检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及了中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法。适用于中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断、实验室检疫鉴定和流行病学调查。

背景技术

蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病毒引起的一种蜜蜂幼虫传染病。病死的蜜蜂幼虫呈囊状，囊中充满粒状水液。成年蜂受感染无明显症状，常能自愈。

美国学者White最早分别于1913和1917年提出囊状幼虫病是由滤过性病毒引起的。英国Bailey等于1964年观察到囊状幼虫病病毒粒子形态，该粒子具有传染性，定名为囊状幼虫病毒(Sacbrood bee virus，简称SBV)。在分类学上，该病原属于小核糖核酸病毒目(Picornavirales)，传染性软化病毒科(Iflaviridae)，传染性软化病毒属(Iflavirus)。病毒粒子无囊膜，为直径28-30纳米的正二十面体病毒粒子，沉降系数为160S，浮密度(CsCl)为1.35g/mL(pH7.0-9.0，<4.0时不稳定)。病毒粒子的三维结构已解析，最外面是衣壳，由三种结构蛋白VP1、VP2和VP3组成，中间是由VP4组成的无定形膜状物，与衣壳松散连接，最里面是病毒核酸。病毒基因组为正义单链RNA，长度约为8800bp。基因组编码一个大的多聚蛋白，其中3种结构蛋白位于其近5’端，非结构蛋白(解旋酶、蛋白酶和复制酶)位于其近3’端。多聚蛋白经体内加工会被切割成上述有功能的蛋白。基因组的两侧各存在一个非翻译区(UTRs)，5’末端与VPg蛋白共价连接，3’末端连有一个Poly(A)尾。

中华蜜蜂囊状幼虫病是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒引起的一种中华蜜蜂幼虫传染病。

1971年冬，广东省佛冈、从化、增城等地首先发生了中蜂囊状幼虫病毒病，次年全省流行，很快迅速蔓延到福建、江苏、江西、浙江、安徽、湖南、四川、青海、贵州等省，至2019年，已蔓延至全国的中蜂饲养区。病害在新区暴发时，传染速度极快，危害性很大，可造成30％-90％的蜂群损失。老病区病害虽已趋向平稳，但某些年份也会突然重新短暂的流行。近几年又有新的变异毒株出现，对中蜂饲养威胁很大。在印度、泰国和尼泊尔等国的东方蜜蜂中也发现了此病的蔓延。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒病的病原是中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbroodvirus，CSBV)。CSBV病毒结构主要参考SBV的相关研究。

每当气候变化大，温湿度不稳定，蜂群又处于繁殖期时容易发病。发病严重与否主要与气温有关。温度低，温差大，蜂群保温差，易发病，特别是早春寒流袭击后，病害发展更为迅速。春季摇蜜蜂群易受冻再加上机械损伤，常表现为每摇一次蜜，病害加重一次。

病害流行与食物也有关。病害的大暴发一般伴随着大流蜜期的到来而出现。在福建，季节上多见于清明后和冬初。温度不稳，而蜂群子脾大，一旦缺蜜，幼虫营养不足，质量下降，抵抗力也下降。流蜜盛期，气温晴暖，有时却病害大流行，主要原因是取蜜太频繁，群内蜜粉不足，幼虫缺食。

夏、秋季节，温度稳定，天气干燥，疾病自然好转。蜂王减少产卵，成年蜂与幼虫相比占比大。为了度夏，群内一般饲料较足，幼虫饲喂好，发育健壮，少量病虫很快被清除，残存于巢内的病毒在干燥的夏季迅速失去感染力。

与蜜蜂囊状幼虫病一样，病虫是主要传染源，通过工蜂的饲喂活动传播至健虫。早春和初冬，被侵染的工蜂则是传染源。传染经口进行，病毒随食物进入幼虫体内。

中华蜜蜂囊状幼虫病毒可导致6日龄大幼虫死亡。发病初期出现“花子”，接着在脾面上出现“尖头”，抽出后可见不明显的囊状。体色由珍珠白变黄，继而变褐色、黑褐色。封盖的病虫房盖下陷、穿孔。虫尸干后不翘，无臭，无黏性，易清除。

