新型控制开关

发明领域

本发明涉及提供对CAR信号传导活性的控制的嵌合抗原受体(CAR)。

发明背景

嵌合抗原受体(CAR)是人工T-细胞受体，其处于现代个性化疗法的最前沿(Lee等人 (2012)

第一代CAR包含与衍生自CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域的信号传导结构域附接的靶标结合结构域。显示第一代CAR成功地将T细胞重新引导至选择的靶标，然而，它们无法在体内提供T-细胞的延长扩增和抗肿瘤活性。因此，第二代和第三代CAR已聚焦于通过包括共刺激分子(诸如CD28、OX-40 (CD134)和4-1BB (CD137))而增强修饰的T细胞存活和增加增殖。

然而，通过与至关重要的器官(诸如肺)的潜在交叉反应，已经出现这种有前途的疗法的安全性担忧。在临床试验中，在用CAR-T细胞治疗的患者中已观察到中靶以及脱靶的肿瘤外毒性两者，并且已经报道了涉及CAR研究的两例死亡(Morgan等人 (2010)

一种类型的安全开关是自杀开关，其中CAR-T细胞被进一步工程改造以表达“自杀基因”或“消除基因”，其允许在施用外部药物后选择性破坏CAR-T细胞。例如，并入单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)意味着通过将GCV-三磷酸酯并入复制中的DNA中，前药更昔洛韦的施用导致细胞死亡。另一种方法是使用诱导型胱天蛋白酶9 (iCasp9)，一种嵌合蛋白，其结合小分子AP1903，导致胱天蛋白酶9二聚化并最终导致CAR-T细胞的凋亡。然而，自杀开关的主要缺点是它是不可逆的，并且疗法被破坏。其他缺点是外用药剂的施用可能作用不够快(开关元件经常是免疫原性的(例如HSV-TK))，或者开关可能无法达到100%效力(或者因为自杀剂不够均一或稳健)。

调节CAR活性的另一种策略是通过控制体内CAR的胞内和胞外结构域的组装(ON-型)或分解(OFF-型)。这通过如下实现：将所述CAR的信号传导结构域和靶标结合结构域分离为信号传导链和非信号传导链，然后通过添加或除去可以充当两个不同链的二聚化的诱导剂或抑制剂的小分子来调节信号传导活性。这种类型的开关策略的优点是该开关是可逆的，并且可以通过改变所述小分子的浓度来调节信号传导。然而，已经使用的小分子的药理学特性并不总是最佳的，不能保证通过小分子的剂量可直接控制受体关闭动力学。能够直接控制受体关闭动力学将意味着可以将CAR活性微调至可以有效治疗疾病/病况的水平，同时将任何副作用降低至最小。

可逆的ON-型组装开关的一个实例是雷帕霉素-FKPB12-mTOR复合物，其中雷帕霉素诱导所述CAR的信号传导链和非信号传导链的二聚化(Wu等人(2015)

WO2016/030691描述了一种可逆的OFF-型分解开关，其使用Tet阻遏物(TetR)和TetR相互作用蛋白(TiP)之间的相互作用来控制CAR的活化。该机制以与ON-型组装开关相反的方式起作用，因为小分子的添加破坏TetR-TiP结构域的二聚化，因此通过分离组成链来使CAR失活。这意味着仅在CAR需要关闭或其活性下调时才需要使用破坏分子。然而，WO2016/030691使用源自细菌的四环素结合蛋白/肽，其在人受试者中是潜在免疫原性的。

因此，在本领域中仍需要开发可逆的OFF-型分解开关以控制人类中的CAR T-细胞疗法。

发明概述

根据本发明的第一个方面，提供了适合用于治疗人受试者的嵌合抗原受体(CAR)，其包含：

(i) 包含跨膜结构域和信号传导结构域的信号传导链；

(ii) 包含靶标结合结构域和跨膜结构域的非信号传导链；

其中，所述链之一进一步包含HIV整合酶催化核心结构域(CCD)或其功能片段或变体，且另一链进一步包含LEDGF/p75整合酶结合结构域(IBD)或其功能片段或变体。

根据本发明的另一个方面，提供了编码如本文所定义的CAR的信号传导链的多核苷酸，编码如本文所定义的CAR的非信号传导链的多核苷酸以及编码如本文所定义的CAR的信号传导链和非信号传导链的多核苷酸。

根据本发明的另一个方面，提供了包含如本文所定义的多核苷酸的表达载体。

根据本发明的另一个方面，提供了包含如本文所定义的CAR的免疫调节性细胞。

根据本发明的另一个方面，提供了如本文所定义的免疫调节性细胞，其用于疗法中。

根据本发明的另一个方面，提供了包含如本文所定义的免疫调节性细胞的药物组合物。

根据本发明的另一个方面，提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将如本文所定义的药物组合物施用于人受试者。

根据本发明的另一个方面，提供了制备表达如本文所定义的CAR的免疫调节性细胞的方法，其包括：

(a)将如本文所定义的多核苷酸或表达载体转导或转染至所述免疫调节性细胞中；和

(b)在所述免疫调节性细胞中表达所述多核苷酸或所述表达载体。

根据本发明的另一个方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的免疫调节性细胞。

根据本发明的另一个方面，提供了在人受试者中控制如本文所定义的CAR的活性的方法，其包括向经历用所述CAR治疗的人受试者施用抑制LEDGF/p75-HIV整合酶相互作用的药剂。

