九氨胍及其制备方法和防治冠状病毒感染的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及防治冠状病毒感染的化学药物，具体地说 是九氨胍及其制备方法和防治冠状病毒感染的应用。

背景技术

冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界 广泛存在的一大类病毒。某些冠状病毒会感染人类和动物并引起特定疾病，例 如中东呼吸综合征(MERS)、严重急性呼吸综合征(SARS)或新型冠状病毒肺 炎(COVID-19)，有些冠状病毒传染性强，防治较难。

冠状病毒表面嵌合有S-蛋白，可以与宿主细胞表面的ACE2结合，使宿主细 胞启动胞饮过程从而侵入细胞，引起疾病。通过抑制胞饮过程，阻断病毒进入 细胞可有效防止病毒增殖，从而达到预防或治疗冠状病毒感染的目的。

目前全球流行的SARS-CoV-2仍缺乏有效的治疗药物，急需研发一种能有效 防治冠状病毒感染的药物。

发明内容

本发明的一个目的，是要提供一种化学药物九氨胍；

本发明的另外一个目的，是要提供上述九氨胍的一种制备方法；

本发明的还有一个目的，是要提供上述九氨胍在防治冠状病毒感染方面的 应用,九氨胍能够破坏或者干扰冠状病毒进入细胞的过程，从而抑制病毒进入细 胞，以达到特效防治冠状病毒感染的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

九氨胍，其化学名称为：2-氨基-N-(N-(N,N-二甲基氨基甲酰氨基)氨基 甲酰氨基)-5-胍基戊酰胺，分子式是C

英文名称为：2-amino-N-(N-(N,N-dimethylcarbamimidoyl)carbamimidoyl)-5-guanidinopentanamide。

本发明还提供了上述九氨胍的制备方法，包括依次进行的以下步骤：

I.精氨酸侧链氨基保护反应

取精氨酸溶于氢氧化钠溶液后加入四氢呋喃，所得精氨酸混合溶液中，滴 入BOC酸酐和四氢呋喃混合溶液，进行侧链氨基保护反应，萃取，干燥，得侧 链氨基保护产物。该精氨酸侧链氨基保护反应的化学反应式为：

II.缩合反应

取1,1-二甲基双胍盐酸盐溶于二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和侧链氨基保护产 物进行缩合反应，提纯后得中间产物。该缩合反应的化学反应式为：

III.精氨酸侧链氨基脱保护反应

取中间产物溶于三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)进行精氨酸侧链氨基 脱保护反应，浓缩回收溶剂，复溶后冷冻干燥，即得所述九氨胍。该反应的化 学反应式为：

作为本发明的一种限定，氢氧化钠溶液的质量浓度为5-7％；

精氨酸混合溶液中精氨酸与氢氧化钠溶液、四氢呋喃的重量体积比为2-3g：25-35mL：10-20mL；

BOC酸酐混合溶液中BOC酸酐和四氢呋喃的体积比为18-25：20-24；

步骤I中，所述萃取的溶剂为乙酸乙酯，其中，该步骤为精氨酸侧链氨基 的保护反应。

作为本发明的第二种限定，步骤I中，滴完BOC酸酐和四氢呋喃混合溶液 后，还需补加入水和四氢呋喃，补加的水和四氢呋喃的体积比为1：1；

作为本发明的第三种限定，步骤II中，1,1-二甲基双胍盐酸盐、二氯甲烷、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与侧链氨基保护 产物的重量体积比为7-10g：450-600mL：15-23g：5-12g：9-12g。

作为本发明的第四种限定，步骤II中，所述侧链氨基保护产物的加入方法 是，先加入40-60wt％所需侧链氨基保护产物反应16-24h，再加入剩余侧链氨 基保护产物反应16-24h。本步骤中侧链氨基保护产物是分次加入使反应有效进 行且提高收率。