1985年，第30届国际养蜂大会就将蜜蜂几种幼虫期病虫害列为蜜蜂病虫害进行专题讨论，蜜蜂囊状幼虫病是其中一个重要的幼虫病害。但随后的一段时间，由于该病在我国发病较轻，对蜂业生产没有构成较大影响，所以在农业部1999年发布的第96号公告中，只将白垩病与美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病、蜜蜂孢子虫病、蜜蜂螨病和大蜂螨病一起列为二类动物疫病，中华蜜蜂囊状幼虫病未列其中。2005年5月24日，农业部第53号令公布的《动物病原微生物分类名录》中，一类动物病原微生物和二类动物病原微生物均不包括蜜蜂病病原微生物，仅将蜜蜂白垩病蜂球囊菌作为蜜蜂病病原微生物与美洲幼虫腐臭病幼虫杆菌、欧洲幼虫腐臭病蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂微孢子虫、跗腺螨、雅氏大蜂螨等一起共同列为三类动物病原微生物，蜜蜂囊状幼虫病也未列其中。

然而，近十年以来，中华蜜蜂囊状幼虫病已经成为威胁我国蜂业生产的重大疾病，尤其是对我国中华蜜蜂的影响十分严重。蜜蜂囊状幼虫病病害的检测目前主要有免疫荧光法，免疫组化技术，ELISA，细胞切片方法，核酸杂交技术，PCR技术，荧光定量PCR技术等，2017年国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会发布了《蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法》，尽管检测的灵敏性较好，但重复性较差极大限制了该检测方法的使用。所以有必要制定一个适用的集临床快速诊断与实验室检测相结合的方法，对其诊断方法予以规范和统一，满足生产单位、科研单位及主管部门快速、准确诊断该病，对有效防控中华蜜蜂囊状幼虫病的发生和发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速准确中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法。使中华蜜蜂囊状幼虫病在生产上得到有效控制，保障蜂产业的健康发展。

本发明提供了用于中华蜜蜂囊状幼虫病病原检测的引物及探针，以便该技术有效实施，快速推广。

本发明提供的用于中华蜜蜂囊状幼虫病检测的探针，即用于实时荧光PCR的方法检测囊状幼虫病毒(SBV)的TaqMan探针，其核苷酸序列为序列表中序列1。

本发明还提供一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组的试剂盒，包括所述的探针和核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对。

所述试剂盒中还包括2×Taq PCR Mastermix。

基于上述试剂盒，本发明还提供一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病的PCR扩增体系溶液，包括2×Premix Ex Taq 10μL、序列表中序列2的DNA片段4pmol、序列表中序列3的DNA片段4pmol、序列表中序列1所示的DNA片段6pmol。

所述PCR扩增体系溶液总体积为20μL，余量为无RNase水。使用时，添加2μL待测样品cDNA即可。

所述的检测中华蜜蜂囊状幼虫病的探针在制备检测中华蜜蜂囊状幼虫病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的试剂盒进行中华蜜蜂囊状幼虫病诊断时，是以疑似囊状幼虫病病虫的总RNA作为模板，用逆转录酶反转为cDNA，以此为模板加入上述引物及探针进行实时荧光PCR检测，若荧光信号在PCR过程中增强，即荧光信号随着反应循环数递增，则该病虫感染了囊状幼虫病。

本发明的方法与利用普通PCR检测法对囊状幼虫病进行检测进行比较，本发明的方法操作简单，整个检测过程实行自动化控制，只需在加样时打开一次盖子,其后的过程完全是闭管操作，消除了PCR假阳性污染的机会，无须PCR后处理，适合批量样品的检测，整个检测过程具有简单、快速、灵敏、准确的特点；本发明与行业标准《蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法》相比更易于重复，且灵敏度高。

利用本发明的试剂盒可以快速有效地对中华蜜蜂囊状幼虫病进行诊断，通过快速诊断可以有效控制疾病的传播和蔓延，可以取得较大的经济效；也将为今后研究病毒感染量与发病情况之间的关系提供方法；为预测囊状幼虫病的发生与发展提供依据；亦对蜂业生产过程中保障蜂产品安全做出贡献。

附图说明

图1为疑似囊状幼虫病样品的RT-PCR凝胶电泳检测，其中，1阳性对照；2阴性对照；3样品1；4样品2；

图2为426bp目标序列数据库库比对；

图3A为TaqMAN-qPCR引物特异性检测，1样品1；2阴性对照；3空白对照；

图3B为疑似囊状幼虫病样品的TaqMAN-qPCR扩增；

图4A为TaqMAN-qPCR目标序列数据库库比对；

图4B为TaqMAN-qPCR目标序列clustalX比对；

图5为引物/探针组合的TaqMAN-qPCR优化验证，用如下探针0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1μL分别配制反应体系；

图6A为SBV-cDNA标准曲线；

图6B为SBV-cDNA扩增曲线；

图7为蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法扩增曲线；

图8为TaqMAN-qPCR特异性检测。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒的设计、筛选及特异性检索验证