附图简述

图1. 并入HIV整合酶和人LEDGF/p75蛋白的片段的OFF-开关嵌合抗原受体(构建体1至5)的示意性组织。为了清楚起见，从示意图省略诸如HIV整合酶结构域或CD8α铰链的组分的二聚化。scFv是抗人BCMA单链可变区片段，CD8α是人CD8α的铰链和跨膜结构域，p75是包含人LEDGF/p75蛋白的IBD的片段，IN是包含HIV整合酶的CCD的片段，41BB是人4-1BB蛋白的细胞内结构域，且CD3ζ是人CD3ζ的信号传导结构域。组分与实施例1中所述的接头集成在一起。

图2. 通过与BCMA抗原呈递细胞ARH-77-10B5相互作用触发的Jurkat细胞中的NFAT启动子的活化(黑色条)。如实施例1中所述，用构建体1至5转染Jurkat细胞。BI224436的添加对这些构建体的NFAT活化的影响由灰色条代表。

图3. 通过与BCMA抗原呈递细胞ARH-77-10B5相互作用触发的Jurkat细胞中的NFAT启动子的活化(黑色条)。如实施例2中所述，用构建体5至6转染Jurkat细胞。构建体5和6之间的差异是实施例2中描述的HIV整合酶结构域上的点突变。小分子BI224436的添加对这些构建体的NFAT活化的影响由灰色条代表。

图4. (A) OFF-开关嵌合抗原受体构建体6和7的示意图组织，所述OFF-开关嵌合抗原受体构建体6和7并入具有Phe1332Lys突变的HIV整合酶的片段和人LEDGF/p75蛋白的片段。为了清楚起见，从示意图省略诸如HIV整合酶或CD8α铰链的组分的二聚化。scFv是抗人BCMA单链可变区片段，CD8α是人CD8α的铰链和跨膜结构域，p75是人LEDGF/p75蛋白的片段，IN是HIV整合酶的片段，41BB是人4-1BB蛋白的细胞内结构域，且CD3ζ是人CD3ζ的信号传导结构域。用实施例2和实施例3中所述的接头组装组分。(B)通过与BCMA抗原呈递细胞ARH-77-10B5的相互作用触发的Jurkat细胞中的NFAT启动子的活化(黑色条)。如实施例1中所述，用构建体6和7转染Jurkat细胞。构建体6和7之间的差异是LEDGF/p75链片段与scFv元件的交换以及HIV整合酶片段与CD3ζ结构域的交换。BI224436的添加对这些构建体的NFAT活化的影响由灰色条代表。

图5. OFF-开关CAR在转导的Jurkat细胞中的表达水平。在转导后20天，通过流式细胞术分析用构建体7至12转导的Jurkat细胞，以测量OFF-开关CAR表达阳性的细胞的百分比，由抗BCMA scFv表达指示。对于所有构建体，相同的MOI用于Jurkat细胞转导。

图6. 小分子BI224436对原代T-细胞中的构建体9和构建体10的细胞因子释放概况的影响(实施例6)。

图7. 小分子BI224436的滴定对从用抗原刺激的原代T-细胞释放TNFα、IFN-γ和IL-2的影响。用以构建体13转导的T-细胞实施滴定(实施例6)。

图8. 小分子BI224436对T-细胞对靶标细胞的细胞毒性作用的影响(实施例7)。

图9. (A) OFF-开关CAR和等同的常规CAR在转导的T-细胞中的表达水平。在转导后12天，通过流式细胞术分析用构建体14和10转导的原代T-细胞，以测量CAR表达阳性的细胞的百分比，通过抗BCMA scFv表达指示。(B)小分子BI224436对用OFF-开关CAR(构建体10)转导的T-细胞和用等同的常规CAR(构建体14)转导的T-细胞的细胞毒性作用的影响(实施例8)。

发明详述

本发明是一种快速作用的可逆OFF-开关，其可以通过不同浓度的小分子化合物直接控制。在不良事件的情况下，该系统将允许CAR信号传导的迅速失活或下调，随后通过长期全身性皮质类固醇施用、用细胞特异性mAb的免疫抑制或耗竭淋巴的化学疗法(例如环磷酰胺)(如果需要)来消除CAR T-细胞。

本发明是一种CAR，其包含两种不同的蛋白，信号传导链和非信号传导链，其中仅当所述信号传导链和非信号传导链形成复合物时才发生来自CAR的信号传导。如果复合体被破坏，则信号传导也被破坏。通过使用已知破坏CAR信号传导的小分子(已知其在人类中也是安全的)来降低有害副作用的风险。此外，使用的蛋白组分具有低免疫原性潜力，并且被充分表征为具有小分子大小和足够的N-和C-末端用于与其他CAR组分的最佳融合。

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域中(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)的技术人员通常理解的相同含义。将标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(通常参见Sambrook等人, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.和Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版, John Wiley & Sons, Inc.，其通过引用以其整体并入本文)和化学方法。本文提及的所有专利和出版物都以其整体通过引用并入本文。

术语“包含”涵盖“包括”或“由...组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括另外的物质，例如X + Y。

当是指可测量的值诸如量、时间持续时间等时，如本文所用的术语“约”意指涵盖距指定值的±20%或±10%(包括±5%、±1%和±0.1%)的变异。

如本文所用的术语“嵌合抗原受体”(“CAR”)是指工程改造的受体，其包含靶标结合结构域(其通常衍生自单克隆抗体或其片段)、任选地间隔区、跨膜区和一个或多个细胞内效应子结构域。CAR也已被称为嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体(CIR)。将CAR基因引入造血细胞(诸如T细胞)中，以重定向细胞对于期望的细胞-表面抗原的特异性。