作为本发明的再一种限定，步骤III中，中间产物、三氟乙酸和二氯甲烷 的重量体积比为2-3g：20-30mL：20-30mL。

作为本发明的还有一种限定，步骤III中，所述精氨酸侧链氨基脱保护反 应的时间为0.5-2h。

本发明还提供了上述九氨胍的应用，用作制备预防或治疗冠状病毒感染的 药物。

作为进一步限定，所述冠状病毒为SARS-CoV-2或其变异型；所述预防或治 疗冠状病毒感染的药物为片剂、胶囊或液体制剂。

九氨胍用作防治冠状病毒感染的药物时，剂量自50mg/次、每日一次开始， 逐渐加量至600-1000mg/d，或至患者出现药物副作用。治疗对象可以是患有冠 状病毒感染的病人、预防冠状病毒感染的人群，或者复发的患者；九氨胍可以 单独施用，还可以与其它药物合用，其可以任何方便的药物形式(如片剂、液 体制剂等)和途径(如口服、静脉，呼吸道吸入)给药，优选口服使用；对于 成年人，九氨胍的施用方式为初始剂量50mg，每日一次；每天增加一次剂量， 每次加倍；逐渐至有效剂量；每日最高1000毫克，或者加至患者出现药物副作 用。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在 于：

(1)本发明的九氨胍，能够破坏或者干扰新冠状病毒进入细胞的的胞饮过 程，从而抑制病毒进入细胞，实验证明九氨胍可以阻止病毒进入细胞使得本发 明能够确定新型治疗性应用，特别是在冠状病毒感染和冠状病毒肺炎治疗的领 域有良好效用；

(2)本发明的九氨胍适用于冠状病毒感染患者或待预防的患者，待预防的 患者可以是未感染过或经过治愈后复发的患者，用途广泛；

(3)本发明的制备方法，过程简单可靠，产出率高，可批量生产。

本发明的制备方法用于制备九氨胍，所制九氨胍能够作为药物用于预防和 治疗冠状病毒感染。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施 例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

实施例1一种的九氨胍的制备方法

本实施例包括依次进行的以下步骤：

I.精氨酸侧链氨基保护反应：

取3.8kg NaOH溶于60L水，制得质量浓度为6.3％的NaOH溶液(溶质体积 忽略不计)；

取5kg精氨酸溶于NaOH溶液，再加入30L四氢呋喃继续搅拌，得精氨酸混 合溶液；

取22 L Boc酸酐与20L四氢呋喃混匀，制得Boc酸酐混合溶液；

将Boc酸酐混合溶液缓慢滴加入精氨酸混合溶液，0.5h滴加完毕，继续补 加15L水和15L四氢呋喃，20℃反应10h后，升温至40℃保温反应12h；侧 链氨基保护反应完毕后，减压浓缩回收四氢呋喃，补加40L水，使用乙酸乙酯 萃取，所得乙酸乙酯相经干燥，得油状的侧链氨基保护产物，收率为85％。

II.缩合反应：取1,1-二甲基双胍盐酸盐0.828kg，溶于50L二氯甲烷， 加入1.92kgEDC·HCl、0.9kg DMAP和0.575kg侧链氨基保护产物，搅拌进行 缩合反应24h，再次添加0.575kg侧链氨基保护产物，搅拌进行缩合反应24h， 共计反应48h后，加入100L水洗一次，再用质量浓度1％的NaOH水溶液洗一次， 饱和食盐水水洗一次，干燥后减压回收二氯甲烷，得到的油状物加入足量的石 油醚打浆，有固体析出，减压抽滤，石油醚洗涤得白色固体状的中间产物，收 率为65％。

III.精氨酸侧链氨基脱保护反应：取0.5kg中间产物与5L三氟乙酸和5L 二氯甲烷室温搅拌反应1h，减压浓缩，回收溶剂，加入5L水复溶溶解，冷冻 干燥，即得到白色固态的九氨胍，标记为Y1，收率为43％。

所得九氨胍Y1的化学名称为：2-氨基-N-(N-(N，N-二甲基氨基甲酰氨基) 氨基甲酰氨基)-5-胍基戊酰胺，分子式是C

实施例2-6九氨胍的制备方法

本实施例分别为一种九氨胍的制备方法，它们的具体步骤与实施例1基本 相同，不同之处在于部分工艺参数及最终九氨胍(所制备的九氨胍依次标记为 Y2-Y6)的收率不同，具体不同的工艺参数见表1；

