生物标志物在诊断系统性红斑狼疮中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种生物标志物，具体涉及生物标志物在诊断系统性红斑狼疮中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是风湿病的一类，也是女性中的常见疾病类型。SLE临床表现广谱，临床表型不均匀。虽然近二十年来SLE的治疗取得了许多进展，但其进展仍难以有效控制，许多患者的预后仍较差。既往研究发现SLE的病因是多因素的，内分泌、感染、遗传和免疫异常等原因和系统性红斑狼疮的发病有着较大关系。遗传因素、雌性激素和环境因素的相互作用下，会导致患者体内的T淋巴细胞数量减少、B细胞过度增生和自身产生大量抗体等情况，也会和其体内的自身抗原进行结合，形成免疫复合物，这些免疫复合物会沉积在患者的小血管、关节、皮肤和肾小球等部位，在补体细胞的参与之下则会导致患者出现组织坏死和急慢性炎症等症状，最终会导致患者出现淋巴细胞减少症、溶血性贫血和身体多个系统损害等症状，对患者的身体健康伤害也非常巨大。

SLE临床表现多样，多数呈隐匿发病，从首发症状出现到疾病得到诊断大约需要半年至4年不等的时间，特别在早期可与其他模拟疾病有许多相似的临床表现，容易导致误诊和漏诊，如果患者在病程中出现：(1)符合SLE诊断标准的临床症状出现；(2)非感染性发热；(3)白细胞减少，溶血性贫血，低不提血症；(4)多种自身抗体存在；(5)抗双链DNA(ds-DNA)阳性；(6)抗心磷脂抗体(ACL)阳性；(7)临床表现和自身抗体逐渐增多等，需要密切随访，判断是否为SLE。

为了提高SLE诊断的敏感性和特异性，SLE分类标准经历几次修订，从1982年美国风湿病学会(ACR)SLE分类标准到1997年ACR的SLE分类标准修订，但这些分类标准对SLE早期诊断的敏感性仍不理想。因此，发现可用于诊断该疾病的生物标志物，具有良好的临床意义及实用价值。

发明内容

针对目前现有技术存在的不足，本发明研究了系统性红斑狼疮中呈现差异表达的基因，从而为系统性红斑狼疮的诊断和治疗提供了检测和靶向位点，同时为揭示系统性红斑狼疮的发病机制提供了理论基础。

本发明一方面提供了一种诊断系统性红斑狼疮的产品，所述的产品包括检测KLHL2和/或MGAM的试剂。

所述的“KLHL2”，是指位于4号染色体，Gene ID为11275的基因。

所述的“MGAM”，是指位于7号染色体，Gene ID为8972的基因。

进一步，所述的产品包括检测KLHL2和MGAM的试剂。

进一步，所述的试剂包括检测mRNA表达量的试剂、检测蛋白表达量的试剂。

进一步，所述的试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或高通量测序平台检测KLHL2和/或MGAM的表达水平的试剂。

进一步，所述的试剂包括引物、探针或抗体。

术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(base pair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

本发明的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

本发明的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

与基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

术语“杂交”或“核酸杂交”或“杂交”通常指两个具有互补碱基序列，在适当条件下将形成热力学上稳定的双链结构的单链核酸分子的杂交。如本文所用的术语“杂交”可指在严格或非严格条件下的杂交。

在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片或试纸。

本发明的试剂盒包括检测KLHL2和/或MGAM的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测。试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

所述的芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

所述的试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测KLHL2和/或MGAM的转录水平。

本发明另一方面提供了检测KLHL2和/或MGAM的试剂在制备诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用。

进一步，所述的KLHL2和/或MGAM在系统性红斑狼疮患者中表达上调。

本发明另一方面提供了KLHL2和/或MGAM在构建预测系统性红斑狼疮的计算模型中的应用。

进一步，所述的系统包括用于输入KLHL2和/或MGAM的表达量的输入装置、用于输出系统性红斑狼疮诊断结果的输出装置。

进一步，所述的系统还包括计算装置，所述的计算装置包括存储器和处理器，所述的存储器中存储有计算机程序，所述的处理器被配置为执行所述的存储器中存储的计算机程序；计算装置用于根据上述的KLHL2和/或MGAM的表达量，分析出系统性红斑狼疮风险结果的可能性或预测出系统性红斑狼疮患者预后情况。

本发明另一方面提供了KLHL2和/或MGAM在制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物中的应用。

