一种快速驯化四倍体野生稻落粒性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种减弱或降低植物落粒性的方法、基因、蛋白质、相关生物材料及其应用。

背景技术

落粒性的丧失是水稻驯化过程中选择的重要的农艺性状，对于野生稻而言，易落粒有利于后代繁衍。而对于适用于农艺生产的水稻作物而言，由于落粒造成水稻产量严重减产，影响收获指数。四倍体野生稻Oryza alta具有生物量大、适应力强、抗逆能力强等优势，但是由于未经过人工驯化，种子成熟时，野生稻的种子极易脱离母体形成落粒。因而开展落粒性相关研究对于野生稻的快速驯化以及培育落粒性减弱的品种具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种减弱或降低植物落粒性的方法，包括降低植物中OaqSH1蛋白的含量和/或活性和/或降低或抑制植物中所述OaqSH1蛋白编码基因的表达量，从而使植物的落粒性减弱或降低。

所述OaqSH1蛋白为如下a1)或a2)或a3)蛋白质：

a1)氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示蛋白质；

a2)将序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；

a3)与序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于水稻且具有相同生物学功能的蛋白质。

所述几个氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。

上述降低或抑制植物中所述OaqSH1蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组等。

上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对OaqSH1蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控OaqSH1蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将OaqSH1蛋白的编码基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子或5’UTR等作为靶标。

可选地，根据上述的方法，包括向所述植物中导入降低或抑制所述OaqSH1蛋白编码基因表达的物质。

所述OaqSH1蛋白编码基因可为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的DNA分子：

c1)编码序列是序列表中SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的DNA分子；

c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码所述OaqSH1蛋白的DNA分子；

c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述OaqSH1蛋白的DNA分子。

术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。

可选地，根据上述的方法，所述降低或抑制所述OaqSH1蛋白编码基因表达的物质为如下b1)-b4)任一种物质：

b1)抑制或降低上述OaqSH1蛋白编码基因表达的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。

可选地，根据上述的方法，b1)所述的核酸分子为表达靶向所述OaqSH1蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向所述OaqSH1蛋白编码基因的gRNA。例如，所述靶向所述OaqSH1蛋白编码基因的gRNA的靶序列如SEQ ID No.7所示。则可以通过CRISPR/Cas9方法对OaqSH1蛋白编码基因进行定点编辑，使植物中的OaqSH1蛋白编码基因的表达量降低或被抑制，例如将表达Cas9蛋白和gRNA的重组质粒载体通过农杆菌的侵染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，具体可使用下述实施例中制备的重组质粒VK005-qSH1gRNA。

可选地，根据上述的方法，所述降低植物中OaqSH1蛋白的含量和/或活性和/或降低或抑制植物中所述OaqSH1蛋白编码基因的表达量的方法为将水稻基因组中的SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6所示的所述OaqSH1蛋白编码基因进行下述至少一种突变：

1)在水稻基因组中的SEQ ID No.5的第930和931位核苷酸之间插入一个核苷酸A或插入一个核苷酸T；

2)在水稻基因组中的SEQ ID No.6所示的所述OaqSH1蛋白编码基因第1706和1707位核苷酸之间插入一个核苷酸A。

上文中，植物可为单子叶植物或水稻，水稻为任何水稻，只要含有上述靶序列即可，本发明列举的例子为高秆野生稻(Oryza alta，CCDD，2n＝4x＝48)。

由于高秆野生稻为四倍体植物，因而上述方法为改造后得到的水稻可以是所有染色单体均被定点编辑的水稻，也可以是部分染色单体被定点编辑的水稻，均可实现落粒性降低。

上述OaqSH1蛋白、上述OaqSH1蛋白编码基因属于本发明的保护范围之内。

上述OaqSH1蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围之内。所述生物材料为下述C1)至C6)和D1)至D7)中的任意一种：

C1)含有上述OaqSH1蛋白编码基因的表达盒；

C2)含有上述OaqSH1蛋白编码基因的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有上述OaqSH1蛋白编码基因的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；

C4)含有上述OaqSH1蛋白编码基因的转基因植物细胞系、或含有C1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