表1实施例2-6工艺参数

实施例7九氨胍抑制冠状病毒感染细胞实验

本实施例验证九氨胍Y1抑制冠状病毒感染细胞的效果。

(一)实验方案：利用S蛋白伪型包装的慢病毒LVX-luciferase-IRES-Puro感 染过量表达ACE2的293T单克隆细胞株，通过MTT法测定药物毒性和读取 luciferase荧光强度，用以判断九氨胍抑制冠状病毒感染细胞的效果。

(二)实验试剂盒及简介：SPIKEYTM新冠假病毒试剂盒(SPIKEY-ML)，购自 北京中吉当康基因技术有限公司。

SPIKEYTM系统主要包括：

A)包膜上嵌和有S蛋白的两种重组慢病毒假病毒，一种携带GFP和 puromycin抗性基因，用于细胞水平评估；另外一种携带luciferase和 puromycin抗性基因，既可用于细胞水平，也可用于动物模型评估。

B)过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株，用于慢病毒假病毒感染 筛选，通过计数GFP阳性抗性克隆数或读取luciferase荧光强度来评价感染 效率，进而初步确定药物有效性。

(三)实验步骤：

①细胞接种：接种人ACE2过度表达的293T细胞1.0E+04于96孔板中， 至过夜达到25％密度。

②药物提前处理：感染前1小时更换含polybrene(8ug/mL)培养基，同 时加入药物浓度为20Mm、10Mm、5Mm、2.5Mm、1.25Mm、0.625Mm、0.31Mm、0.156Mm 或0Mm的九氨胍Y1。

③假病毒感染：96孔板每孔加入层析纯化的高滴度Luc-pseudovirus 1 ul，16小时后更换含新鲜DMEM培养基。

④感染48小时后，每个药物浓度一半孔内更换新鲜DMEM培养基100ul 同时加入20μl CellTiter

(四)实验结果：

结果如表2所示，经计算，九氨胍Y1对ACE2-293T细胞的CC50(表示细 胞毒性，抑制50％细胞的药物浓度)值为2.5mM；其IC50(表示抑制病毒进入 细胞50％的药物浓度)为0.6mM；实验表明九氨胍能有效抑制新冠病毒进入细 胞；九氨胍Y1对于病毒感染细胞有明确的抑制作用。

表2不同浓度九氨胍Y1抑制冠状病毒感染细胞实验结果

实施例8九氨胍的抗SARS-CoV-2效果实验

本实施例用九氨胍Y1对SARS-CoV-2病毒进行实验，在国家BSL-3实验室 进行，在细胞水平评价九氨胍抗SARS-CoV-2效果。

一)实验材料：

受试药物：浓度为1M的九氨胍Y1。

细胞：VeroE6细胞，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存。

病毒：SARS-CoV-2，滴度为10

二)实验方法：

(a)无菌96孔培养板，每孔加入100μl浓度为4×10

(b)药物用DMEM培养基(含2％双抗)稀释到8mM，然后2倍系列稀释， 8mM，4mM，2mM，1mM，0.5mM，共5个稀释度。每个浓度4个复孔，每孔100μl， 然后每孔再加入等体积100TCID

(c)1h后，弃去96孔培养板中细胞培养液，加入上述混合液；

(d)同时设立细胞对照、病毒对照；

细胞对照：每孔200μl DMEM培养基(含2％双抗)加入至长成单层的Vero E6 细胞96孔培养板中，共4个复孔。

病毒对照：每孔100μl DMEM培养基(含2％双抗)，再加入等体积100TCID

(e)细胞37℃，5％CO

(f)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，细胞有CPE变化记为“+”，细 胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”。

(g)药物效果计算：

药物抑制病毒半数有效浓度为EC

其中，A:大于50％抑制率的百分数，B:小于50％抑制率的百分数，C:log(稀 释倍数)，D:log(小于50％抑制率所对应的药物浓度)，如药物无抑制病毒作用 将无法测得EC

四)、实验结果：

根据药物抑制病毒半数有效浓度EC

表1.药物抗SARS-CoV-2效果

“+”为细胞有CPE变化，“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。

结论：根据细胞水平的筛选结果，九氨胍的EC

另外，需要说明的是，九氨胍也可预防和治疗SARS-CoV-2的变异型冠状病 毒的感染。

需要注意，上述实施例，仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明所作 的其他形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员都可能利用上述技术内容作为 启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明权利要求 的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发 明权利要求保护的范围。