免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法

技术领域

本发明涉及生物分析领域，特别涉及一种免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法。

背景技术

磁微粒化学发光免疫分析法是化学发光免疫分析法与磁性微粒载体技术相结合的一种检测方法，它利用磁微粒具有超顺磁性、成本低、能耗少和无污染等特点，将待测物抗原(抗体)包被磁微粒形成磁微粒-免疫复合物，发光标记物标记待测物抗原(抗体)制备标记结合物，通过免疫反应形成抗原-抗体-标记抗原(抗体)复合物，发光强度与待测物抗体(抗原)的含量成正比。由于悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较酶标板载体具有更高的灵敏度和特异性、更快的检测速度和更好的重复性等优点，因此磁微粒化学发光免疫分析法日益受到人们的青睐，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。

在磁微粒化学发光免疫检测过程中，抗原抗体反应结束后，需要加入清洗液清洗3～5次，从而去除未结合到磁微粒-免疫复合物的物质。洗涤的过程容易影响了待检物质与标记物质之间的结合/解离平衡，会减少标记物标记的被分析物，导致检测限提高。当反应体系中使用的检测抗体的亲和性比较低时，这一现象则更为突出；繁琐、费时的洗涤过程也更容易出错，产生有潜在传染性的废弃物，清洗分离的步骤是误差产生的最主要来源。因此，清洗的效果直接影响磁微粒化学发光免疫检测结果的准确性、重复性好、特异性等。所以，开发无需分离或者减少分离次数的磁微粒化学发光检测方法对于提高检测的准确性、重复性等都具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法，包括以下步骤：

1)预先配置化学发光底物、分离介质以及反应物，配置使得化学发光底物、分离介质、反应物的密度依次减小，且反应物中具有偶联有磁微粒的复合物；

2)向检测管中加入预先配置的化学发光底物；

3)沿侧壁向检测管中继续加入分离介质，使得分离介质分层浮于化学发光底物上方；

4)向检测管中继续加入反应物，使得反应物分层浮于分离介质上方；

5)反应结束后，在检测管外侧施加由上至下的磁力，将反应物中的磁微粒及与磁微粒上结合的物质一起拖拽至化学发光底物区域中；

6)撤去磁力，采用化学发光检测仪器检测化学发光底物区域的反应信号。

优选的是，其中，所述分离介质为Percoll、Ficoll、Dextran、蔗糖中的一种或多种的混合物。

优选的是，配置化学发光底物时，通过加入密度介质调节化学发光底物的密度。

优选的是，所述密度介质为Percoll、Ficoll、Dextran、蔗糖中的一种或多种的混合物。

优选的是，化学发光底物、分离介质、反应物的密度依次为1.06-1.15g/cm

优选的是，利用该方法检测丙肝抗体的步骤包括：

1)配置反应物：在EP管中，加入偶联了丙肝抗体检测抗原的磁微粒，然后加入待测样本，孵育，加入碱性磷酸酶标记的检测抗体，再孵育；

配置含有质量浓度15％的蔗糖的AMPPD溶液作为化学发光底物，配置含有质量浓度12％的蔗糖的PBS溶液作为分离介质；

2)向检测管中加入步骤1)配置的化学发光底物；

3)沿检测管的侧壁在化学发光底物的上方缓慢加入步骤1)配置的分离介质；

4)将步骤1)配置得到的反应物沿检测管的侧壁加入到分离介质的上方；

5)待反应物反应结束后，在检测管外侧施加由上至下的磁力，将反应物中的磁微粒及与磁微粒结合的物质一起拖拽至化学发光底物区域中，孵育反应；

6)反应结束后，撤去磁力，采用化学发光检测仪器检测化学发光底物区域的光信号。

优选的是，其中，化学发光底物、分离介质、反应物的密度依次为1.06-1.10g/cm

优选的是，利用该方法检测丙肝抗体的步骤包括：

1)配置反应物：在EP管中，加入100uL偶联了丙肝抗体检测抗原的磁微粒，然后加入50μL待测样本，37℃孵育15min，加入100μL碱性磷酸酶标记的检测抗体，再孵育15min；

