一种总同型半胱氨酸测试卡

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种总同型半胱氨酸测试卡。

背景技术

同型半胱氨酸(HCY)是一种含硫4碳α-氨基酸，来源于食物中的甲硫氨酸和半胱氨酸代谢产生的中间产物，其本身不参与蛋白质的合成。甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化下与ATP结合形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM在甲基转移酶的作用下供出甲基后，变成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH水解形成同型半胱氨酸和腺苷。

正常情况下同型半胱氨酸主要经过再甲基化途径和转硫基途径代谢，可释放到细胞外。再甲基化途径：在甲硫氨酸合成酶的作用下，以维生素B12为辅酶，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，同型半胱氨酸获得甲基再形成甲硫氨酸，同型半胱氨酸的再甲基化途径在肝细胞内进行；脱转硫基途径：在胱硫醚-β-合成酶的作用下，以维生素B6为辅酶，同型半胱氨酸和丝氨酸合成胱硫醚，后者在胱硫醚-γ-裂解酶作用下分解为半胱氨酸和α-酮丁酸，α-酮丁酸进一步代谢生产葡萄糖。同型半胱氨酸的两种代谢途径各占50％左右，同型半胱氨酸的代谢受甲硫氨酸浓度、关键酶的活性及一些辅酶因子等因素的影响。

因同型半胱氨酸中的游离巯基具有高度活性，极易与含巯基蛋白或氨基酸形成二硫键。血液中同型半胱氨酸主要以三种形式存在：约70％-80％的同型半胱氨酸以二硫键与血浆蛋白结合，白蛋白是同型半胱氨酸的主要载体，其余的则主要以二硫同型半胱氨酸和以二硫键结合的同型半胱氨酸-胱氨酸化合物形式存在，只有约1％的同型半胱氨酸呈游离状态。血浆中结合形式和游离形式的同型半胱氨酸统称总同型半胱氨酸(tHCY)，tHCY水平代表这细胞内HCY的代谢状态。正常人血液中tHCY水平很低，成人空腹血浆tHCY参考值一般在5～15μmol/L。

酶功能障碍、维生素的缺乏、肾功能不全、肝病、糖尿病、系统性红斑狼疮、甲状腺功能低下、恶性肿瘤、恶性贫血、银翘病、器官移植、药物、肥胖症、吸烟等均可导致tHCY的升高。血浆高HCY水平是诱发心血管病及其他动脉粥样硬化性血管疾病等的重要危险因子。

目前检测总同型半胱氨酸的方法有很多，包括高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、化学发光法、生化法，其中临床应用最广泛的为生化法(水解酶循环法和胱硫醚循环法)。这些方法中或需要借助价格昂贵的大型仪器进行检测如高效液相色谱法(需借助液相色谱仪)、化学发光法(需借助自动化学发光分析仪)、生化法(需借助自动生化分析仪)，或操作复杂繁琐如酶联免疫吸附法，以上方法均不能满足基层医院检验场所对快速便捷检测的需求。

为了解决基层医院检验场所对快速便捷检测的需求，公开了以下方法：一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸及其制备方法(专利申请号CN201410103865.0)；一种用于同型半胱氨酸检测的电化学传感器的制备方法(专利申请号CN201510802844.2)；一种快速检测同型半胱氨酸的电化学方法(专利申请号CN201911315069.2)；一种同型半胱氨酸干化学法检测试纸条及其制备方法(专利申请号CN200810113922.8)。这些检测方法具有结构简单、操作方便的特点，但上述方法未见对结合性HCY进行解离的反应步骤或结构，只能检测血液样本中游离的HCY的含量，而不能检测tHCY含量，因游离的HCY只占tHCY的1％，这导致其缺乏临床敏感性，因此无法应用到临床诊断中。

另外，中国国家知识产权局网站上还公开了一种干式同型半胱氨酸测试卡及其应用(专利申请号CN202010147017.5)，该检测方法通过对样本进行预处理即样本经过解离液解离为游离HCY，然后将解离后样本加样检测，解决了现有快速检测技术不能检测tHCY的技术问题。其检测原理为：解离剂解离结合型HCY成游离HCY后，游离HCY参与酶循环反应最终产生过氧化氢，在过氧化物酶的催化下，Trinder’s发色底物被过氧化氢氧化显示颜色变化。我们研究发现，解离剂除了可以还原结合型HCY生成游离HCY以外，还具有还原过氧化氢的作用，这导致过量的解离剂降低了产物过氧化氢的浓度，使得检测结果不可靠且分析灵敏度低。另外，解离液解离结合型HCY的速率受到温度、时间的影响较大，需要在特定温度固定时间内对样本进行预处理，这增加了用户操作的麻烦，客户体验变差。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术所存在的不足之处，提供一种不需要用户进行样本预处理步骤、且能消除过量的解离剂对过氧化氢产物的影响,可检测人体血液或尿液样本中总同型半胱氨酸的测试卡。

