一种鸡RPS14多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种鸡RPS14多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

肉鸡腹水综合征(ascites syndrome，AS)又称为肺动脉高压综合征(PHS)，是一种主要发生在肉鸡体内的一种非传染性的营养代谢性疾病。其临床特征主要为羽毛稀少、步态异常、精神萎靡、食欲不振同时伴有明显的腹部膨胀。研究表明，此类疾病多数由遗传、营养、环境和饲养管理等因素导致，并在快速生长的肉鸡群中高发。这是因为此类快速生长型肉鸡其肌肉质量和代谢率有明显提高，对氧气的消耗也明显增多。但是，其机体中心脏和肺脏等重要器官的体积和容量并没有增大，这就致使心肺系统无法应对不断增长的氧气需求，进而造成心肺动脉血管收缩，组织缺氧严重。而组织缺氧又会引发动脉血管压力增加，右心室肥大并伴随着迅速衰竭。已有研究表明，这种肺动脉高压和腹水类疾病已经对我国的商业肉鸡养殖业带来严重的危害，这类肉鸡疾病一般易发生于寒冷的冬季和早春，且伴有明显的群发性，病死率为10％-30％，且有逐年上升趋势。在全球肉鸡产业中，腹水类疾病造成了约25％的总死亡率，是近年来严重损害养禽业经济效益的一种疾病。

RPS14(ribosomal protein S14)基因是核糖体蛋白基因超家族的一员。该基因位于18s rRNA的3’末端并由5个外显子和4个内含子组成，在核糖体40S亚基复合体的形成过程中发挥关键辅助作用。研究表明，RPS14基因的表达与红细胞的过度凋亡呈现明显的负相关趋势。当动物机体处于一系列生理应激反应时，如：核糖体缺乏，会通过抑制MDM2介导的p53多泛素化(降解)来稳定和激活p53基因，p53途径的激活会导致红细胞生长周期停滞，并促进其发生大量凋亡。红细胞的急剧减少会导致动物心肺中氧气供应明显不足，当细胞、组织的供氧能力与较高的代谢负荷不匹配时，机体出现明显缺氧，诱发腹水综合征的发生。同时，RPS14基因还具有影响核糖体正常的生物合成和改变蛋白质翻译的能力，核糖体蛋白S14激活和表达是珠蛋白合成的前提，而珠蛋白又是红细胞合成的基础，进而影响血红蛋白的产生。血红蛋白是红细胞中运输氧气的特殊蛋白质，该蛋白的缺乏会导致心肺无法获得足够的氧气输送，出现明显的组织缺氧，组织缺氧会引起血管阻力增大，压力增强，最终导致肉鸡腹水综合征的出现。综上可知，RPS14与肉鸡肺动脉高压和腹水类疾病存在着密切的联系。在本发明前期研究中，已经证明与正常组相比较，肉鸡发生此类疾病时，会降低RPS14基因mRNA的表达。这表明在分子水平上，RPS14的表达对此类疾病的发生发展有着明显的影响。但是，在蛋白水平上对此类疾病的影响尚未明确。同时，通过制备RPS14多克隆抗体为肉鸡的腹水类疾病的检测和病理机制研究也几乎未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡RPS14多克隆抗体及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种鸡RPS14基因多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)以鸡的cDNA为模板，进行RPS14基因的PCR扩增得到目的片段，所述PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；(2)利用所述目的片段与PET-28a(+)表达载体连接构建得到重组表达质粒PET28a-RPS14；(3)将所述重组表达质粒PET28a-RPS14转入Rosetta(DE3)感受态细胞后进行原核表达，纯化后透析复性获得鸡RPS14重组蛋白；(4)利用所述鸡RPS14重组蛋白免疫兔子后采血，分离血清得到所述鸡RPS14基因多克隆抗体；(5)利用酶联免疫吸附试验、蛋白免疫印记检测或免疫荧光技术对所述鸡RPS14基因多克隆抗体进行抗体质量验证。

进一步的，所述步骤(1)PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火35s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min。

进一步的，所述步骤(3)原核表达的具体步骤为：在转入PET28a-RPS14的Rosetta(DE3)感受态细胞中加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃，220rpm/min的摇床上摇4h。