C5)含有上述OaqSH1蛋白编码基因的转基因植物组织、或含有C1)所述表达盒的转基因植物组织；

C6)含有上述OaqSH1蛋白编码基因的转基因植物器官、或含有C1)所述表达盒的转基因植物器官；

D1)抑制或降低上述OaqSH1蛋白编码基因表达的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。

本发明还提供了上述OaqSH1蛋白、上述OaqSH1蛋白编码基因或上述OaqSH1蛋白相关的生物材料在调控植物落粒性中的应用或在制备调控植物落粒性产品中的应用。

上文中，所述植物可为单子叶植物或水稻。

上文中，所述落粒性减弱或降低可体现为水稻的枝梗和不育外稃之间不能形成离层。

本发明的具体实施例通过基因组编辑技术同时突变OaqSH1的两个基因位点(同时敲除OaqSH1-CC和OaqSH1-DD)，得到落粒性减弱的水稻。

附图说明

图1为O.alta中OaqSH1基因靶位点示意图。

图2为实施例1制备的VK005-qSH1gRNA结构示意图。

图3为实施例2部分T

图4为实施例2部分阳性编辑苗的测序结果。

图5为实施例3离层切片观察结果，左图是20倍镜放大效果，右图是40倍镜放大效果，O.alta为野生型材料，T0-1为阳性编辑苗T0-1；SL为不育外稃；AL为离层；RG为护颖；PE为枝梗；VB为维管束。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的双元载体VK005-01为北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(货号：VK005-01)中的Cas9/gRNA Vector。

下述实施例中的四倍体野生稻为野生稻Oryza alta 2007-24，即为文献1中第906页左栏1.1中的高秆野生稻种质材料(O.alta Swallen，染色体组为CCDD，编号为YD-7900)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所或国家种质南宁野生稻圃获得。文献1：梁云涛等，高秆野生稻愈伤组织诱导分化研究，西南农业学报，2014，27(3)，905-909。

四倍体野生稻Oryza alta为异源四倍体，大部分基因在CC和DD亚基因组上都有拷贝。通过比对分析，Oryza alta中存在两个qSH1的同源基因，位于CC亚基因组1号染色体上的基因命名为OaqSH1-CC，另一位于DD亚基因组1号染色体上的基因命名为OaqSH1-DD。OaqSH1-CC的序列如SEQ ID No.5所示，其编码的OaqSH1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，该OaqSH1蛋白的CDS如SEQ ID No.3所示。OaqSH1-DD的序列如SEQ ID No.6所示，其编码的OaqSH1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该OaqSH1蛋白的CDS如SEQ ID No.4所示。

实施例1、四倍体OaqSH1靶位点的选择并构建敲除载体

一、靶序列的设计

在OaqSH1-CC和OaqSH1-DD第一个外显子保守区域设计靶位点(如图1)。

靶序列如下：

5’-CGGCGCGGCCGTTGCGGCAG-3’(SEQ ID No.7，PAM为CGG，对应于SEQ ID No.5的第914-936位和SEQ ID No.6的第1690-1712位)

二、gRNA的设计

根据上述靶序列，设计gRNA。

三、重组质粒的构建

合成下述带有接头序列(下划线部分)的单链引物：

VK005-qSH1-F：5’

VK005-qSH1-R：5’

VK005-qSH1-F和VK005-qSH1-R形成双链DNA分子。该双链DNA分子表达gRNA中与上述靶序列相应的RNA片段。

将双元载体VK005-01进行BspQI单酶切，胶纯化回收约17kb左右的载体片段。在T

实施例2、制备阳性编辑苗

将实施例1制备的质粒VK005-qSH1gRNA通过电激方法转化农杆菌EHA105，菌落PCR鉴定出阳性克隆，挑选阳性克隆测序，得到含有VK005-qSH1gRNA的阳性克隆即为重组农杆菌。用于菌液PCR的引物对如下：

VK005-F：AAAACCTCACCAAAATACGA(SEQ ID No.10)

VK005-R：TTGCTCCCAACAATTCTTAA(SEQ ID No.11)

利用重组农杆菌侵染四倍体野生稻的愈伤组织，然后依次进行抗性筛选、分化再生、生根培养得到T

设计OaqSH1在CC和DD亚基因组上的特异引物，将得到的T

用于扩增OaqSH1-CC的引物对如下

OaqSH1-CC-F：5’-GTCGGGGTGGGAGAGGTTCC-3’

OaqSH1-CC-R：5’-GATTCGACGACGCGGAGGAG-3’

用于扩增OaqSH1-DD的引物对如下

OaqSH1-DD-F：5’-GGTGGGAGAGGAGGCTACA-3’

