月见草素B作为SIRT3激活剂在制备抗皮肤光损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及月见草素B作为SIRT3激活剂在制备抗皮肤光损伤药物中的用途。更具体地，涉及月见草素B在肠-皮肤细胞共培养体系中通过激活SIRT3来抑制氧化应激以对抗皮肤光损伤的用途。

背景技术

近年来，光线相关皮肤疾病的发病率呈现逐年增高的趋势，长久暴露于日晒中，特别是日光中的紫外线B(UVB)可诱发其特定靶细胞的皮肤角质细胞内活性氧(ROS)的蓄积，诱发细胞氧化损伤，造成皮肤损伤并可诱发皮肤癌。皮肤和肠道作为人体内、外表面的免疫屏障，具有类似的信号转导和神经支配通路，两者之间关系密切。皮肤是人体最大的器官，直接暴露于多种外界环境因素，引起自身损伤。肠道吸收异常会引发皮肤病，如肠病性肢端皮炎、皮肤过敏、银屑病等，而患有这些皮肤病的同时肠道也会表现出腹胀、腹泻、大便粘稠等症状。

Caco-2细胞来源于人结肠腺肿瘤，可以在体外培养条件下自发分化形成连续单层的肠上皮样细胞，与肠道上皮细胞在形态学和生理功能上具有相似性，已被应用于大量的口服药物的筛选以及药物的转运吸收研究；SIRT3是sirtuin家族中的一员，主要位于线粒体中，可以发挥去乙酰化活性调节线粒体的功能、再生和动态，从而维持氧化还原稳态，以防止细胞代谢过程中发生的氧化应激。

月见草素B(Oenothein B，OEB)是一种大环二聚体单宁类化合物，研究表明OEB具有抗炎、免疫调节以及抗氧化等多种生物活性，对维持人体健康具有重要的作用。

月见草素B经过肠道吸收后，是否还能发挥对皮肤的保护作用值得进一步探究。因此，研究月见草素B在被肠道转运后对皮肤细胞的保护作用及机制，能够为开发月见草素B作为活性功能因子提供理论依据，为UVB造成的光氧化损伤相关疾病的预防开拓新的前景。

发明内容

本发明的目的是提供月见草素B的一种医药新用途。

本发明所提供的月见草素B的医药新用途，为：月见草素B在制备抗皮肤光损伤的药物中的应用。

所述应用中，所述皮肤光损伤具体可为紫外线B(UVB)导致的皮肤光损伤。

进一步地，所述应用为：月见草素B在肠-皮肤细胞共培养体系中通过激活SIRT3来抑制氧化应激以对抗皮肤光损伤的用途。

所述月见草素B为石榴多酚提取物，其结构式见式(Ⅰ)：

本发明还提供一种抗皮肤光损伤的药物，所述药物含有月见草素B。

本发明发现，在肠道-皮肤细胞共培养模型中，月见草素B是有效的SIRT3的激活剂，能显著增强皮肤细胞HaCaT外源及内源性SIRT3基因的表达。月见草素B可显著降低HaCaT细胞内ROS水平，而敲低SIRT3的表达明显降低了月见草素B对UVB诱导的氧化应激的抑制作用。

本发明实验结果表明，月见草素B通过激活SIRT3，发挥其去乙酰化活性，调节线粒体的功能、再生和动态，从而维持氧化还原稳态，防止细胞代谢过程中发生的氧化应激。本发明为开发月见草素B作为活性功能因子提供了理论依据，具有重大的应用价值。

附图说明

图1为Caco-2与HaCaT细胞trans-well共培养体系示意图。

图2表明月见草素B对外源性SIRT3-EGFP荧光强度的影响。

图3表明月见草素B对内源性SIRT3 mRNA表达水平的影响

图4表明激活SIRT3转录作用的月见草素B对Non-UVB及UVB照射下细胞内ROS含量的影响；其中A为高ROS水平细胞相对数量的散点图图示；B为细胞ROS水平定量测定的结果。

图5表明月见草素B对UVB照射条件下的Mock和SIRT3基因沉默(shSIRT3)HaCaT细胞内ROS水平的影响；其中A为高ROS水平细胞相对数量的散点图图示；B为细胞ROS水平定量测定的结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、Caco-2细胞与HaCaT细胞trans-well共培养体系的建立。

将处于对数生长期的人正常皮肤永生化角质形成细胞(HaCaT，日本理研生物资源中心)接种于24孔板；将接种有单层Caco-2细胞的小室置于HaCaT细胞的24孔板上。在AP侧加入相应浓度的月见草素B，对照组中加入等量的DMSO。

图1为Caco-2与HaCaT细胞trans-well共培养体系示意图。

实施例2、HaCaT细胞SIRT3-EGFP报告基因系统的构建和SIRT3基因表达水平的测定。

将人类SIRT3启动子(-653—-1)插入无启动子的pEGFP-C3表达载体(日本Takara公司)中得到特定的pSIRT3p-EGFP质粒。用构建的pSIRT3p-EGFP质粒转染HaCaT细胞，利用IN Cell Analyzer 1000(英国GE Healthcare公司)监测EGFP荧光的变化。

提取细胞总RNA后反转录合成cDNA，通过半定量实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定细胞SIRT3基因mRNA表达水平。

图2和图3为月见草素B对EGFP荧光强度和SIRT3 mRNA表达水平的影响。

实施例3、评价月见草素B激活SIRT3对UVB诱导HaCaT细胞产生ROS的清除作用及HaCaT细胞内活性氧含量的测定。

Caco-2细胞培养14天后，在第15天将一定浓度的月见草素B加入AP侧，培养48h后收集BL侧的培养液于－80℃保存备用。将HaCaT细胞接种于10mm细胞培养皿，24h后吸出培养基，加入少量磷酸缓冲盐溶液(PBS)覆盖细胞，利用紫外交联仪以8mJ/cm

24h后，消化HaCaT细胞并将其重新接种于96孔板，培养6h后吸走培养基，加入之前回收的已解冻预热的Caco-2细胞培养体系中BL侧的培养液，48h后采用过氧化氢特异性荧光探针BES-H2O2-Ac(日本WAKO公司)测定细胞内ROS的含量，用显微细胞图像分析测定系统IN Cell Analyzer 1000进行检测。

图4表明激活SIRT3转录作用的月见草素B对Non-UVB及UVB照射下细胞内ROS含量的影响；其中A为高ROS水平细胞相对数量的散点图图示；B为细胞ROS水平定量测定的结果。

实施例4、shSIRT3-HaCaT细胞模型的构建。

设计靶向SIRT3基因特异性shRNA表达的引物序列，并连接到慢病毒表达质粒pSUPER.retro.puro(美国OligoEngine公司)中。使用HilyMax转染试剂(日本Dojindo公司)将pGag-pol，pVSV-G质粒以及构建的重组表达质粒pSUPER-puro-shSIRT3共转染293T细胞。24h后弃去旧培养基，用含2％胎牛血清的DMEM培养基继续培养24h。收集病毒上清，添加10mg/mL聚凝胺(美国Merck Millipore公司)感染HaCaT细胞。24h后添加3μg/mL嘌呤霉素，处理3d，筛选得到pSUPER-puro-shSIRT3稳转HaCaT细胞系。

图5表明月见草素B对UVB照射条件下的Mock和SIRT3基因沉默(shSIRT3)HaCaT细胞内ROS水平的影响；其中A为高ROS水平细胞相对数量的散点图图示；B为细胞ROS水平定量测定的结果。

表1引物序列

Table1 Primer sequences