进一步的，所述步骤(3)纯化的洗脱液为500mM咪唑浓度的洗脱液。

进一步的，所述步骤(3)透析复性具体为利用尿素梯度下降透析目的蛋白，同时透析液置于4℃环境中每4h更换一次。

进一步的，所述步骤(4)鸡RPS14重组蛋白免疫白兔的具体方法为：鸡RPS14重组蛋白多点皮下注射于新西兰大白兔中引起免疫反应，每10天加强免疫一次，总共免疫30天。

进一步的，步骤(5)中所述酶联免疫吸附试验中其抗原包被的最佳稀释浓度为2.5μg/ml；抗RPS14血清和免疫前血清的稀释梯度都是1:100-1:204800；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG稀释浓度为1：3000；酶标仪的反应波长为450nm；

所述蛋白免疫印记检测中抗RPS14血清和免疫前血清的稀释比例为1：3000；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG的稀释比例为1：1000；

所述免疫荧光技术中抗RPS14血清和免疫前血清的稀释比例为1：200；CY3标记山羊抗兔IgG(H+L)的稀释比例为1：300。

本发明还提供一种根据任一所述的制备方法制备的鸡RPS14多克隆抗体。

本发明还提供一种根据所述的鸡RPS14多克隆抗体在制备鸡肺动脉高压和/或腹水类疾病检测工具中的应用。

进一步的，所述工具为试剂或试剂盒。

本发明公开了以下技术效果：本发明采用克隆、亚克隆技术构建出PET28a-RPS14表达载体，经由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达的重组RPS14蛋白纯化后作为抗原免疫兔子，从而制备高质量的多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验、蛋白免疫印记和间接免疫荧光技术等检测方法对RPS14基因表达进行检测以验证该多克隆抗体的灵敏度和特异性，证实了本发明制备的鸡RPS14多克隆抗体具有灵敏度好、特异性强、应用范围广等方面的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为与肉鸡肺动脉高压和腹水类疾病发生发展相关的RPS14基因多克隆抗体研制方法的技术路线图；

图2为克隆和表达重组质粒的构建；其中，A为RPS14基因的RCR扩增产物(453bp)，泳道1-2为目的基因的PCR扩增条带，泳道3为阴性对照；B为

图3为重组RPS14蛋白的原核表达和纯化，其中A为成功表达的重组RPS14蛋白，泳道1-2为RPS14基因原核表达的总蛋白，泳道3为空白对照(未添加诱导剂)；B为重组RPS14蛋白表达形式的鉴定，泳道1为超声破碎后的上清液，泳道2为超声破碎后的沉淀，泳道3为空白对照(未添加诱导剂)；C为重组RPS14蛋白包涵体溶解鉴定，泳道1为超声破碎后的上清液，泳道2为超声破碎后的沉淀，泳道3为溶解RPS14包涵体后的上清液；D为镍柱纯化后的RPS14蛋白，泳道1-3为用白色箭头指示纯化后的RPS14蛋白(22kDa)，泳道4为洗脱缓冲液；E为透析浓缩后的重组蛋白，泳道1-4为浓缩后的目的蛋白(22kDa)，五张电泳图的标准蛋白Marker大小是10-180kDa，且白色箭头都是指示目的蛋白。

图4为抗RPS14血清效价的测定，其中X轴为抗RPS14血清的稀释梯度，Y轴为抗RPS14血清在450nm波长处的数值，抗血清1-3表示不同的三只兔子产生的抗血清在相同稀释梯度下的吸光值，免疫前血清为未免疫的血清在相同稀释梯度下的吸光值。

图5为免疫印迹法检测白羽肉鸡中RPS14蛋白表达水平；A为五种相关组织中RPS14的蛋白质水平；B为RPS14蛋白在正常组和病理组中的表达柱状图，其中X轴为肺动脉、肝、肾、心和肺五种不同的组织，Y轴为RPS14相较于β-actin的表达水平，用mean±SE的方式表示统计分析出的数据(n＝3)；C为在原核表达中RPS14蛋白的特异性，上层泳道1-3为肉鸡肺动脉RPS14蛋白(黑色箭头指示位置为22kDa)，下层泳道1-3为阴性对照(一抗：免疫前血清)。

