一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法

技术领域

本发明涉及微生物制剂领域，具体的，涉及一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法。

背景技术

早在上世纪70年代，发达国家如欧美和日韩的研发人员开始研制新型的微生态制剂，用于部分或全部代替抗生素的使用，并希望提高人体免疫力，经过几十年的发展，已经在相关领域取得了一定的成果。改革开放以后，随着我国经济发展，人们对健康体系认识的不断加深，逐渐认识到乳酸菌微生态制剂在调节肠道菌群平衡和提高免疫力等方面有着巨大的优势。

但是由于乳酸菌抗逆性较差，即使菌体在不受损伤的前体下在室温放置也很容易死亡，从而导致乳酸菌微生态制剂产品货架期短，产品中的活菌数很容易降至较低水平，影响产品效果。现有的乳酸菌产品都是通过真空冷冻干燥处理所得。在生产过程中由于细胞内外环境差异，导致结晶速度不同，冰晶生成有差异，对细胞膜等结构有较大损伤，非常不利于产品货架期的稳定性。因此，急需开发一种使乳酸菌微生态制剂的在常温下长时间保存的技术。

现在提倡的技术是在产品生产时对乳酸菌进行包埋措施，以此降低外界环境对菌体的刺激，提升产品货架期稳定性。乳酸菌包埋法的原理是利用天然或者合成的大分子可食用材料，通过一定的技术手段，将乳酸菌包裹形成微囊结构，此技术要求包裹材料对乳酸菌没有不利影响，同时还要考虑产品的吸湿性，渗透性等。

目前，现有市面上的乳酸菌微生态制剂产品货架期稳定性较差，同时消费者在服用乳酸菌微生态制剂产品后，在通过胃液和胆汁消化后活菌数死亡率高。

发明内容

本发明提出一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法，解决了现有技术中稳定性差的问题。

本发明的技术方案如下：

一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法，包括以下步骤：

S1、将乳酸菌在发酵罐中进行高密度培养，使发酵液中的乳酸菌总数达到3.0×10

S2、将菌泥从发酵液中离心分离出，菌泥含水率为5％～50％；

S3、将菌泥和第一层包埋保护剂按照质量比1:(1～3)混合均匀，第一层包埋剂为含有5％～50％脱脂乳粉的第一层包埋保护剂；

S4、将菌泥和第二层包埋保护剂按照质量比为1：(1～3)与S3所得混合物混合均匀；

S5、将菌泥和第三层包埋保护剂按照质量比为1：(1～3)与S4所得混合物混合后乳化均匀，得S5乳化液；

S6、利用液氮滴冻技术将S5乳化液进行深冷造粒，使菌体瞬间进入休眠状态，得到S6深冷粒；

S7、将S6深冷粒干燥至含水量为3％～8％。

作为进一步的技术方案，所述第二层包埋保护剂包括以下重量组分：2％～20％海藻糖、0.5％～5％甘露醇、0.5％～5％水溶性维生素E、0.5％～5％谷氨酸钠、1％～10％β环糊精、1％～10％抗性糊精、0.1％～1％吐温80、其余组分为水。

作为进一步的技术方案，所述第三层包埋保护剂包括以下重量组分：0.4％～4％海藻酸钠、0.2％～2％阿拉伯胶、其余组分为水。

作为进一步的技术方案，所述深冷造粒在-200～-190℃的液氮中进行造粒，造粒至半径大小在0.2cm～2cm

作为进一步的技术方案，所述干燥为真空冷冻干燥，一次升华温度为2～10℃，真空度为0.01～0.05mbar，解析干燥温度为20～32℃，真空度为0.001～0.01mbar。

按照任意一项所述的一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法制备的乳酸菌在食品、保健品领域的应用。

本发明的工作原理及有益效果为：

1、本发明提出一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法，经过处理的乳酸菌高流动性，高分散特性和低吸湿性，货架期稳定，耐酸性强，延长了乳酸菌的保存期活性，并适用于多种产品的开发与使用。经过本发明多层包埋保护的乳酸菌比没有经过包埋的乳酸菌的稳定性、存活率优异很多，本发明的包埋步骤需分层依次进行包埋乳化，否则会降低菌体包埋率。

2、本发明中第一层包埋保护剂中的脱脂乳粉主要作用为冻干时做为冻干填充剂。将其作为第一层保护剂是为了使菌体分散均匀，便于后续包埋保护剂2和包埋保护剂3进行包埋。脱脂乳粉中的氨基酸和小分子肽可以进入细胞，对细胞内部起到保护作用，和包埋保护剂2、3协同作用提升菌体通过胃液和胆盐时的存活率。