OaqSH1-DD-R：5’-GATTCGACGACGCGGAGGAG-3’

实施例3、阳性编辑苗表型鉴定

将实施例2制备的阳性编辑苗T0-1和四倍体野生稻(O.alta，野生型材料)种植在自然条件下，在水稻抽穗期间进行取样，进行离层切片观察。

实验主要依据间苯三酚染色的实验方法，具体操作为：

(1)固定：将小穗和枝梗连接处的组织切下，将组织固定在50％formaldehyde-acetic acid-alcohol(FAA)固定液中，真空抽取，换新鲜的50％FAA 4℃过夜。在LeicaASP200S自动脱水机中按照说明书进行脱水。

(2)包埋：将组织样品包埋石蜡中。

(3)切片：将石蜡包埋的组织切成8μm的薄片，并利用无菌水在42℃烘台展片。

(4)脱蜡：在二甲苯中进行洗脱10min，洗脱两次。50％二甲苯：50％乙醇洗脱1min，然后进行乙醇梯度洗脱，100％乙醇(两次)、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇和30％乙醇，时间各1min。

(5)染色：用酸性间苯三酚试剂进行染色，待组织变红后，用酸性甘油封片，进行镜检。

组织学实验表明(如图5)，在野生型材料中，枝梗和护颖之间离层明显，离层部位有纵向排列的小而圆的薄壁细胞。而在T0-1中(OaqSH1-CC和OaqSH1-DD位点发生移码突变)，水稻的枝梗和不育外稃之间的细胞形态大，为厚壁细胞，无法形成离层，故落粒性减弱。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种快速驯化四倍体野生稻落粒性的方法

<130> 210441

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 610

<212> PRT

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 1

Met Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gln Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Glu His His His His His His Gly His Ala Gly His Leu Leu

20 25 30

Leu His His His Pro Gln His Val Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Met Tyr His Val Pro Gln His Ser

50 55 60

Arg Arg Glu Lys Leu Arg Phe Pro Pro Asp Ala Gly Asp Ser Pro Pro

65 70 75 80

Pro His Gly His Ala Pro Gln Gln Gln Gln His Gly Ser Trp Pro Pro

85 90 95

Pro Pro Ala Phe Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Pro

100 105 110

His Ser Pro Thr Leu Ala Gln Ala Gln Leu Val Ala His Gly Leu Ala

115 120 125

Pro Pro Leu Pro Gln Ile Pro Thr Gln Asn Phe Ser Leu Ser Leu Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Ser Asn Pro Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Arg Arg Gln

145 150 155 160

Leu Gly Gly Leu Ala Gln Ala Thr Gly Pro Phe Gly Pro Phe Thr Gly

165 170 175

Tyr Ala Ala Val Leu Gly Arg Ser Arg Phe Leu Gly Pro Ala Glu Lys

180 185 190

Leu Phe Glu Glu Ile Cys Asp Val Gly Gly Ala Ala Ser His Val Asp

195 200 205

Arg Thr Ile Ser Asp Glu Gly Leu Leu Asp Ala Asp Pro Met Asp Gly

210 215 220

Val Asp His Asp Ala Val Asp His Asp Leu Gly Ser Ala Asp Arg Ala

225 230 235 240

Ala Ala Asp Ala Gly Pro Ile Ser Gly Ala Glu Gln Gln Trp Lys Lys

245 250 255

Thr Lys Leu Ile Ser Met Met Glu Glu Val Cys Lys Arg Tyr Arg Gln

260 265 270

Tyr Tyr Gln Gln Val Gln Ala Val Met Ala Ser Phe Glu Thr Val Ala

275 280 285

Gly Phe Ser Asn Ala Ala Pro Phe Ala Ala Leu Ala Leu Arg Ala Met

290 295 300

Ala Lys His Phe Lys Cys Leu Lys Ser Met Ile Leu Asn Gln Leu Arg

305 310 315 320

Asn Thr Ser Asn Lys Val Ala Val Lys Asp Gly Leu Asn Lys Asp Ile

325 330 335

Ala Val Phe Gly Leu Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly

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Leu Gln Arg Gly Asn Ser Ala Ser Ala Phe Gly Gln Pro His Asn Ile

355 360 365

Trp Arg Pro Gln Arg Gly Leu Pro Glu Arg Ala Val Ser Val Leu Arg

370 375 380

Ala Trp Leu Phe Glu His Phe Leu His Pro Tyr Pro Thr Asp Gly Asp

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Lys Gln Met Leu Ala Lys Gln Thr Gly Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser

405 410 415

Asn Trp Phe Ile Asn Ala Arg Val Arg Leu Trp Lys Pro Met Val Glu

420 425 430

Glu Ile His Asn Leu Glu Met Arg Gln Met His Lys His Ser Val Val

435 440 445

Asp Lys Gly Gln His Ser Val His His Gln Ala Gln His Ser Ser Gln

450 455 460

Cys Ser Gly Lys Pro Ser Asp Pro Ser Asp Ser His Pro Gly Gln Ser

465 470 475 480

Ser Ser Ile Thr Arg Asn His Asn Thr Ala Ala Ser Gln Gly Phe Pro

485 490 495

Asp Glu Leu Ser Gln Met Ser Gln Ser Ile Lys Gly Gln Val Ser Phe

500 505 510

Ser Tyr Asn Gly Leu Thr Ser Gln His Asn Ile Ala Ser Pro His His

515 520 525

Gln His Gln Gln Val Gly Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser Asn Gly Gly

530 535 540

Val Ser Leu Thr Leu Gly Leu His Gln Asn Asn Arg Val Cys Ile Ala

545 550 555 560

Glu Pro Leu Pro Ala Ala Leu Pro Ala Asn Leu Ala His Arg Phe Gly

565 570 575

Leu Glu Glu Val Ser Asp Ala Tyr Val Met Ser Ser Phe Gly Gly Gln

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Asp Arg His Phe Gly Lys Glu Ile Gly Gly His Leu Leu His Asp Phe

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Val Gly

610

<210> 2

<211> 771

<212> PRT

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 2

Met Asp Gly Trp Ile Ser Trp Gln Gln Gln Pro Arg His Arg Leu Ala

1 5 10 15

Val Ala Leu Cys Ser Cys Arg Ala Lys Gly Gly Ala Gly Thr Cys Leu

20 25 30

Pro Val Thr Ser His Ala Thr Gln Gln Pro Thr Ala Ala Ala Lys Glu

35 40 45

Trp Gly Phe Ser Pro Pro Tyr Pro Gly Ala Arg Arg Arg Met Glu Asn

50 55 60

Arg Lys Glu Arg Arg His Glu Pro Ser Asn Asn Thr Gln His Lys Gly

65 70 75 80

Glu Arg Gly Glu Lys Glu Glu Glu Lys Asn Lys Arg Thr Arg Gly Gly

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100 105 110

Gly Glu Val Arg Pro Val Gln Pro Ser Gln Ala Arg Ala Leu Gly Lys

115 120 125

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130 135 140

His Cys Ala Ala Pro Leu Arg Thr His His Pro Tyr Tyr Val Pro Thr

145 150 155 160

Pro Ala Arg Ala Pro Arg Arg Pro Thr Thr Val Arg Ala Cys Ala Pro

165 170 175

Cys Arg Pro Pro Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Pro Thr Gly Glu

180 185 190

Ala Arg Ser Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Pro Ala Thr Ser Cys Ser

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Arg Arg Arg Ala Gly Arg Cys Thr Thr Cys Pro Ser Thr Ala Gly Ala

225 230 235 240

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Thr Arg Thr Arg Pro Pro Pro Arg Arg Thr Pro Arg Thr Ala Leu Arg

275 280 285

Arg Arg Arg Ser Trp Trp Arg Thr Gly Trp Arg Arg Arg Ser Arg Arg

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Ala Thr Ser Ala Ala Leu Leu Arg Thr Trp Thr Ala Pro Ser Arg Thr

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Pro Ser Arg Gly Pro Ser Ser Ser Gly Arg Arg Arg Ser Ser Ser Pro

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Tyr Thr Ser Cys Ala Thr Arg Ala Thr Arg Ser Leu Ser Arg Thr Gly

485 490 495

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Tyr Ala Arg Gly Cys Ser Asn Thr Ser Cys Ile Arg Ile Leu Leu Met

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Leu Ile Leu Cys Trp Cys Arg Tyr Gln Thr Gly Leu Ser Thr Gln Gly

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Leu Gly Cys Gly Ser Gln Trp Trp Lys Lys Phe Thr Thr Arg Gly Lys

595 600 605

Cys Thr Ser Thr Gln Trp Leu Thr Arg Val Ser Ile Ala Cys Ile Ile

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Arg Pro Ser Ile Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ser His Pro Ile Leu Pro

