鉴别梭鲈种群的引物及其鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别鱼类种群的引物及其鉴别方法。

背景技术

梭鲈(Sander lucioperca)隶属于鲈形目(Perciformes)、鲈科(Percidae)、梭鲈属。其体肥肉厚、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，蛋白质和氨基酸含量较高，有“淡水鱼王”之称。梭鲈原分布于欧洲咸海、黑海、里海及波罗的海水系的河流、湖泊。由于自然扩散和人为移植，目前在欧洲大部分地区、中亚、北非以及我国新疆额尔齐斯河水系和黑龙江水系均有分布，已经成为欧洲和中亚国家重要的淡水增养殖对象。我国多个省、市也将梭鲈作为重要的名特优鱼种进行引进养殖。

黑龙江水系是东亚地区流域面积最大的水系。流经蒙古、俄罗斯以及中国的黑龙江省、内蒙古自治区，流域内降水量年分布极不均匀，且有长达4-6个月的冰封期。黑龙江最大的支流是松花江，其他主要支流有呼玛河、精奇里江(结雅河)、乌苏里江等。

目前，我国已经成功实现了梭鲈的人工繁殖，所用亲鱼多捕捞自额尔齐斯流域或黑龙江流域的河流、湖泊。据报道，梭鲈经由兴凯湖进入了黑龙江流域。目前，在乌苏里江、黑龙江以及鸭绿江均形成了梭鲈种群。梭鲈种源不清、种质混杂的问题利用形态特征难以解决，也不利于梭鲈人工繁殖、规模化制种、良种选育的开展，鉴定不同来源的梭鲈种群对于开展制种及选育具有重要意义。

发明内容

针对梭鲈种群种源不清、种质混杂的问题，本发明的目的是提供鉴别梭鲈种群的引物及其鉴别方法。

鉴别梭鲈种群的引物由HLJSL041和HLJSL073两组引物对组成；引物对HLJSL041的上游引物为5’-TGCCTAACACCTGAACACCA-3’，下游引物为5’-AAGGCAAACTGTGGGGTAGG-3’；引物对HLJSL073的上游引物为5’-AGAAATCGCCTCTGTGTTGT-3’，下游引物为5’-TTGCTGCTGTAACACTGTCA-3’。

鉴别梭鲈种群的鉴别方法：

一、提取基因组DNA；

二、采用HLJSL041和HLJSL073两组引物对对样品DNA进行SSR-PCR反应；

三、凝胶电泳，读取基因型数据，区分和鉴别黑龙江水系的梭鲈种群。

进一步的，采用无损伤方法采集提取样品基因组DNA，从样品个体可再生的鳍条组织剪取约0.1g，编号后放入75％酒精保存。

进一步的，提取DNA过程严格控制消化时间为30min。

本发明引物所扩增核心重复序列为(AGAT)

本发明从梭鲈的基因组序列中开发出特异的微卫星标记，能够鉴别和区分黑龙江水系的梭鲈种群，尤其能够将乌苏里江梭鲈种群从黑龙江黑河江段、鸭绿江以及额尔齐斯河流域等主要梭鲈种群中区分出来，为梭鲈的繁育配组提供参考。

本发明首次基于分子生物学技术建立的区分梭鲈种群的新方法，乌苏里江的梭鲈种群在特异标记为纯合个体，而黑龙江黑河江段群体和鸭绿江群体以杂合个体为主，且存在群体特异等位基因。本发明用于黑龙江水系主要梭鲈种群的鉴别，群体鉴定比例90％以上，排除比例96％以上。具有准确性高，技术重复性好，性价比高的优势，可以同时对大量样本进行检测，减少了梭鲈种质资源及群体评判的复杂性。

附图说明

图1是实施例1中HLJSL041引物对扩增图谱；

图2是实施例1中HLJSL073引物对扩增图谱；

图3是实施例1中基于引物对HLJSL041和HLJSL073扩增的基因型，用Strcuture2.3.4输出结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式鉴别梭鲈种群的鉴别方法：

一、提取基因组DNA；

二、采用HLJSL041和HLJSL073两组引物对对样品DNA进行SSR-PCR反应；

三、凝胶电泳，读取基因型数据，区分和鉴别黑龙江水系的梭鲈种群。

本实施方式SSR-PCR反应结束后用3730XL遗传分析仪(ABI)进行毛细管凝胶电泳，利用GeneMappre V4.1软件进行图像收集和数据分析，获得基因型数据。

本实施方式读取群体基因型数据后，可借助Structure2.3.4软件辅助对群体进行进一步的鉴别和区分。

引物对HLJSL041的上游引物为5’-TGCCTAACACCTGAACACCA-3’，下游引物为5’-AAGGCAAACTGTGGGGTAGG-3’；引物对HLJSL073的上游引物为5’-AGAAATCGCCTCTGTGTTGT-3’，下游引物为5’-TTGCTGCTGTAACACTGTCA-3’。HLJSL041上游引物的退火温度为59.16℃，GC含量为50％；HLJSL041下游引物的退火温度为59.89℃，GC含量为55％；HLJSL073上游引物的退火温度为57.45℃，GC含量为45％；HLJSL073下游引物的退火温度为57.68℃，GC含量为45％；两组引物的SSR-PCR反应退火温度均为58℃。

本实施方式所述基因型数据为：

乌苏里江梭鲈个体HLJSL041扩增图谱中为128/128bp纯合体、HLJ073扩增图谱中为103/103bp纯合体；

黑龙江黑河江段梭鲈个体HLJSL041扩增图谱中出现140bp的条带、HLJ073扩增图谱中出现107bp的条带；

鸭绿江梭鲈个体HLJSL041扩增图谱中出现144bp或132bp条带、HLJ073扩增图谱中出现137bp、132bp或120bp条带。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：引物对的正向引物的5’端标记蓝色荧光。其它步骤及参数与实施方式一相同。