本发明采用的技术方案为：一种总同型半胱氨酸测试卡，包括上盖、底座和总同型半胱氨酸检测试纸，其中，上盖设有一个加样孔，底座设有一个检测孔，总同型半胱氨酸检测试纸由从上往下依次层叠的过滤层、还原层、滤血层、氧化层和反应层组成；

还原层经过含有二硫键还原剂的还原层处理液浸泡并干燥处理，用于断开同型半胱氨酸与蛋白之间的二硫键；

氧化层经过含有二硫化物和磷酸盐的氧化层处理液浸泡并干燥处理，用于氧化去除多余的二硫键还原剂，降低二硫键还原剂对目标产物的还原作用；

反应层经过反应层处理液浸泡并干燥处理。

进一步地，过滤层、还原层、滤血层、氧化层和反应层通过PET双面胶粘接在一起。

优选地，滤血层长度小于还原层长度与氧化层长度，滤血层两侧都设有PET双面胶，PET双面胶将上层的还原层与下层的氧化层粘接在一起，使滤血层处于还原层、氧化层和滤血层两侧PET双面胶形成的空间内；过滤层长度大于还原层长度，反应层长度大于氧化层长度，过滤层与反应层分别都与滤血层两侧PET双面胶粘接。

进一步地，总同型半胱氨酸检测试纸的组装方法，包括以下步骤：

(1)将滤血层与两侧PET双面胶的横切侧面粘贴在一起称为滤血层/PET双面胶中间体；

(2)将还原层粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的上侧，保持还原层的两端各露出相同宽度的PET双面胶；

(3)将过滤层延伸出还原层的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体上侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起；

(4)将氧化层粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的下侧，保持氧化层的两端各露出相同宽度的PET双面胶；

(5)将反应层延伸出氧化层的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体下侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起，完成组装。

进一步地，总同型半胱氨酸测试卡的组装方法，包括以下步骤：将总同型半胱氨酸检测试纸裁切成适合的尺寸，再将总同型半胱氨酸检测试纸有过滤层的一面朝上放置于底座内总同型半胱氨酸检测试纸固定处，盖上上盖，完成组装。

优选地，过滤层为纱网，纱网的网孔密度为100-1000目；还原层为棉纤维，厚度为500-2000μm；滤血层为多孔聚酯纤维、棉纤维或无纺布；氧化层为多孔膜，孔径为0.2-1.0μm、厚度为100-400μm；反应层为多孔膜，孔径为0.45-2μm、厚度为100-400μm。

优选地，还原层处理液包括缓冲液、二硫键还原剂、丝氨酸；缓冲液为pH值7.5-9.8、浓度10-200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2吗啉代乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸中的一种或者多种；二硫键还原剂为浓度0.1-3mmol/L的三(2-羟基乙基)膦盐酸盐，优选为0.5-1mmol/L；丝氨酸的浓度为0.05g/L～0.5g/L。

优选地，氧化层处理液包括磷酸盐缓冲液、二硫化物和表面活性剂；二硫化物为浓度0.1-3mmol/L的二硫代二吡啶，优选为0.5-1mmol/L。

优选地，反应层处理液包括缓冲液、胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-β裂解酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、辅酶、4-氨基安替比林、发色底物、保护剂、表面活性剂；其中，缓冲液为pH值7.0-9.0、浓度10-200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2吗啉代乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸中的一种或者多种；胱硫醚-β-合成酶的浓度为50-1000KU/L；胱硫醚-β-裂解酶的浓度为50-1000KU/L；丙酮酸氧化酶的浓度为100-1000KU/L；过氧化物酶的浓度为200-2000KU/L；辅酶为浓度0.5-10mmol/L的氯化镁、硫酸镁、醋酸镁中的一种或几种；4-氨基安替比林的浓度为2-50g/L；发色底物为Trinder’s发色底物中的一种，优选为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐，溶液中Trinder’s发色底物的浓度为2-50g/L；保护剂为浓度10-100g/L的蔗糖、海藻糖、聚乙烯醇中的一种或几种；表面活性剂为浓度0.5-10g/L的吐温20。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：样本中结合型的同型半胱氨酸(HCY)被解离层中的还原剂TCEP还原为游离HCY，当还原后样本渗滤到滤血层时，样本中的红细胞被滤血层捕获并滞留在滤血层；经过氧化层时，多余的还原剂TCEP被氧化层中的氧化剂氧化去除；样本继续下渗到反应层时，游离HCY在胱硫醚-β-合成酶作用下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚，L-胱硫醚在胱硫醚-β-裂解酶作用下生成HCY、丙酮酸和氨，生成的HCY会促使上述反应往复循环下去，生成的丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下生成乙酰磷酸、过氧化氢和二氧化碳；显色底物在过氧化物酶催化下与过氧化氢发生反应产生颜色变化，通过检测孔检测显色区域的颜色变化量来定量检测tHCY。另外，本发明的总同型半胱氨酸测试卡适用于测定人血液或尿液样本中总同型半胱氨酸的含量。