图6为肉鸡、肉鸭、山羊、老鼠和兔子相关组织(肺动脉、肝、肾、心和肺)RPS14蛋白表达免疫荧光检测，其中A-F分别为PBS缓冲液(空白对照)、免疫前血清(阴性对照)和兔抗鸡RPS14血清和正常肉鸡，腹水肉鸡，正常肉鸭，正常山羊，正常小鼠和正常兔子中相关组织切片孵育后的免疫荧光结果图；G为肉鸡肺动脉、肝、肾、心和肺组织RPS14蛋白平均荧光强度柱状图，其中X轴为相关组织，Y轴为RPS14蛋白的平均荧光强度；H为不同物种RPS14基因同源性比较结果图；I为不同动物相关组织RPS14蛋白平均荧光强度柱状图，其中X轴为肺动脉、肝、肾、心和肺，Y轴为RPS14蛋白的平均荧光强度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

若非特殊说明，以下实施例中所用试剂均可在商业途径购买获得。

实施例1肉鸡RPS14基因多克隆抗体制备

1、PET28a-RPS14重组表达载体的构建

1.1根据Genbank中报道的鸡源RPS14基因核苷酸序列通过生物信息学分析筛选出优质的核苷酸编码序列再设计并合成特异性引物，与模板进行相应的结合从而扩增RPS14基因。

特异性引物为：

F：5’-

R：5’-

所述特异性引物的上游引物5’端插入BamHI限制性内切酶，下游引物5’端插入HindIII限制性内切酶。

PCR的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火35s、72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

1.2采用TA克隆技术将目的片段插入到

1.3对所述重组克隆载体

1.4将所述重组表达质粒PET28a-RPS14转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，得到转化后的感受态细胞。

2、抗RPS14蛋白的获取

2.1在所述转化后的感受态细胞中加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃，220rpm/min的摇床上摇4h，将获得的蛋白进行15％的SDS-PAGE电泳，鉴定是否为所需目的蛋白。由图3A可知，在该条件下重组RPS14蛋白大量表达，且用白色箭头表示。

2.2将诱导表达后的RPS14蛋白进行表达形式鉴定，采用超声波破碎和离心的方法来分离其上清液和沉淀，由图3B-C所知，该重组蛋白以包涵体形式大量储存在在沉淀中，且对其溶解后上清液中可以获得相应大小(22kDa)的可溶蛋白。

2.3将溶解后的RPS14蛋白进行镍亲和柱纯化，选用500mM咪唑浓度的洗脱缓冲液进行洗脱纯化，经15％的SDS-PAGE电泳鉴定分析，保存纯化后的蛋白备用于透析和复性，由图3D所知，选用500mM咪唑浓度的洗脱缓冲液来洗脱蛋白，RPS14重组蛋白过镍亲和柱纯化后得到分子量为22kDa清晰单一的目的蛋白，这与预期大小相符合。

2.4将纯化后的蛋白进行透析复性，采用尿素梯度下降的趋势来透析目的蛋白，透析液置于4℃环境中每4h更换一次；再用PEG8000进行浓缩后用于兔子免疫。如图3E所示，电泳后的目的条带更加清晰单一且颜色也更深，说明其通过透析浓缩后该蛋白纯度和浓度都有所提升。

3、RPS14多克隆抗体的制备

将透析复性后的RPS14蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，对兔子进行皮下多点注射，每隔10天加强免疫一次(加强免疫要求RPS14蛋白与弗氏不完全佐剂混合)，免疫30天后取耳动脉血，离心获得免疫血清，得到RPS14多克隆抗体。

实施例2RPS14多克隆抗体的质量验证

2.1酶联免疫吸附试验

将纯化的重组RPS14蛋白作为抗原稀释至2.5μg/ml，涂在96孔板上(150μL/well)在37℃中孵化6小时。用PBS-T洗涤3次，在每孔中加入200μl的5％的脱脂奶粉封闭液，37℃孵化2小时，清洗后分别加入连续稀释(1:100-1:204800)的抗RPS14血清和具有相同稀释梯度的免疫前血清(100μL/well),37℃孵育1h清洗过后，加入按照1：3000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(120μL/well)孵化1小时，最后用PBS-T彻底清洗后加入可溶型单组分TMB底物溶液避光反应20min，用浓硫酸终止反应，在酶标仪中取450nm的吸光度值进行测量,进而计算RPS14多克隆抗体的实际效价。