对“CAR信号传导”的提及是指通过CAR的信号传导结构域的信号传导，其导致免疫调节性细胞活化(例如触发靶标细胞杀伤和T细胞活化)。在本文所述的系统中，与信号传导链共定位的非信号传导链的靶标结合通过信号传导链中存在的信号传导结构域产生生产性CAR信号传导。然而，如果存在引起所述信号传导链和非信号传导链变得离位的药剂，则受体组分的靶标结合导致非生产性信号传导，因为没有信号通过信号传导结构域被活化。

术语“安全开关”或“控制开关”是指可以根据需要活化以便控制可引起伤害的生物过程的生物化学机制。安全开关可以在CAR分子中使用，使得它们可以外部控制(即经由从细胞外部施用)，以增强CAR疗法的安全性。例如，可以将所述CAR的信号传导链和非信号传导链分为分开的组分。所述组分含有结合结构域，其相互作用并使所述信号传导链和非信号传导链在一起，以便当结合靶标抗原时活化信号传导。该系统的优点在于，结合结构域之间的相互作用可以外部控制，例如，通过施用破坏结合结构域或使结合结构域在一起的药剂。

术语“LEDGF/p75”是指人晶状体上皮衍生的生长因子蛋白。存在该蛋白的其他同义词，包括：PC4和SFRS1-相互作用蛋白，CLL-相关的抗原KW-7，致密细斑点70 kDa蛋白(DFS70)或转录共活化因子p75/p52。LEDGF/p75的N-末端结构域结合染色体DNA，而其C-末端结构域与HIV整合酶(UniProt：O75475)的催化核心结构域(CCD)相互作用，将HIV整合体拴系至宿主细胞染色质。

术语“LEDGF/p75 C-末端区域”是指LEDGF/p75蛋白的氨基酸残基411至该蛋白的C-末端的氨基酸序列。

术语“HIV整合酶”是指人免疫缺陷病毒(HIV)整合酶(IN)，其为一种酶，其使得逆转录病毒遗传物质能够整合至被感染细胞的DNA中。其为从HIV

术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其保留其三级结构而不依赖于蛋白的剩余部分。通常，结构域负责蛋白的离散功能特性，并且在许多情况下，可以被添加、除去或转移至其他蛋白，而不损失蛋白的剩余部分和/或结构域的功能。

如本文所用的术语“靶标结合结构域”被定义为能够结合特定靶标、诸如抗原或配体的寡肽或多肽。具体而言，所述靶标可以是细胞表面分子。例如，可以选择靶标结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的致病性细胞(包括致病性人细胞)上的细胞表面标志物的靶标。所述靶标结合结构域可以是例如结合抗原的任何类型的蛋白。

如本文所用的术语“间隔区”是指发挥功能以将跨膜结构域连接至靶标结合结构域的寡肽或多肽。该区域也可以被称为“铰链区域”或“茎区域”。间隔区的大小可以根据靶标表位的位置而变化，以便在CAR:靶标结合后维持设定距离(例如14nm)。

如本文所用的术语“跨膜结构域”是指横穿细胞膜的CAR分子的部分。

如本文所用的术语“信号传导结构域”(也称为“细胞内效应子结构域”)是指CAR中的结构域，其负责在靶标结合结构域与靶标结合后的细胞内信号传导。信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，是指具有免疫球蛋白样结构域的分子(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，且包括单克隆、重组、多克隆、嵌合、人、人源化、多特异性抗体，包括双特异性抗体和异源缀合抗体；单一可变结构域(例如，VH、VHH、VL、结构域抗体(dAb

术语“单一可变结构域”是指包含抗体可变结构域特征性的序列的折叠的多肽结构域。因此，其包括完整的抗体可变结构域，诸如VH、VHH和VL以及修饰的抗体可变结构域(例如，其中一个或多个环已被不是抗体可变结构域特征性的序列替换)，或者已经被截短或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。单一可变结构域能够不依赖于不同的可变区或结构域而结合抗原或表位。“结构域抗体”或“dAb

“亲和力”是一个分子(例如本发明的CAR的靶标结合蛋白)与另一个(例如其靶标蛋白)在单一结合位点的结合的强度。靶标结合蛋白与其靶标的结合亲和力可以通过平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如BIACORE

如本文所用的序列同一性是如通过比较序列确定的两个或更多个氨基酸序列或两个或更多个核酸序列之间的相关性程度。序列的比较和序列同一性的测定可以使用数学算法来完成；本领域技术人员将意识到可用于比对两个序列并测定它们之间的百分比同一性的计算机程序。技术人员将理解，不同的算法可以产生略微不同的结果。

因此，查询核酸序列和主题核酸序列之间的“百分比同一性”是表示为百分比的“同一性”值，当主题核酸序列在进行成对BLASTN比对之后与查询核酸序列具有100%查询覆盖率时，所述“同一性”值通过BLASTN算法来计算。查询核酸序列和主题核酸序列之间的此类成对BLASTN比对通过使用National Center for Biotechnology Institute的网站上可得的BLASTN算法的默认设置来进行，其中关闭低复杂性区域的过滤器。重要的是，查询核酸序列可以通过本文的一项或多项权利要求中确定的核酸序列来描述。

类似地，查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的“百分比同一性”是表示为百分比的“同一性”值，当主题氨基酸序列在进行成对BLASTP比对之后与查询氨基酸序列具有100％查询覆盖率时，所述“同一性”值通过BLASTP算法来计算。查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的此类成对BLASTP比对通过使用National Center for BiotechnologyInstitute的网站上可得的BLASTP算法的默认设置来进行，其中关闭低复杂性区域的过滤器。重要的是，查询氨基酸序列可以通过本文的一项或多项权利要求中确定的氨基酸序列来描述。