配置含有质量浓度15％的蔗糖的AMPPD溶液作为化学发光底物，配置含有质量浓度10-12％的蔗糖的PBS溶液作为分离介质；

2)向检测管中加入70μL步骤1)配置的化学发光底物；

3)沿检测管的侧壁在化学发光底物的上方缓慢加入100μL步骤1)配置的分离介质；

4)将100μL-250μL步骤1)配置得到的反应物沿检测管的侧壁加入到分离介质的上方；

5)在检测管外侧施加由上至下的磁力，将反应物中的磁微粒及与磁微粒上结合的物质一起拖拽至化学发光底物区域中，孵育2-5min；

6)反应结束后，撤去磁力，采用化学发光检测仪器检测化学发光底物区域的光信号。

本发明的有益效果是：本发明提供的免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法，减少了免疫反应中的洗涤步骤，缩短了检测时间，可减少因清洗分离步骤引入的误差，能提高检测的准确性，能保证测试的重复性和特异性。

附图说明

图1为本发明的实施例1中的免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法的原理示意图；

图2为本发明的实施例2中的丙肝抗体标准品样本浓度与发光值的关系曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

参照图1，本发明提供的一种免清洗磁微粒化学发光免疫检测方法，包括以下步骤：

1)预先配置化学发光底物、分离介质以及反应物，配置使得化学发光底物、分离介质、反应物的密度依次减小，且反应物中具有偶联有磁微粒的复合物；

2)向检测管中加入70-100μL预先配置的化学发光底物；

3)沿侧壁向检测管中继续加入70-100μL分离介质，使得分离介质分层浮于化学发光底物上方；

4)向检测管中继续加入100-250μL配置好的反应物，使得反应物分层浮于分离介质上方；

5)在检测管外侧施加由上至下的磁力，将反应物中的磁微粒及与磁微粒上结合的物质一起拖拽至化学发光底物区域中；

6)撤去磁力，采用化学发光检测仪器检测化学发光底物区域的反应信号。

其中，反应物配置好后可预先在EP管中完成孵育，然后转移到分离介质的上方，最后用磁力将反应物中的磁珠拖拽下来至化学发光底物区域中。在另外一种实施例中，也可以将反应物配置好后，先转移至于分离介质上方，再完成孵育，最后然后用磁力将反应物中的捕获磁珠拖拽至化学发光底物区域中，如图1所示。

其中，步骤5)中可在检测管外侧采用磁铁向下移动产生上述磁力，或其他电磁设备产生由上至下的磁力。

在一种优选的实施例中，所述分离介质为Percoll、Ficoll、Dextran、蔗糖中的一种或多种的混合物。

在一种优选的实施例中，配置化学发光底物时，通过加入密度介质调节化学发光底物的密度。所述密度介质为Percoll、Ficoll、Dextran、蔗糖中的一种或多种的混合物。

在一种优选的实施例中，化学发光底物、分离介质、反应物的密度依次为1.06-1.15g/cm

实施例2

本实施例中采用实施例1的方法检测丙肝抗体，具体步骤包括：

1)配置反应物：在EP管中，加入100μL偶联了丙肝抗体检测抗原的磁微粒，然后加入50μL待测样本，37℃孵育15min，加入100uL碱性磷酸酶标记的检测抗体，再孵育15min；

配置含有质量浓度15％的蔗糖的AMPPD溶液作为化学发光底物，配置含有质量浓度12％的蔗糖的PBS溶液作为分离介质；其中，化学发光底物、分离介质、反应物的密度依次为1.06-1.10g/cm

2)向检测管中加入70μL步骤1)配置的化学发光底物；

3)沿检测管的侧壁在化学发光底物的上方缓慢加入100μL步骤1)配置的分离介质；

4)将100μL-200μL步骤1)配置得到的反应物沿检测管的侧壁加入到分离介质的上方；

5)在检测管外侧施加由上至下的磁力，将反应物中的磁微粒及与磁微粒结合的物质一起拖拽至化学发光底物区域中，孵育2-5min；

6)反应结束后，撤去磁力，采用化学发光检测仪器检测化学发光底物区域的光信号。

按照实施例2的步骤对丙肝抗体标准样本以及对照样本进行检测后获得的结果如图2(丙肝抗体标准品样本浓度与发光值的关系曲线)和下表1所示：

表1

从表1和图2的结果可以看出，丙肝抗体标准品样本的发光值与样本浓度呈正相关，实施例2的方法成功实现了丙肝抗体的化学发光检测。本发明的方法减少免疫反应中的洗涤步骤，缩短检测时间，可减少因清洗分离步骤引入的误差，能提高检测的准确性，能保证测试的重复性和特异性。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。