一、中华蜜蜂囊状幼虫病SBV序列的确定

(一)疑似囊状幼虫病样品(河北承德)总RNA的提取

1.液氮下充分研磨待检样品。

2.取0.1g充分研磨后的组织于1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol提取液，室温放置5min，使其充分裂解。

3.于12,000g离心5min，取上清。

4.加入200μL氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃，12,000g离心15min，取上层水相，转移至另一离心管。

5.按异丙醇：TRIzol＝1：2(v/v)的比例加入异丙醇混匀，室温放置5～10min。

6.在4℃条件下，12,000g离心10min，弃上清。

7.加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

8.在4℃条件下8,000g离心5min，弃上清。

9.室温晾干或真空干燥5-10min。

10.用50μL无RNase水，TE buffer或0.5％SDS溶液重悬RNA样品，贮存于-20℃备用。

(二)cDNA合成

1.在含有RNA的离心管中依次加入随机引物2μL，无RNase水12μL；轻微振荡，瞬时离心。

2.70℃10min，冰浴2min。

3.3,000g离心1min。

4.在超净台内，离心管中依次加入：5×反转录酶缓冲液4μL，dNTPs 1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，反转录酶0.5μL，瞬时离心。

5.42℃1h，70℃15min，冰浴3min，瞬时离心，产物为第一链cDNA，立即进行PCR扩增或-20℃保存备用。

(三)PCR扩增及电泳检测

上游引物：SBV-F:GGATGAAAGGAAATTACCAG

下游引物：SBV-R:CCACTAGGTGATCCACACT

1.利用反转录酶合成第一链cDNA并设计SBV的相应引物，进行PCR扩增。

2.反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs 1μL、DNA聚合酶0.5μL、引物SBV-F(10pmol/μL)1μL、引物SBV-R(10pmol/μL)1μL、cDNA 2μL、无RNase水17μL，总反应体系体积25μL。

3.反应条件为：94℃条件下3min变性反应；PCR反应，30个循环，循环条件为94℃30s，45℃40s，72℃40s；72℃条件下10min延长反应。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检查，当电泳产物出现与目标大小一致的唯一条带，则可判定感染囊状幼虫病毒阳性。

结果表明，PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳(图1)：以病虫cDNA为模板，引物SBV能扩增出约426bp的目的条带，而以无菌水作为模板的空白对照，PCR结果呈阴性。表明该疑似囊幼病样本能检测出SBV病毒存在，只需后续测序进一步确认该片段是否为SBV序列片段。测序结果表明所克隆的SBV片段长度为426bp(序列表中序列4)，将该序列与Genbank收录Sacbrood Virus全序列进行比对，证明该序列为SBV特有序列(图2)。

二、本发明TaqMan荧光定量PCR检测

(一)探针、引物设计及TaqMan-PCR检测

于NCBI中对SBV序列搜库；然后用MEGA软件对序列进行比对，找到保守序列；针对保守序列设计探针及引物。探针保守性最高以利于信号检测，根据探针设计原则其Tm值要高于引物10℃，探针应与其中一条引物临近并且将探针中极个别碱基的差异用了兼并碱基代替。

根据数据库的序列对比，设计兼并探针和引物。如序列表中序列1-3所示，兼并碱基在内部不影响酶切。

探针：5’Fam-CTGCGGTCTTAAYTGACACTGCRCGT-Tamra3’(序列表中序列1)，其中，Y＝C或T，R＝G或A。

上游引物：F1:5’-AGTGGACGAAGAATCTGGAA-3’(序列表中序列2)

下游引物：R1:5’-CCYTGCAACTGTAAGAGGTA-3’(序列表中序列3)，其中，Y＝C或T。

按照下述步骤进行TaqMan荧光定量PCR：

1.扩增体系:2×Premix Ex Taq 10μL、序列表中序列2的DNA片段(10pmol/μL)0.4μL、序列表中序列3的DNA片段(10pmol/μL)0.4μL、序列表中序列1所示的探针(10pmol/μL)0.6μL、cDNA 2μL、无RNase水6.6μL，封口,500g离心30s。

2.离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪内检测。

3.设置循环条件：变性95℃30s，1个循环；两步法PCR反应95℃5s，60℃30s，40个循环，收集荧光；冷却50℃30s 1个循环。

4.直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。阴性:无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；表示样品中无蜜蜂囊状幼虫病病毒。阳性:Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在蜜蜂囊状幼虫病毒。Ct值>30.0的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性。

qPCR的结果表明疑似样品Ct值都在12附近，后续测序结果也证明了qPCR检测结果的准确性。

针对于河北承德疑似囊状幼虫样本检测有荧光信号的增加，表现为阳性扩增，即该样本有SBV的感染。而对照组无荧光信号，检测结果为阴性，即未检测到SBV的存在。

(二)qPCR产物的测序及序列分析

将qPCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳(图3A),可见100bp左右的片段(序列表中序列5)，经测序及数据库比对证明了该片段与SBV的亲缘关系较近，达到95.00％-96.67％；利用clustalX软件对目标序列与测序所得序列进行比对，进一步证明了该测序序列确实为目标序列(图4A,图4B)，进一步证明了该发明的可行性。