实施例1

鉴别梭鲈种群的鉴别方法：

一、提取基因组DNA；

二、采用HLJSL041和HLJSL073两组引物对对样品DNA进行SSR-PCR反应；

三、凝胶电泳，读取基因型数据，区分和鉴别黑龙江水系的梭鲈种群；

步骤一采用无损伤方法采集提取样品基因组DNA，从样品个体可再生的鳍条组织剪取约0.1g，编号后放入75％酒精保存；

提取DNA过程严格控制消化时间为30min；

所述基因型数据为：乌苏里江梭鲈个体HLJSL041扩增图谱中为128/128bp纯合体、HLJ073扩增图谱中为103/103bp纯合体；黑龙江黑河江段梭鲈个体HLJSL041扩增图谱中出现140bp的条带、HLJ073扩增图谱中出现107bp的条带；鸭绿江梭鲈个体HLJSL041扩增图谱中出现144bp或132bp条带、HLJ073扩增图谱中出现137bp、132bp或120bp条带；

引物对的正向引物的5’端标记蓝色(FAM)荧光；

步骤二SSR-PCR反应退火温度均为58℃；

引物对HLJSL041的上游引物为5’-TGCCTAACACCTGAACACCA-3’，下游引物为5’-AAGGCAAACTGTGGGGTAGG-3’；引物对HLJSL073的上游引物为5’-AGAAATCGCCTCTGTGTTGT-3’，下游引物为5’-TTGCTGCTGTAACACTGTCA-3’。

从黑龙江水系收集梭鲈亲鱼并采集样本153尾，其中包括乌苏里江源头兴凯湖(XK)32尾、黑龙江黑河江段(HH)47尾、鸭绿江丹东江段(YJ)74尾。取样品基因组DNA，每个样品约0.1g加入200μL裂解液(0.5％十二烷基肌氨酸钠、200μg/mL蛋白酶K、10mmol/L EDTA(pH8.0))55℃温育30min，用酚、氯仿、异戊醇混合液(25:24:1)抽提一次，加入2倍预冷无水乙醇沉淀24h，12500r/min离心15min，70％乙醇洗一次，室温晾干后加100μL 0.1×TE溶解。用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μL。在本发明两组引物对的正向引物的5′端标记蓝色(FAM)荧光，建立15μL PCR扩增反应体系(包括2×PCR MIX 7.5μL；上、下游引物(10μmol/L)各0.3μL；DNA模板1μL；ddH

读取个体基因型数据，HLJSL041中128/128bp的纯合个体38个，其中32尾来源于乌苏里江，4尾来源于黑河江段，2尾来源于鸭绿江；HLJSL073中103/103bp纯合个体32尾，来源于乌苏里江群体，两个特异标记组合扩增出目标片段的纯合个体均来源于乌苏里江梭鲈种群，鉴别比例为100％，排除比例100％。HLJSL041扩增图谱中含有140bp的个体40尾，38尾来源于黑河江段群体，2尾来源于鸭绿江群体；HLJ073扩增图谱中107bp的个体22尾，全部来源于黑河江段群体，两个标记组合，能够鉴定出黑河江段群体中91.49％的个体，排除比例98.11％。HLJSL041扩增图谱中144bp或132bp的个体61尾，其中60尾来自鸭绿江，1尾来自黑河江段；HLJ073扩增图谱中137bp、132bp或120bp的个体62尾，其中60尾来源于鸭绿江，2尾来源于黑河江段，两个标记组合，能够鉴定出鸭绿江群体中97.30％的个体，排除比例96.20％(如图1和图2所示)。进一步用Structure软件进行分析，在k＝3时，用HLJSL041和HLJSL073两组引物对能够将3个梭鲈群体区分开来，黑河群体和鸭绿江群体有少量混杂个体(如图3所示)。

实施例2

采用与实施例1相同的方法对采集自乌苏里江抚远江段(XK)37尾、黑龙江黑河江段(HH)40尾和鸭绿江丹东江段(YJ)40尾的梭鲈样本共117尾进行鉴别。

实验结果：

HLJSL041中128/128bp的纯合个体41个，其中37尾来源于乌苏里江抚远江段，4尾来源于黑龙江黑河江段；HLJSL073中103/103bp纯合个体37尾，其中37尾来源于乌苏里江抚远江段，两组引物对组合扩增出目标片段的纯合个体37尾，全部来源于乌苏里江梭鲈种群，本发明方法对于黑龙江水系的乌苏里江梭鲈的鉴别比例为100％，排除比例100％。

HLJSL041扩增图谱中含有140bp的个体33尾，31尾来源于黑龙江黑河江段群体，2尾来源于鸭绿江群体，HLJ073扩增图谱中107bp的个体17尾，全部来源于黑河江段群体，两组引物对组合，本发明方法能够鉴定出黑龙江水系黑河江段群体中90.00％的个体；排除比例97.40％。

HLJSL041扩增图谱中144bp或132bp的个体36尾，其中35尾来自鸭绿江，1尾来自黑河江段；HLJ073扩增图谱中137bp、132bp或120bp的个体38尾，其中36尾来源于鸭绿江，2尾来源于黑河江段；两组引物对组合，能够鉴定出黑龙江水洗鸭绿江群体中100.00％的个体，排除比例97.40％。

进一步用Structure软件进行分析，在k＝3时，用本发明两组引物对能够将3个梭鲈群体区分开来，黑河群体和鸭绿江群体有少量混杂个体。