由图4可知，前期实验表明，选用了2.5μg/ml的抗原包被浓度可以获得最佳的抗体效价，根据OD阳性/OD阴性≥2.1的计算公式可知，从不同的3只新西兰大白兔中提取的兔抗鸡RPS14的血清效价都高达1：204,800。

2.2 Western Blot检测

提取正常组和病理组肉鸡组织总蛋白后，将总蛋白进行15％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并以稳定表达的基因β-actin为内参照，通过湿转将电泳条带转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，在5％脱脂奶粉中室温封闭2小时，然后用抗RPS14血清(1：3000稀释)于摇床上4℃孵育过夜，用TBS-T洗涤3次(每次洗涤10min)，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1：1000稀释)在室温下孵育1小时，最后清洗3次，用高敏型ECL化学发光检测试剂盒进行蛋白条带显色，进而检测组织中该基因的蛋白水平。

由图5A-B可知，兔抗鸡RPS14阳性血清作为一抗可以与肉鸡五种组织(肺动脉、肝、肾、心和肺)中提取的总蛋白进行特异性结合。并运用统计学的方法分析可知在这五种组织中腹水组RPS14蛋白表达水平都呈现下降趋势，且腹水鸡肺动脉、肝、心和肺中RPS14蛋白的表达量以极显著的差异低于对照组(p≤0.01)。

同时，利用兔抗鸡RPS14阳性血清和免疫前血清作为一抗对原核表达的RPS14蛋白进行特异性检测，如图5C结果表明，免疫前血清无法与原核表达的RPS14蛋白结合，而兔抗鸡RPS14阳性血清孵育的PVDF膜则出现明显的蛋白表达，说明该多克隆抗体对RPS14蛋白具有明显的反应原性。

2.3间接免疫荧光技术

抗原修复后，将5μm左右厚的脱蜡载玻片在山羊血清中封闭30分钟。将载玻片分别与抗RPS14蛋白抗体(1：200稀释)和免疫前血清(1：200稀释)在4℃孵育过夜，用PBS-T洗涤3次(每次5min)，将载玻片与1:300稀释的Cy3 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)孵育液(Boster,Wuhan,China)室温避光孵育50min。用PBS-T清洗3次(每次5min)，滴加4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI；1:400dilution)后避光孵育10min，最后清洗3次后，用抗荧光淬灭封片剂封片，置于尼康倒置荧光显微镜下进行镜检定位。

如图6A-F，将PBS缓冲液、免疫前血清和兔抗鸡RPS14血清作为一抗与肉鸡、肉鸭、山羊、老鼠和兔子的相关组织(肺动脉、肝、肾、心和肺)进行孵育，可知与两种阴性对照相比，实验组表现出明亮的荧光信号，具有强阳性，说明该多克隆抗体可以特异性结合动物组织中的RPS14蛋白，且RPS14蛋白的表达主要集中于动物各种器官的细胞质部分。如图6G所知，对肉鸡正常组和腹水组的荧光强度进行统计分析，表明在肉鸡的相关组织中RPS14蛋白在正常组中的表达量以极显著的差异高于腹水组(p≤0.01)。如图6H、I所示，肉鸡RPS14基因与原鸡、鸭子RPS14基因的同源性比对都达到90％以上，与山羊、老鼠和兔子的同源性差异较大(处于80％-83％之间)，且肉鸡和肉鸭各种组织中RPS14的表达量明显高于山羊、老鼠和兔子(p≤0.01)，证明所制备的兔抗鸡RPS14蛋白多克隆抗体具有良好的特异性和灵敏度可用于研究肉鸡肺、心、肺动脉、肝和肾RPS14蛋白表达的定位。

2.4统计学处理

实验数据应用SPSS 18.0软件处理，计量资料以均数±标准差(M±SD)表示，方差分析进行组间比较，P<0.05表示差异显著性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。