查询序列可以与主题序列具有100%同一性，或者其与主题序列相比可以包括最多达特定整数的氨基酸或核苷酸改变，使得%同一性小于100%。例如，查询序列与主题序列具有至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性。此类改变包括至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，并且其中所述改变可以发生在查询序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置，其单独散布在查询序列中的氨基酸或核苷酸之间或散布在查询序列内的一个或多个连续组中。

如本文所用的术语“自体的”是指来自同一人受试者的细胞。如本文所用的术语“同种异体的”是指相同物种的与所比较的细胞在遗传上不同的细胞。

术语“人受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

术语“药物组合物”是指在药学上可接受或生理学上可接受的溶液中配制的，用于施用于细胞或受试者的组合物。本发明的组合物同样可以与其他药剂组合施用，条件是另外的药剂不会不利地影响所述组合物递送意欲疗法的能力。

术语“癌症”(有时也称为“瘤形成”)是指由机体的部分中由异常细胞的不受控制的分裂引起的疾病。不受控制的分裂经常可以导致肿块，通常被称为“肿瘤”或“赘生物”。

如本文所用的术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞上表达的抗原。当与正常(即非癌)细胞相比时，该抗原可以在肿瘤细胞上独特或差异表达。

本文所述的CAR还可用于治疗有此需要的受试者的方法中。治疗可以是治疗性、预防性或防止性的。治疗涵盖疾病的至少一个方面或症状的减轻、减少或预防，且涵盖本文所述的疾病的预防或治愈。

本文所述的CAR可以以对于治疗、预防或防止性治疗有效的量使用。本文所述的CAR的治疗有效量是有效改善或减轻所述疾病的一种或多种症状或预防或治愈所述疾病的量。

嵌合抗原受体

根据本发明的第一个方面，提供了适合用于治疗人受试者的嵌合抗原受体(CAR)，其包含：

(i) 包含跨膜结构域和信号传导结构域的信号传导链；

(ii) 包含靶标结合结构域和跨膜结构域的非信号传导链；

其中，所述链之一进一步包含HIV整合酶催化核心结构域(CCD)或其功能片段或变体，且另一链进一步包含LEDGF/p75整合酶结合结构域(IBD)或其功能片段或变体。

HIV整合酶结构域与LEDGF/p75结构域的结合引起所述信号传导链和非信号传导链的异二聚化和共定位。因此，当所述非信号传导链的靶标结合结构域结合靶标并且所述HIV整合酶结构域和LEDGF/p75结构域结合时，在信号传导链中存在信号传导。

本文所述的CAR以可逆的OFF-开关机制使用HIV整合酶-LEDGF/p75蛋白-蛋白相互作用。在HIV整合酶同二聚体的催化核心和人转录活化LRDGF/p75的4-螺旋束结构域之间形成复合物(Cherepanov等人 (2005) PNAS, 102(48): 17308-13)。这种特定的蛋白-蛋白相互作用是HIV整合酶变构抑制剂研究的靶标，所述HIV整合酶变构抑制剂研究已经产生了有效的、充分表征的和可生物利用的化合物(Tsiang等人 (2012) J. Biol. Chem., 287(25): 21189-203; Christ & Debyser, (2013) Virology, 435(1): 102-9)。与使用源自细菌的四环素结合蛋白/肽的其他公开实例(例如WO 2016/030691)相比，本文所述的CAR的潜在优势是，CAR由已经发现存在于人受试者中的蛋白结构域组成，并且可能潜在地具有较低的免疫原性潜能。进一步，提出的系统的组分尺寸小(约150个残基的HIV整合酶催化核心结构域(CCD)和约80个残基的LEDGF/p75整合酶结合域(IBD))，其中末端氨基酸残基的位置适合于连接至CAR组分的剩余部分。

除了小分子以外，所述蛋白-蛋白相互作用还可以通过短肽来调节(Hayouka等人(2010)

将理解的是，本文所述的CAR需要HIV整合酶和LEDGF/p75结构域与彼此结合。在一个实施方案中，所述CAR包含HIV整合酶催化核心结构域(CCD)或其功能片段或变体和LEDGF/p75整合酶结合域(IBD)或其功能片段或变体。将理解的是，也可以包括所述HIV整合酶和LEDGF/p75蛋白的其他部分，例如在N-末端或C-末端结构域中的另外的残基。

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75 IBD包含野生型蛋白(Uniprot O75475)的残基347-426。在一个进一步实施方案中，所述LEDGF/p75 IBD包含SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，所述HIV整合酶CCD包含野生型蛋白(Uniprot P12497)的残基1203-1355。在一个进一步实施方案中，所述HIV整合酶CCD包含SEQ ID NO:2。

对“功能片段”的提及是指完整的野生型氨基酸序列的片段，其仍保留衍生出所述片段的野生型蛋白的结合功能(即，仍使得结合结构域能够相互作用)。片段可以合适地包含至少10个氨基酸长度，例如25、50、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300个氨基酸长度。片段也可以包含整个蛋白的C-末端截短或N-末端截短。

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能片段包含野生型蛋白(Uniprot O75475)的残基347-430。在一个进一步实施方案中，所述LEDGF/p75功能片段包含SEQ ID NO:47。

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能片段包含野生型蛋白(Uniprot O75475)的残基347-442。在一个进一步实施方案中，所述LEDGF/p75功能片段包含SEQ ID NO:48。

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能片段包含野生型蛋白(Uniprot O75475)的残基347-471。在一个进一步实施方案中，所述LEDGF/p75功能片段包含SEQ ID NO:49。

在一个实施方案中，所述HIV整合酶CCD包含野生型蛋白(Uniprot P12497)的残基1203-1355。在一个进一步实施方案中，所述HIV整合酶CCD包含SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，所述HIV整合酶功能片段包含野生型蛋白(Uniprot P12497)的残基1203-1355。在一个进一步实施方案中，HIV整合酶包含SEQ ID NO:2。