3、本发明中，海藻糖和甘露醇保护菌体细胞膜，β环糊精和抗性糊精协同作用保护菌体细胞壁，提升菌体在真空冷冻干燥时的存活率，水溶性维生素E和谷氨酸钠提供菌体在真空冷冻干燥和常温存放时的抗氧化作用，与其他各组分协同作用提高乳酸菌微生态制剂产品货架期稳定性和通过胃液和胆盐时的存活率。

4、海藻酸钠分子链上有许多游离亲水性基团(羟基和羧基)，Ca

5、本发明的包埋方法具有生产工艺简单、能耗低、无三废、投资小、易于规模化生产的优势。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。

将乳酸菌在发酵罐中进行高密度培养的技术为现有技术中的常规手段，在此不做赘述。使用倾注平板法计统计存活数。

植物乳杆菌Lp45菌株三层包埋工艺：

实施例1

S1、按照现有工艺在发酵罐中对菌株进行高密度培养，使发酵液中的植物乳杆菌活菌数达到8.5×10

S2、于菌泥中按照1:3的质量比例加入包埋保护剂1，其中包埋保护剂1为5％脱脂乳粉、95％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S3、按照菌泥：保护剂2质量比为1:3的比例加入包埋保护剂2，其中包埋保护剂2为2％海藻糖、0.5％甘露醇、0.5％水溶性维生素E、0.5％谷氨酸钠、1％β环糊精、1％抗性糊精、0.1％吐温80、其余组分为水(质量比)利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S4、按照菌泥：保护剂3质量比为1:3的比例加入包埋保护剂3，其中，包埋保护剂3为0.4％海藻酸钠、0.2％阿拉伯胶、99.4％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀，菌泥和三层保护剂乳化完成后利用液氮滴冻技术将乳化液滴入零下190℃的液氮中进行深冷造粒，使菌体瞬间进入休眠状态，然后在冻干机进行真空冷冻干燥，一次升华温度设为10℃，真空度0.015mbar，解析干燥温度32℃，真空度0.005mbar，冻干至产品水分为4.5％后结束，即得成品。

成品菌粉活菌数为6.0×10

实施例2

S1、按照现有工艺在发酵罐中对菌株进行高密度培养，使发酵液中的植物乳杆菌活菌数达到8.5×10

S2、于菌泥中按照1:2的质量比例加入包埋保护剂1，其中包埋保护剂1为30％脱脂乳粉和70％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S3、按照菌泥：保护剂2质量比为1:2的比例加入包埋保护剂2，其中包埋保护剂2为10％海藻糖、3％甘露醇、3％水溶性维生素E、3％谷氨酸钠、6％β环糊精、6％抗性糊精、0.5％吐温80、其余组分为水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S4、按照菌泥：保护剂3质量比为1:2的比例加入包埋保护剂3，其中，包埋保护剂3为2％海藻酸钠、1％阿拉伯胶、97％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀，菌泥和三层保护剂乳化完成后利用液氮滴冻技术将乳化液滴入零下196℃的液氮中进行深冷造粒，使菌体瞬间进入休眠状态，然后在冻干机进行真空冷冻干燥，一次升华温度设为10℃，真空度0.015mbar，解析干燥温度32℃，真空度0.005mbar，冻干至产品水分为4.2％后结束，即得成品。

成品菌粉活菌数为6.5×10

实施例3

S1、按照现有工艺在发酵罐中对菌株进行高密度培养，使发酵液中的植物乳杆菌活菌数达到8.5×10

S2、于菌泥中按照1:1的质量比例加入包埋保护剂1，其中包埋保护剂1为50％脱脂乳粉和50％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S3、按照菌泥：保护剂2质量比为1:1的比例加入包埋保护剂2，其中包埋保护剂2为20％海藻糖、5％甘露醇、5％水溶性维生素E、5％谷氨酸钠、10％β环糊精、10％抗性糊精、1％吐温80、其余组分为水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S4、按照菌泥：保护剂3质量比为1:1的比例加入包埋保护剂3，其中，包埋保护剂3为4％海藻酸钠、2％阿拉伯胶、94％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀，菌泥和三层保护剂乳化完成后利用液氮滴冻技术将乳化液滴入零下200℃的液氮中进行深冷造粒，使菌体瞬间进入休眠状态，然后在冻干机进行真空冷冻干燥，一次升华温度设为10℃，真空度0.015mbar，解析干燥温度32℃，真空度0.005mbar，冻干至产品水分为4％后结束，即得成品。

