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的离子共存而进行。

[4]一种提高所述凝血时间测定试剂的保存稳定性的方法，其中，

在包含磷脂质和钙的凝血时间测定试剂中，使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的离子在包含磷脂质和钙的试剂中共存。

发明效果

通过本发明的方法，可控制凝血检查中的平均正常凝血酶原时间，并且可提高含有组织凝血活酶的凝血时间测定试剂的保存稳定性。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。以下的说明仅仅是例举，本发明的范围不限于这些说明，可在不损害本发明的主旨的范围内适宜变更并实施。

(定义)

除非另有说明，否则本说明书中使用的全部的技术性和科学性用语都具有本发明所述领域中的技术人员通常理解的意义。

在本说明书中，例如，在针对某个事项显示多个数值的范围的情况下，该多个范围的每一个中的任意下限值和任意上限值的组合的范围也具有与关于该事项所记载的范围具有的意义同样的意义。

在本说明书中，“MNPT”是指“平均正常凝血酶原时间”。

推荐约11秒～约13秒的范围。

可用于本发明的金属离子可选自钴、锰和锂。各金属离子例如，氯化钴、EDTA2钠·钴、氯化锰、硫酸锰、氯化锂、乙酸锂等，可通过制备市售品的水溶液来用于本发明。

可用于本发明的各金属离子的浓度，可考虑其他条件通过实验适宜选择，作为一个实例，0.25mmol/L～3.5mol/L是适宜的，并且0.5mmol/L～3.0mol/L也是一个适宜的实例。

虽然并非拘泥于特定的理论，但推测本发明的金属离子的效果是通过与组织凝血活酶和/或磷脂质的相互作用而奏效。

根据本发明，

[1]可将正常血浆的凝固时间调整至预先设定的范围内，其特征在于，在使用包含组织凝血活酶和钙的试剂进行的凝血时间测定方法中，在凝固反应时使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的金属离子共存而进行，

[2]可提高所述凝血时间测定试剂的保存稳定性，其特征在于，在包含组织凝血活酶和钙的凝血时间测定试剂中，使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的金属离子在包含磷脂质和钙的试剂中共存，

[3]可将正常血浆的凝固时间调整至预先设定的范围内，其特征在于，在使用包含磷脂质和钙的试剂进行的凝血时间测定方法中，在凝固反应时使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的金属离子共存而进行，

[4]可提高所述凝血时间测定试剂的保存稳定性，其特征在于，在包含磷脂质和钙的凝血时间测定试剂中，使选自钴离子、锰离子和锂离子中的1种或2种以上的金属离子在包含磷脂质和钙的试剂中共存。

此外，根据本发明，提供将平均正常凝血酶原时间控制在期望的范围内，并且提高了保存稳定性的含有组织凝血活酶的凝血时间测定试剂，例如PT(凝血酶原时间)测定试剂。此外，通过本发明，提供将标准血浆的凝固时间控制在期望的范围内，并且提高了保存稳定性的含有磷脂质的凝血时间测定试剂，例如APTT(活化部分凝血活酶时间)测定试剂。

基于本发明的PT测定试剂包含含有组织凝血活酶和钙的试剂，此外，基于本发明的APTT测定试剂包含含有磷脂质和钙的试剂，可作为可在溶液状态下冷藏保存的试剂提供。

当然，当实施本发明时，可适宜地与凝血领域中公知的技术组合进行使用，只要不背离本发明的思想，任何改变都是可能的。

实施例

以下，通过实施例对本发明进一步详细地说明，但是本发明不限于此。

实施例1.

(1-1)试剂和检查材料

(1-1-1)凝血活酶试剂

制备包含通过丙酮提取法从兔子脑中制备的组织凝血活酶提取物和1mmol/L氯化钙的溶液，作为凝血活酶试剂。

(1-1-2)添加了氯化钴的凝血活酶试剂

在所述凝血活酶试剂中，分别添加0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mmol/L的氯化钴，制备各浓度的添加了氯化钴的凝血活酶试剂。

(1-1-3)正常检查材料

使用两种不同批次的正常柠檬酸混合血浆(积水化学公司)。

(1-2)凝血酶原时间的测定方法

在37℃下孵育所述正常血浆50μL后，向其中添加所述各浓度的添加了氯化钴的凝血活酶试剂100μL，在37℃下测定凝固时间。测定使用凝血自动分析装置CP3000(SEKISUIMEDICAL公司)进行。对于各批次正常血浆，分别以n＝2进行测定并计算平均值，进一步计算2批次间的平均值作为测定值。

(1-3)结果

相对于在不添加氯化钴(0mmol/L)的情况下的凝固时间，添加氯化钴(0.5mmol/L～3.0mmol/L)的情况下的凝固时间缩短。

各测定值示于表1。

[表1]

实施例2.

(2-1)试剂和检查材料

(2-2)凝血酶原时间的测定方法

(2-1)、(2-2)除了添加物质为表2所示的金属盐之外，均以与实施例1同样的方式进行。

(2-3)保存稳定性试验方法

将添加了所述各添加物质的凝血活酶试剂在37℃下保存28天后，测定正常血浆的凝血酶原时间，确认试剂性能的变动。

(2-4)结果

相对于不添加添加物质(0mmol/L)的情况下的凝固时间，添加各添加物质(1.0mmol/L)的情况下的凝固时间缩短(表2中[B])。此外，在37℃下，保存28天后的凝固时间，相对于不添加的情况为同等，或延长率较低(表2中[E])。确认了本申请发明的添加物质可使包含组织凝血活酶的凝血时间测定试剂中的MNPT缩短，并且可提高长期保存稳定性。

各测定值示于表2。

[表2]

各值的计算步骤如下，以添加了氯化钴的情况为例。

[Bx]＝[A1a]/[A0]*100为97.4[B1a]＝12.45[A1a]/12.78[A0]*100，

[Dx]＝[Cx]-[Ax]为0.50[D1a]＝12.95[C1a]-12.45[A1a]，

[Ex]＝[Dx]/[D0]*100为66.7[E1a]＝0.50[D1a]/0.75[D0]*100。