对“功能变体”的提及包括这样的变体，其具有与野生型序列相似的氨基酸或核苷酸序列、但具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变，其产生仍保留衍生出所述变体的野生型蛋白的结合功能(即，仍使得结合结构域能够相互作用)的变体。也就是说，条件是所述功能变体促进受体和细胞内信号传导组分的充分共定位，用于在靶标与靶标结合结构域结合后发生生产性信号传导。

在一个实施方案中，所述HIV整合酶功能变体包含与野生型序列的80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性，条件是所述序列仍能够结合LEDGF/p75。同样地，在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能变体包含与野生型序列的80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性，条件是所述序列仍能够结合HIV整合酶。

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能变体在LEDGF/p75 C-末端区域中包含一个或多个氨基酸变化，其中具有疏水性侧链的氨基酸被具有亲水性或中性侧链的氨基酸替代。具有疏水性侧链的氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能变体包含野生型蛋白(Uniprot O75475)的残基347-430，并

在一个实施方案中，所述LEDGF/p75功能变体包含野生型蛋白(Uniprot O75475)的残基347-430，并

在一个实施方案中，所述HIV整合酶CCD包含野生型蛋白(Uniprot P12497)的残基1203-1355。在一个进一步实施方案中，所述HIV整合酶CCD包含SEQ ID NO:2。

合适的药剂的存在可能破坏所述信号传导链和非信号传导链的结合。在一个进一步实施方案中，本发明进一步包括破坏所述信号传导链和非信号传导链的结合的药剂。将理解的是，术语“药剂”是指破坏HIV整合酶和LEDGF/p75结构域之间的相互作用的任何实体(例如，小的药物分子或肽)。这允许以可控的方式可逆地终止CAR信号传导，以避免与连续CAR信号传导相关的潜在毒副作用。药剂的使用还允许将CAR细胞的功效药理学控制并调节至实现期望的治疗效果和避免有害毒性之间的可接受的平衡。

所述破坏剂可以通过优先结合所述信号传导链或非信号传导链来置换信号传导和非信号传导链，且由此破坏信号传导所需的异二聚化。

使用本文所述的系统的优点在于，所述疗法不会像自杀开关的情况那样，仅由于施用破坏剂而消除。所述破坏剂也可以在CAR之前或同时施用于患者，以施用呈其“非活性”(即“OFF”)状态的CAR。施用呈其非活性状态的CAR允许其在活化之前分布。一旦CAR被活化，用所述破坏剂给药仅在严重副作用的情况下才是必要的。如果必需，仍可以通过本领域中已知的方法消除CAR-T-细胞，诸如长期全身性皮质类固醇施用，用细胞特异性mAb免疫抑制或耗竭淋巴的化疗(例如环磷酰胺)。

所述破坏剂可能能够被递送至靶标细胞的细胞质并且可用于细胞内结合。所述破坏剂可能能够穿过血-脑屏障。

先前已经描述了称为“LEDGIN”的药剂，其通过结合HIV整合酶的二聚体界面结合来充当LEDGF/p75 – HIV整合酶相互作用的有效抑制剂(例如参见Tsiang等人(2012)

在一个实施方案中，所述破坏剂是LEDGF/p75-HIV整合酶相互作用的抑制剂。在一个进一步实施方案中，所述破坏剂选自2-(喹啉-3-基)乙酸衍生物、2-(吡啶-3-基)乙酸衍生物、2-(噻吩并[2,3-

在一个实施方案中，所述破坏剂是喹啉衍生物，诸如2-(喹啉-3-基)乙酸衍生物。在一个进一步实施方案中，所述破坏剂选自：3-喹啉乙酸，4-(2,3-二氢吡喃并[4,3,2-de]喹啉-7-基)-α-(1,1-二甲基乙氧基)-2-甲基-，(

在一个实施方案中，所述药剂选自Demeulemeester等人 (2014) Expert Opin.Ther. Pat. 24, 609-632(其通过引用并入本文)中描述的任何药剂。

在一个实施方案中，该试剂选自表1中列出的任何化合物。

在一个实施方案中，所述信号传导链和非信号传导链可以包含HIV整合酶CCD或LEDGF/p75 IBD的肽模拟物，其以比野生型HIV整合酶或LEDGF/p75结构域更低的亲和力结合。然后这允许天然HIV整合酶或LEDGF/p75结构域用作通过竞争性结合破坏肽模拟物的结合的药剂。

在所述破坏剂不存在的情况下，所述非信号传导链的抗原结合可能导致通过所述信号传导链的信号传导比当在所述破坏剂存在的情况下由所述非信号传导链结合抗原时的信号传导高2、5、10、50、100、1000或10000倍。

所述信号传导链和非信号传导链可以促进通过CAR的信号传导，其与存在的破坏剂的浓度成比例。因此，尽管所述破坏剂可以置换所述信号传导链和非信号传导链之间的结合，但在低浓度的破坏剂存在的情况下，所述信号传导链和非信号传导链的共定位可能不会完全降低。因此，低浓度的破坏剂可能降低信号传导的水平，而不完全抑制它。信号传导的水平以及与破坏剂的浓度的相关性可以使用本领域中已知的方法来确定。

CAR信号传导可以通过本领域中已知的各种方法来确定。例如，可以使用测量信号转导的测定法，诸如测定特定蛋白酪氨酸激酶(PTK)的水平，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(PIP

本发明首次描述了在可逆的CAR OFF-开关中使用LEDGF/p75-HIV整合酶相互作用的抑制剂。因此，根据本发明的一个进一步方面，提供了本文所述的破坏剂用于抑制如本文所述的CAR的用途。