附图说明

图1为本发明实施方式中的总同型半胱氨酸测试卡结构示意图；

图2为本发明实施方式中的总同型半胱氨酸检测试纸结构示意图；

图3为本发明串联质谱法与实施例1中总同型半胱氨酸测试卡的相关性图；

图4为本发明串联质谱法与实施例2中总同型半胱氨酸测试卡的相关性图；

图5为本发明串联质谱法与实施例3中总同型半胱氨酸测试卡的相关性图；

其中，100、总同型半胱氨酸检测试纸，101、过滤层、102、还原层，103、滤血层，104、氧化层，105、反应层，106、PET双面胶，200、上盖，201、加样孔，300、底座，301、检测孔。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

如图1和图2所示，总同型半胱氨酸测试卡，包括上盖200、底座300和总同型半胱氨酸检测试纸100，其中，上盖200设有一个加样孔201，底座300设有一个检测孔301，总同型半胱氨酸检测试纸100由从上往下依次层叠的过滤层101、还原层102、滤血层103、氧化层104和反应层105组成；滤血层103长度小于还原层102长度与氧化层104长度，滤血层103两侧都设有PET双面胶106，PET双面胶106将上层的还原层102与下层的氧化层104粘接在一起，使滤血层103处于还原层102、氧化层104和滤血层103两侧PET双面胶106形成的空间内；过滤层101长度大于还原层102长度，反应层105长度大于氧化层104长度，过滤层101与反应层105分别都与两侧PET双面胶106粘接。

总同型半胱氨酸检测试纸100的组装方法，包括以下步骤：

(1)将滤血层103与两侧PET双面胶106的横切侧面粘贴在一起称为滤血层/PET双面胶中间体；

(2)将还原层102粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的上侧，保持还原层102的两端各露出相同宽度的PET双面胶106；

(3)将过滤层101延伸出还原层102的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体上侧裸露的PET双面胶106两端粘贴在一起；

(4)将氧化层104粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的下侧，保持氧化层104的两端各露出相同宽度的PET双面胶106；

(5)将反应层105延伸出氧化层104的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体下侧裸露的PET双面胶106两端粘贴在一起，完成组装。

总同型半胱氨酸测试卡的组装方法，包括以下步骤：将总同型半胱氨酸检测试纸100裁切成适合的尺寸，再将总同型半胱氨酸检测试纸100有过滤层101的一面朝上放置于底座300内总同型半胱氨酸检测试纸100固定处，盖上上盖200，完成组装。

实施例1

本实施例提供了一种总同型半胱氨酸测试卡的制备方法，按照下述方法制备而成。

(1)还原层的制备：

还原处理液的配制：

扩散层处理：将棉纤维(Ahlstrom，型号601)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥2小时，取出备用。

(2)氧化层制备：

氧化层处理液的配制：

截留层处理：将膜聚醚砜多孔膜(赛多利斯，货号15400)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥1小时，取出备用。

(3)反应层制备：

反应层处理液的配制：

反应层处理：将PVDF多孔膜(Pall货号66543)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥1小时，取出备用。

(4)装配：

将过滤层(上海上筛丝网：高张力丝印网纱SS-PET165/25)裁切成10mm×200mm；

将还原层裁切成8mm×200mm；

将滤血层裁切成4mm×200mm；

将氧化层裁切成6mm×200mm；

将反应层裁切成8mm×200mm；

按照图2所示的总同型半胱氨酸检测试纸100结构示意图，将滤血层103放置在两个PET双面胶106中间的空隙内，称为滤血层/PET双面胶中间体；然后将还原层102粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的上侧，保持还原层102的两端各露出相同宽度的PET双面胶；将过滤层101延伸出还原层102的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体上侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起；将氧化层104粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的下侧，保持氧化层104的两端各露出相同宽度的PET双面胶；将反应层105延伸出氧化层104的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体下侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起，完成总同型半胱氨酸检测试纸100组装。按照图1所示的总同型半胱氨酸测试卡结构示意图，将总同型半胱氨酸检测试纸100裁切成适合的尺寸，再将总同型半胱氨酸检测试纸100有过滤层101的一面朝上放置于底座300内总同型半胱氨酸检测试纸100固定处，盖上上盖200，完成总同型半胱氨酸测试卡组装。