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Ile His Ile Leu Asp Arg Ala Ala Ala Pro Gly Thr Thr Thr Pro Leu

645 650 655

Pro Pro Arg Ala Ser Arg Met Ser Ser Pro Arg Cys Pro Ser Pro Ser

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Arg Asp Lys Ala Ser His Thr Thr Gly Pro Arg Ser Thr Thr Leu His

675 680 685

His Gln Ile Asn Ser Ile Ser Arg Ser Ala Val Ser Val Leu Glu Ala

690 695 700

Ala Met Ala Val Ser Pro Ser Pro Leu Val Phe Thr Arg Thr Thr Gly

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Ser Ala Ser Pro Ser Leu Ser Arg Leu Leu Ser Arg Pro Thr Leu Thr

725 730 735

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Leu Leu Asp

770

<210> 3

<211> 1833

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcgtccg ccgctggggg cggcgggtac ggcggcggcc agggtggagg cgcggagcac 60

caccaccacc accacgggca cgccggccac ctcctgctcc accaccatcc gcagcacgtg 120

gccggcgcgg ccgttgcggc agcggcagcg gcagctgcgg gcgggcagat gtaccacgtg 180

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cagcttgtgg cgcacgggct ggcgccgccg ctcccgcaga tcccgacgca gaacttctcg 420

ctgtcgctct cctccgcgtc gtcgaatcct ccacccccgc aggcgcagcc gaggaggcag 480

ctcggcggcc tcgcgcaggc cacggggccg ttcggtccct tcaccggcta cgccgccgtg 540

ctcggccggt cccgtttcct cggcccggca gagaagctgt tcgaggagat ctgcgacgtc 600

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ccgatggacg gtgtcgatca tgacgccgtt gatcacgacc tcggcagcgc cgaccgcgca 720

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tccatgatgg aagaggtttg caagaggtac cggcagtact accagcaggt tcaggctgtg 840

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caaatgcaca agcactcagt ggttgacaag ggtcagcata gcgtgcatca tcaggcccag 1380

cattcttcgc agtgcagcgg gaagccctct gatccttcgg actcgcatcc tggacagagc 1440

agcagcataa cccggaacca caacactgct gcctcccagg gcttcccgga tgagctctcc 1500

cagatgtccc agtccatcaa gggacaggtg agcttctcat acaacgggct gacctcgcag 1560

cacaacattg catcaccaca tcatcagcac cagcaggtcg gtggtgtcgg tatcggaggt 1620

agcaatggcg gtgtctccct cacccttggt cttcaccaga acaacagggt ctgcatcgcc 1680

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agtgacgcct atgtgatgag ctcatttgga ggtcaggacc ggcatttcgg gaaggagatt 1800

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<210> 4

<211> 2390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggatgggt ggatttgaag ttaatggcag cagcagccac gtcacaggct cgccgtagcg 60

tagctatgct aatcatgccg cgccaaaggg ggagccggca cgtgtctccc ggtgacgtcc 120

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cagcacaaag gcgaaagggg ggaaaaagag gaggaaaaaa acaagaggac gcgcgggggg 300

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agaccagtcc agccaagcca ggcccgggcg ctcggaaagt gcggagccgt ttcccctcta 420

tctccactct ctccagggcc aggtgctcac tgcgctgcgc ctcttcgcac gcaccacccg 480

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<212> DNA

<213> 野生稻(Oryza alta)

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<212> DNA

<213> 野生稻(Oryza alta)

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agacccagca ttcttcgcag tgcagcggga agccatccga tccttccgat tcacatcctg 5100

gacagagcag cagcataacc cggaaccaca acaccgctgc ctcccagggc ttcccggatg 5160

agctctccca gatgtcccag tccatccagg gacaagtgag cttcgcatac aacgggctga 5220

cctcgcagca caacattgca tcaccaaatc aacagcatca gcaggtcggc ggtgtcggta 5280

ttggaggcgg caatggcggt gtctccctca cccttggtct tcaccagaac aacagggtct 5340

gcatcgccga gcctctcccg gctgctctcc cggccaacct agctcaccgt ttcggactgg 5400

aggaagtcag tgacgcctac gtgatgagct catttggagg tcaggacagg catttcggga 5460

aggagattgg tggtcacttg ctgcatgatt ttgttggatg at 5684

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggcgcggcc gttgcggcag 20

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