接头可以存在于构成信号传导链和非信号传导链的结构域中的一个或多个之间。在一个实施方案中，所述CAR另外包含跨膜结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间，和/或跨膜结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间，和/或信号传导结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间的接头。如果存在共刺激结构域，则CAR可以另外包含共刺激结构域和相邻结构域之间的接头。例如，接头可以在跨膜结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间，和/或HIV整合酶或LEDGF/p75结构域和共刺激结构域之间，和/或跨膜结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间，和/或HIV整合酶或LEDGF/p75结构域和共刺激结构域之间，和/或信号传导结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间，和/或信号传导结构域和共刺激结构域之间。

理想地，与HIV整合酶连接的接头具有足够的长度，以使得能够与来自邻近组分的HIV整合酶进行二聚化并将其定向在正确的方向上。

可以设计具有足够长度的序列的接头，其符合Cherepanov等人, (2005)

根据本发明的接头可以单独包含一组或多组GS残基或除了其他接头以外还包含一组或多组GS残基。在一个实施方案中，所述接头包含(GGGGS)

在一个实施方案中，接头包含(SDPS)

在一个实施方案中，所述接头包含与SEQ ID NO:3-9的至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性。在一个实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:3-9中任一个或其组合。

在本文所述的接头序列中，可以提供在所述结合结构域的开始和/或末端处的残基SPD的添加，以破坏HIV整合酶CCD和/或LEDGF/p75 IBD的N-和C-末端螺旋。

将理解的是，在本文所述的CAR中的不同结构域之间可以使用不同的接头。因此，在一个实施方案中，所述跨膜结构域和所述第一结合结构域和/或所述跨膜结构域和所述第二结合结构域之间的接头包含SEQ ID NO:3或4。在一个进一步实施方案中，所述跨膜结构域和所述第一结合结构域之间的接头包含SEQ ID NO:3或4。在又一个进一步实施方案中，所述跨膜结构域和LEDGF/p75之间的接头包含SEQ ID NO:3或4。将理解的是，如果在所述CAR内包括共刺激结构域，则本文所述的实施方案可以同样适用，例如，所述共刺激结构域和LEDGF/p75之间的接头可以包含SEQ ID NO:3或4。

在一个实施方案中，所述信号传导结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间的接头包含SEQ ID NO:5-7中任一个。在一个进一步实施方案中，所述信号传导结构域和HIV整合酶结构域之间的接头包含SEQ ID NO:5-7中任一个。在一个替代实施方案中，所述信号传导结构域和LEDGF/p75结构域之间的接头包含SEQ ID NO:5-7中任一个。

如果存在共刺激结构域，则所述共刺激结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间的接头可以包含SEQ ID NO:5-7中任一个。如果在所述HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之后存在共刺激结构域，则所述接头序列可以包含SEQ ID NO:5或6，特别是用于LEDGF/p75结构域的SEQ ID NO:5和/或用于HIV整合酶结构域的SEQ ID NO:6。在该实施方案中，如果在所述HIV整合酶或LEDGF/p75结构域和所述信号传导结构域之间存在共刺激结构域，则所述共刺激结构域和信号传导结构域之间的接头可以包含SEQ ID NO:7。

所述靶标结合结构域结合靶标，其中所述靶标是肿瘤特异性分子、病毒分子或在靶标细胞群体上表达的适合用于介导通过淋巴细胞的识别和消除的任何其他分子。在一个实施方案中，所述靶标结合结构域包含抗体、抗原结合片段或配体。在一个实施方案中，所述靶标结合结构域包含抗体或其片段。在一个实施方案中，所述靶标结合结构域是配体(例如靶标抗原的天然配体)。在一个替代实施方案中，所述靶标结合结构域是抗原结合片段。在一个进一步实施方案中，所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)或dAb

在一个实施方案中，所述靶标结合结构域可以结合多于一种靶标，例如两种不同的靶标。这种靶标结合结构域可以衍生自双特异性单链抗体。例如，博纳吐单抗(Blinatumomab)(也称为AMG 103或MT103)是一种重组CD19和CD3双特异性scFv抗体，其由组装成单一多肽链的四个免疫球蛋白可变结构域组成。所述可变结构域中的两个形成CD19的结合位点，所述CD19是在大多数正常和恶性B细胞上表达的细胞表面抗原。其他两个可变结构域形成CD3的结合位点，所述CD3是T细胞上的T细胞-受体复合物的一部分。这些可变结构域可以串联排列在CAR中，即，栓系至间隔区的两个单链抗体可变片段(scFv)，以及跨膜和信号传导结构域。四个可变结构域可以以任何特定顺序排列于CAR分子内(例如VL(第一靶标)-VH(第一靶标)-VH(第二靶标)-VL(第二靶标)或VL(第二靶标)-VH(第二靶标)-VH(第一靶标)-VL(第一靶标)等)。

所述靶标结合结构域可以结合各种细胞表面抗原，但在一个实施方案中，所述靶标结合结构域结合肿瘤相关抗原。在一个进一步实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自：BCMA、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125、CA19-9、CD5、CD13、CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD34、CD45、CD52、CD70、CD117、CD138、CD160、表皮生长因子受体(EGFR)、叶酸结合蛋白、神经节苷脂G2 (GD2)、HER2、间皮素、MUC-1、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺酸磷酸酶(phosphatise)(PAP)、蛋白黑素-A(melan-A)、突触素(synaptophysis)、前列腺的六跨膜上皮抗原I (STEAP1)、TARP、Trp-p8、酪氨酸酶或波形蛋白。在又一个进一步实施方案中，所述肿瘤相关抗原是BCMA。