实施例2

本实施例提供了一种总同型半胱氨酸测试卡的制备方法，按照下述方法制备而成。

(1)还原层的制备：

还原处理液的配制：

扩散层处理：将棉纤维(Ahlstrom，型号601)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥2小时，取出备用。

(2)氧化层制备：

氧化层处理液的配制：

截留层处理：将膜聚醚砜多孔膜(赛多利斯，货号15400)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥1小时，取出备用。

(3)反应层制备：

反应层处理液的配制：

反应层处理：将PVDF多孔膜(Pall货号66543)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥1小时，取出备用。

(4)装配：

将过滤层(上海上筛丝网：高张力丝印网纱SS-PET165/25)裁切成10mm×200mm；

将还原层裁切成8mm×200mm；

将滤血层裁切成4mm×200mm；

将氧化层裁切成6mm×200mm；

将反应层裁切成8mm×200mm；

按照图2所示的总同型半胱氨酸检测试纸100结构示意图，将滤血层103放置在两个PET双面胶106中间的空隙内，称为滤血层/PET双面胶中间体；然后将还原层102粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的上侧，保持还原层102的两端各露出相同宽度的PET双面胶；将过滤层101延伸出还原层102的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体上侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起；将氧化层104粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的下侧，保持氧化层104的两端各露出相同宽度的PET双面胶；将反应层105延伸出氧化层104的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体下侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起，完成总同型半胱氨酸检测试纸100组装。按照图1所示的总同型半胱氨酸测试卡结构示意图，将总同型半胱氨酸检测试纸100裁切成适合的尺寸，再将总同型半胱氨酸检测试纸100有过滤层101的一面朝上放置于底座300内总同型半胱氨酸检测试纸100固定处，盖上上盖200，完成总同型半胱氨酸测试卡组装。

实施例3

本实施例提供了一种总同型半胱氨酸测试卡的制备方法，按照下述方法制备而成。

(1)还原层的制备：

还原处理液的配制：

扩散层处理：将棉纤维(Ahlstrom，型号601)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥2小时，取出备用。

(2)氧化层制备：

氧化层处理液的配制：

截留层处理：将膜聚醚砜多孔膜(赛多利斯，货号15400)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥1小时，取出备用。

(3)反应层制备：

反应层处理液的配制：

反应层处理：将PVDF多孔膜(Pall货号66543)裁切成100mm×200mm，放入上述处理液中浸泡5分钟，取出，沥干残余液体，水平放置于烘箱中45℃干燥1小时，取出备用。

(4)装配：

将过滤层(上海上筛丝网：高张力丝印网纱SS-PET165/25)裁切成10mm×200mm；

将还原层裁切成8mm×200mm；

将滤血层裁切成4mm×200mm；

将氧化层裁切成6mm×200mm；

将反应层裁切成8mm×200mm；

按照图2所示的总同型半胱氨酸检测试纸100结构示意图，将滤血层103放置在两个PET双面胶106中间的空隙内，称为滤血层/PET双面胶中间体；然后将还原层102粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的上侧，保持还原层102的两端各露出相同宽度的PET双面胶；将过滤层101延伸出还原层102的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体上侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起；将氧化层104粘贴在上述滤血层/PET双面胶中间体的下侧，保持氧化层104的两端各露出相同宽度的PET双面胶；将反应层105延伸出氧化层104的两端，与上述滤血层/PET双面胶中间体下侧裸露的PET双面胶两端粘贴在一起，完成总同型半胱氨酸检测试纸100组装。按照图1所示的总同型半胱氨酸测试卡结构示意图，将总同型半胱氨酸检测试纸100裁切成适合的尺寸，再将总同型半胱氨酸检测试纸100有过滤层101的一面朝上放置于底座300内总同型半胱氨酸检测试纸100固定处，盖上上盖200，完成总同型半胱氨酸测试卡组装。

测试例1

本测试例提供了总同型半胱氨酸测试卡的性能测试结果。

取116份临床样本，分别通过串联质谱法和本发明实施例1、实施例2和实施例3总同型半胱氨酸测试卡进行测试，结果见图3、图4、图5。实施例1无二硫键还原剂和二硫化物，样本相关系数R2为0.052，结果无统计学相关性；实施例2有二硫键还原剂，但无二硫化物对还原剂进行消除，样本相关系数R2为0.830，结果有统计学相关性，但相关性较差；实施例3有二硫键还原剂，且氧化层加入了二硫化物，样本相关系数R2为0.993，相关性较好。

通过上述实施例可知，本申请的测试卡可以实现对人体血液中总同型半胱氨酸的检测。

以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体方法允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。