进一步，所述的药物组合物包括抑制KLHL2和/或MGAM表达的试剂。

进一步，所述的药物组合物还包括有效量的用于系统性红斑狼疮治疗的药物及药学上可接受的载体和/或辅料。

本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。

本文中使用的术语“药学上可接受载体和/或辅料”，是指这样的载体和/或辅料，其并不引起对生物体的显著刺激，并且并不废除所给予化合物的生物活性和性质。

进一步，所述的药物组合物与用于系统性红斑狼疮治疗的药物可以制备成单独的制剂联合应用，也可将两者制备成一种制剂以组合物的形式应用。

进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如此类的也可加入其中，适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人。

本文中使用的术语“赋形剂”，是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性成分的给予。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

本发明的所述的药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明另一方面一种筛选治疗系统性红斑狼疮的候选药物的方法，所述的方法包括：

(1)用待测试物质处理表达或含有KLHL2和/或MGAM的体系；

(2)检测所述体系中KLHL2和/或MGAM的表达；

(3)选择可降低KLHL2和/或MGAM表达水平的测试物质为候选药物。

进一步，所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

进一步，所述测试物质包括但不限于：针对上述的生物标志物或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本文中所使用的“生物标志物”及“标志物”可混用，以便于指称个体中正常或异常进展的指征或个体中疾病或其他状态的指征或表现这些的靶分子。更详细地，“生物标志物”及“标志物”为正常或异常，以及若是异常，则为与慢性或急性的特定生理学状态或进展的存在相关的解剖学、生理学、生物化学或分子学参数。生物标志物可通过包括实验室检测和医学成像的多种方法来进行检测及测定。

附图说明

图1显示KLHL2、MGAM差异表达的箱线图。

图2显示KLHL2在训练集中的ROC曲线图。

图3显示KLHL2在验证集中的ROC曲线图。

图4显示KLHL2+MGAM联合诊断系统性红斑狼疮的ROC曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。

实施例1与系统性红斑狼疮相关的生物标志物

1.数据检索

在GEO数据库中以“systemic lupus erythematosus”and“Homo sapiens”为关键词，检索系统性红斑狼疮的微阵列数据，纳入标准为：(a)比较SLE患者组和对照组两组之间的全基因组基因表达谱阵列或通过高通量下一代测序；(b)使用全血或外周血单核细胞(PBMC)的数据集均符合条件；(c)样本数目不少于20个；(d)这些数据库中应提供可用于重新分析的数据，例如处理过的数据或原始数据。不符合上述标准的微阵列被排除在外。在此标准下，最终获得四套数据。如下表-1所示。

表1、本研究纳入的基因表达谱

2.数据下载及预处理

从GEO数据库(GSE39088，GSE50772和GSE61635)下载原始数据，对其进行了归一化处理。然后通过Bioconductor(http://www.bioconductor.org)的“affy”包(版本1.58.0)进行数据的标准化和背景校正。最后，将探针水平数据转换成基因表达值。对于对应多个探针的基因，将平均表达值作为基因表达值。使用“sva”R包(版本3.28.0)中的ComBat函数消除了总共276个样品(包括180个SLE患者样品和96个对照样品)中批次之间的差异。所有的分析均在R软件(版本3.6.3)中进行。

3.差异表达分析

使用R软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为FDR<0.05。

4、多基因联合预测ROC曲线分析

使用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。

在判断单独指标的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析，选择约登指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值。AUC在0.5

在判断指标联合的诊断效能时，首先是对基因进行logistics回归，其中，自变量为对应的指标，因变量为患病情况，通过拟合出的回归曲线可以计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值即可得到预测结果。最佳概率划分阈值通过约登指数最大的一点确定。根据确定的概率划分阈值，可以计算得出每种联合方案在训练组和验证组的灵敏度、特异性。

5、结果

1)基因差异表达

KLHL2、MGAM在GEO数据库中差异表达情况见图1，差异具有统计学意义。

2)KLHL2的ROC曲线分析

KLHL2在训练集中的诊断效能数据参见表2和图2，KLHL2在验证集中的诊断效能数据参见表3和图3。

表2、KLHL2在训练集中的诊断效能

表3、KLHL2在验证集中的诊断效能

通过实验结果可知，KLHL2对于系统性红斑狼疮具有较好的诊断效果。

3)KLHL2+MGAM联合诊断的ROC曲线分析

KLHL2、MGAM基因在验证集中的AUC值参见表4，KLHL2+MGAM联合诊断的ROC曲线参见图4。

表4、基因在验证集中的AUC值

通过实验结果可知，KLHL2+MGAM组合对于系统性红斑狼疮的诊断效果好于单个标志物，具有更好的诊断效能。

以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。