在一个实施方案中，所述靶标结合结构域具有以下结合亲和力：小于约500纳摩尔(nM)，诸如小于约400 nM、350 nM、300 nM、250 nM、200 nM、150 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.5 nM或0.25 nM。在一个实施方案中，所述靶标结合结构域具有约10 nM至约0.25 nM的结合亲和力。在一个进一步实施方案中，所述靶标结合结构域具有约1 nM至约0.5 nM(即约1000 pM至约500 pM)的结合亲和力。

在一个实施方案中，所述CAR另外包含在所述靶标结合结构域和所述跨膜结构域之间的间隔区结构域。间隔区允许所述靶标结合结构域以不同方向取向以便于结合，并且可用于提高靶标结合相互作用。在一个实施方案中，所述间隔区包含衍生自IgG(例如IgG1Fc区或IgG1铰链区)、CD8或CD4的序列。

所述信号传导链和非信号传导链各自中的跨膜结构域充当膜锚，以将所述信号传导链维持在细胞表面。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。在一个实施方案中，所述跨膜结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。或者，所述跨膜结构域可以是合成的，并且可以主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。

例如，所述跨膜结构域可以是以下的跨膜结构域：CD蛋白，诸如CD4、CD8、CD3或CD28，T细胞受体的亚基，诸如α、β、γ或δ，IL-2受体的亚基(α链)，或Fc受体的亚基链。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含CD4、CD8或CD28的跨膜结构域。在一个进一步实施方案中，所述跨膜结构域包含CD4或CD8的跨膜结构域(例如，CD8α链，如NCBI参考序列：NP_001139345.1(其通过引用并入本文)中所述)。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:10。

在一个实施方案中，所述信号传导链可以另外在跨膜结构域旁边包含铰链序列。在一个进一步实施方案中，所述铰链序列包含SEQ ID NO:11。在一个进一步实施方案中，所述铰链和跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的完整序列。

在一些实施方案中，所述跨膜结构域由以下构成：CD8α跨膜螺旋，紧接着是4-1BB的全长细胞内结构域，其含有与膜界面相容的序列的延伸段。如果跨膜结构域旁边的结构域不具有与膜界面相容的序列，则可以使用接头。

因此，在一个实施方案中，在所述跨膜结构域和紧接在细胞膜的细胞内侧上的跨膜结构域之后的结构域之间存在接头。在一个进一步实施方案中，在所述跨膜结构域和所述HIV整合酶或LEDGF/p75结构域之间存在接头；或者，如果存在，在所述跨膜结构域和所述共刺激结构域之间存在接头。在又一个进一步实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:13。如果所述跨膜结构域衍生自CD8α，则该接头是特别有利的，因为它就是来自CD8α的紧接跨膜螺旋之后的天然序列。

用于本文所述的CAR中的信号传导结构域的优选实例可以是协同起作用以在抗原结合后起始信号转导的天然T细胞受体和共受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体，和任何合成序列，其具有相同功能能力。信号传导结构域可以分为两类：起始抗原依赖性一级活化的那些，和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些。一级活化效应子结构域可以包含信号传导基序，其被称为免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。ITAM是良好定义的信号传导基序，通常在各种受体的胞质内尾部中发现，并且充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。作为非限制性实例，本发明中使用的ITAM的实例可以包括衍生自以下的那些：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一个实施方案中，所述信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域(也称为CD247)。在一个进一步实施方案中，所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:14。该序列也见于Uniprot P20963，残基51-164中。天然TCR含有CD3ζ信号传导分子，因此该效应子结构域的使用最接近于在自然界中存在的TCR构建体。

在一个实施方案中，所述信号传导链的信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域，其具有与SEQ ID NO:14具有至少70%、优选至少80%、更优选至少85%、90 %、95 %、98 %或99 %序列同一性的氨基酸序列。在一个进一步实施方案中，所述CAR的信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

所述CAR的信号传导或非信号传导链可以进一步包含信号肽，使得当组分在细胞中表达时，新生蛋白被引导至内质网，且随后被引导至其中表达它的细胞表面。

信号肽的核心可以含有疏水性氨基酸的长延伸段，其具有形成单个α螺旋的倾向。所述信号肽可以以氨基酸的短的带正电荷的延伸段开始，所述延伸段有助于强化所述多肽在易位期间的适当拓扑学。在所述信号肽的末端，通常存在被信号肽酶识别和切割的氨基酸的延伸段。信号肽酶可以在完成易位期间或之后切割，以生成游离信号肽和成熟蛋白。然后，所述游离信号肽被特定蛋白酶消化。所述信号肽可以在所述分子的氨基末端。

在一个实施方案中，所述信号肽衍生自CD8(参见UniProt P01732)。在一个进一步实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:15或其具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入、缺失、取代或添加)的变体，条件是所述信号肽仍发挥功能以引起所述组分(即功能变体)的细胞表面表达。

如本文所述，所述信号传导链和/或非信号传导链可以进一步包含次级或共刺激信号。T细胞另外包含共刺激分子，其结合抗原呈递细胞上的同源共刺激配体，以增强T细胞应答，例如通过增加增殖活化、分化等。因此，在一个实施方案中，所述信号传导和非信号传导链另外包含共刺激结构域。在一个进一步实施方案中，所述共刺激结构域包含选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：CD28、CD27、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、ICOS (CD278)、CD30、CD40、PD-1 (CD279)、CD2、CD7、NKG2C (CD94)、B7-H3 (CD276)或其任何组合。在又一个进一步实施方案中，所述共刺激结构域包含选自CD28、CD27、4-1BB、OX40、ICOS或其任何组合的共刺激分子的细胞内结构域，尤其是4-1BB的细胞内结构域。