成品菌粉活菌数为5.7×10

对比例1

将实施例2中的3％水溶性维生素E替换为水，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为2.9×10

对比例2

将实施例2中的6％抗性糊精替换为水，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为2.6×10

对比例3

去掉实施例2中的第三层包埋保护剂，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为1.1×10

对比例4

去掉实施例2中的阿拉伯胶，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为2.1×10

鼠李糖乳杆杆菌LR863菌株三层包埋工艺：

实施例4

S1、按照现有工艺在发酵罐中对菌株进行高密度培养，使发酵液中的植物乳杆菌活菌数达到1.0×10

S2、于菌泥中按照1:3的质量比例加入包埋保护剂1，其中包埋保护剂1为5％脱脂乳粉、95％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S3、按照菌泥：保护剂2质量比为1:3的比例加入包埋保护剂2，其中包埋保护剂2为2％海藻糖、0.5％甘露醇、0.5％水溶性维生素E、0.5％谷氨酸钠、1％β环糊精、1％抗性糊精、0.1％吐温80、其余组分为水(质量比)利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀；

S4、按照菌泥：保护剂3质量比为1:3的比例加入包埋保护剂3，其中，包埋保护剂3为0.4％海藻酸钠、0.2％阿拉伯胶、99.4％水(质量比)，利用均质机将上述菌泥和保护剂混合后的乳化液充分混匀，菌泥和三层保护剂乳化完成后利用液氮滴冻技术将乳化液滴入零下196℃的液氮中进行深冷造粒，使菌体瞬间进入休眠状态，然后在冻干机进行真空冷冻干燥，一次升华温度设为8℃，真空度0.01，解析干燥温度30℃，真空度0.008，冻干至产品水分为5.2％后结束，即得成品。

成品菌粉活菌数为5.0×10

对比例5

去掉实施例4中的第一层包埋剂，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为2.7×10

对比例6

将实施例4中的海藻酸钠替换为水，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为3.9×10

对比例7

将实施例4中的包埋保护剂3和包埋保护剂2互换顺序，其他操作相同。所得成品菌粉活菌数为9.2×10

对实施例和对比例以及原菌种进行人工加速实验。加速条件：温度37℃，相对湿度75％，存储时间56天，进行菌粉活菌数的检测，并计算存活率，存活率指存储一段时间后活菌数的检测值与起始值之比，用百分比表示。另一组为常温条件下存储时间56天，进行菌粉活菌数的检测，并计算存活率。

表1实施例和对比例不同温度56d存活率

将实施例和对比例经过模拟胃液1h测试后统计存活率，于含有胆盐的培养基中1h后统计存活率。

表2实施例和对比例不同培养基的存活率

对实施例和对比例的乳酸菌进行吸湿性试验，试验条件：将试验样品5g放置于直径为9cm的培养皿内，盖盖放置于温度30℃，相对湿度50％，恒温恒湿培养箱内12h，计算吸湿率，吸湿率为样品增重的质量/样品的原质量，用百分比表示，具体结果见表3。

表3实施例和对比例的吸湿率

将实施例2和对比例1、对比例2对比发现，当缺少维生素E或者缺少抗性糊精时，所得乳酸菌的存活率，稳定性都有所下降，吸湿率上升。对比例3只有两层包埋保护剂，制得的成品菌粉与本发明的实施例相比，存活率大幅下降，稳定性较差，吸湿率较高。对比例5中没有第一层包埋保护剂，得乳酸菌的存活率，稳定性都有所下降，吸湿率上升，脱脂乳粉中的氨基酸和小分子肽可以进入细胞，对细胞内部起到保护作用，和包埋保护剂2、3协同作用提升菌体通过胃液和胆盐时的存活率。对比例6中没有添加海藻酸钠，稳定性下降，海藻酸钠中的长链分子作为包埋保护剂壁材，将菌体、包埋保护剂1和2包裹在微囊中，提升菌体常温存放的稳定性。对比例7将二层和三层包埋保护剂的顺序互换，成品菌粉的稳定性也有所下降，只有将三层包埋保护剂按顺序依次进行包埋乳化时，对菌粉的保护效果才能达到最佳。可见，本发明的处理方法只有各组分复配协同作用才能起到最佳的稳定效果。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。