(三)本发明探针浓度优化

步骤的目的是确定能获得最大△Rn值和最小CT值的最适探针浓度。探针浓度的大小，会影响△Rn值的高低。当探针浓度过小时，PCR产物过量，会干扰荧光的收集；探针过量时，无足够的PCR产物与探针结合，△Rn值降低。在20μL反应体系中分别加0.2、0.4、0.6、0.8、1μL探针(10pmol/μL)，以期找到适合该反应体系的探针的终浓度。

结果表明探针的添加量对反应效率影响不大，Ct值都接近12，因此选取了中间浓度，0.6μL的探针添加量用于TaqMan-qPCR反应(图5)。

实施例3、TaqMan荧光定量PCR方法检测SBV的检测限

获得蜜蜂囊状幼虫病的RNA，反转得cDNA，测得cDNA浓度为650ng/μL，根据拷贝数计算公式：(6.02×10

结果表明，当病样cDNA浓度为1.48×10

实施例4、本发明与已公布的行业标准《蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法》的比较

以反转后的cDNA为模板，分别利用本发明的方法和行业标准的方法进行检测。

行业标准检测方法如下：

上游引物F1(10pmol/μL)：5’-AAGTTGGAGGCGCGYATTTG-3’，

下游引物R1(10pmol/μL)：5’-CAAATGTCTTCTTACDAGAAGYAAGGATTG-3’，探针P1(5pmol/μL)：5’-FAM-CGGAGTGGAAAGAT-TAMRA-3’。

1.在PCR管中，依次加入10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs 1μL、DNA聚合酶0.5μL、引物F1 1μL、引物R1 1μL、探针1μL、cDNA 2μL、DEPC水16μL，500g离心30s。

2.离心后的PCR管放入荧光定量PCR仪内。

设置扩增条件为：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，55℃1min，40个循环，退火延伸。

结果显示，行业标准方法很难重复，未读取到荧光值(图7)；而本发明表现出良好的荧光反应，Ct值在12左右，特异性强，重复性好(图3B)。

实施例5、本发明的TaqMan-PCR的特异性验证

为了验证本发明所设计引物、探针的特异性，将分别患有蜜蜂残翅病毒(DeformedWi ng Vi rus,DWV)、以色列急性麻痹病毒样品(Israeli Acute Paralysis virus,IAPV)、囊状幼虫病毒(Sacbrood Virus,SBV)的三种样品以及健康蜜蜂样品采用Trizol法提取RNA,用反转录酶反转得到模板cDNA，利用本发明TaqMan荧光定量PCR检测。

按本发明建立的TaqMan-PCR检测体系对上述四种样品进行检测，仅SBV样品读取到荧光信号(Ct值11)，其他样品未读取到荧光值，说明本发明建立的检测方法有较强的特异性(图8)。

序列表

<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所

<120> 检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒

<130> WHOI210010

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)

<223> y=c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)

<223> r=g或a

<400> 1

ctgcggtctt aaytgacact gcrcgt 26

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

agtggacgaa gaatctggaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)

<223> y=c或t

<400> 3

ccytgcaact gtaagaggta 20

<210> 4

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggatgaaagg aaattaccag aaaaagtacg aaagtatggt ggaacccgag tgttttgtaa 60

ccctcctatc gattatattg tatcaatgag gcaatattat atgcactttg ttgctgcatt 120

tatggaacag cgttttaagc taatgcatgc agtgggaatt aatgttcaga gtacagagtg 180

gacgctttta gcttctaagt tgctagcgaa agggaataac atttgcacca ttgattattc 240

aaattttggt ccgggtttta atgctcaaat agcgaaagct gctatggaat taatggtgcg 300

gtggactatg gagcatgttg agggcgtaaa cgagatagag gcgtatactt tattacatga 360

gtgtttaaat tcggttcact tagtgtctaa tacgctgtac caacaaaagt gtggatcacc 420

tagtgg 426

<210> 5

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cgtcgggtcg ttagaccgca gaaggaacta tagtatggcg aaaagttatt acctcgtaca 60

gttgcaggga a 71