在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB信号传导结构域，其具有与SEQID NO:16具有至少70%、优选至少80%、更优选至少85%、90 %、95 %、98 %或99 %序列同一性的氨基酸序列。在一个进一步实施方案中，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的4-1BB信号传导结构域。该序列也见于Uniprot Q07011，残基214-255中。

嵌合抗原受体系统排列

本领域技术人员将理解，本文所述的CAR中涉及的结构域的各种构型是可能的，但所述靶向结合结构域将必需在所述跨膜结构域的细胞外侧，并且所述信号传导、共刺激和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域将必需在跨膜结构域的细胞内侧。

在一个实施方案中，所述非信号传导链以如下顺序包含结构域：靶标结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域(排列A)。

在一个替代实施方案中，所述非信号传导链以如下顺序包含结构域：靶标结合结构域；跨膜结构域；HIV整合酶或LEDGF/p75结构域；和共刺激结构域(排列B)。

在另一个实施方案中，所述非信号传导链以如下顺序包含结构域：靶标结合结构域；跨膜结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域(排列C)。

在一个实施方案中，所述信号传导链以如下顺序包含结构域：跨膜结构域；共刺激结构域；HIV整合酶或LEDGF/p75结构域；和信号传导结构域(排列I)。

在一个替代实施方案中，所述信号传导链以如下顺序包含结构域：跨膜结构域；HIV整合酶或LEDGF/p75结构域；共刺激结构域；和信号传导结构域(排列II)。

在另一个实施方案中，所述信号传导链以如下顺序包含结构域：跨膜结构域；HIV整合酶或LEDGF/p75结构域；和信号传导结构域(排列III)。

因此，在一个实施方案中，所述CAR包含排列A、B或C的非信号传导链与以排列I、II或III排列的任何信号传导链的组合。

将理解的是，在任何这些排列中，或者(i)所述非信号传导链包含HIV整合酶结构域，且所述信号传导链包含LEDGF/p75结构域，或者(ii)所述非信号传导链包含LEDGF/p75结构域，且所述信号传导链包含HIV整合酶结构域。

在另一个实施方案中，所述CAR包含排列A的非信号传导链与排列I的信号传导链。在另一个实施方案中，所述CAR包含排列A的非信号传导链与排列II的信号传导链。在另一个实施方案中，所述CAR包含排列A的非信号传导链与排列III的信号传导链。

在另一个实施方案中，所述CAR包含排列B的非信号传导链与排列I的信号传导链。在另一个实施方案中，所述CAR包含排列B的非信号传导链与排列II的信号传导链。在另一个实施方案中，所述CAR包含排列B的非信号传导链与排列III的信号传导链。

在另一个实施方案中，所述CAR包含排列C的非信号传导链与排列I的信号传导链。在另一个实施方案中，所述CAR包含排列C的非信号传导链与排列II的信号传导链。在另一个实施方案中，所述CAR包含排列C的非信号传导链与排列III的信号传导链。

在一个实施方案中，所述非信号传导链可以包含多个HIV整合酶或LEDGF/p75结构域。这允许所述非信号传导链能够募集多于一个信号传导链，且因此响应于靶标结合而扩增信号。所述HIV整合酶或LEDGF/p75结构域可以各自是具有不同结合亲和力的变体或片段。

在一个实施方案中，所述CAR可以包含两个或更多个靶标结合结构域，其各自识别不同的靶标，但包含相同的HIV整合酶或LEDGF/p75结构域。这种系统将能够识别多种抗原。在该排列的一个进一步实施方案中，所述受体组分的HIV整合酶或LEDGF/p75结构域的残基不同，所述残基决定它们对所述信号传导链的HIV整合酶或LEDGF/p75结构域的亲和力。以这种方式，可以调节CAR，使得响应于一种抗原的信号传导大于或小于对另一种抗原的响应

在一个实施方案中，本文所述的CAR可以包含多个信号传导链，其各自包含信号传导结构域和HIV整合酶或LEDGF/p75结构域，其中所述信号传导链包含不同的信号传导结构域(例如CD3ζ、CD28、4-1BB和/或OX-40)。这允许同时活化多个不同的信号传导结构域。

适合于改变所述HIV整合酶或LEDGF/p75结构域的氨基酸残基、使得改变两个结构域之间的结合亲和力的方法是本领域中已知的。例如，此类方法包括使用靶向诱变和随机诱变两者进行氨基酸的取代、添加和除去。

用于测定所述HIV整合酶和LEDGF/p75结构域之间的结合亲和力的方法也是本领域中众所周知的。这些包括蛋白-蛋白相互作用的生物信息学预测、亲和电泳、表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射和动态光散射。

多核苷酸和表达载体

根据本发明的一个进一步方面，提供了编码本文定义的CAR的信号传导链的多核苷酸，编码本文定义的CAR的非信号传导链的多核苷酸或编码本文定义的CAR的信号传导链和非信号传导链的多核苷酸链。

本文所述的多核苷酸序列可以是密码子优化的。在遗传密码中发现的简并性允许每个氨基酸由一个至六个同义密码子编码，允许许多替代核酸序列编码相同的蛋白(Gustafsson等人

本文所述的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。许多不同类型的修饰是本领域中众所周知的，诸如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架，或添加吖啶或聚赖氨酸链。可以使用此类修饰以增强本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。

所述CAR的信号传导链和非信号传导链可以从分开的核酸表达或从同一核酸共表达。

使用单一质粒在细胞或生物中同时表达多于一种基因的方法是本领域中众所周知的。例如，方法包括：多个启动子与基因的开放阅读框(ORF)融合；在基因之间插入剪接信号；融合其表达由单一启动子驱动的基因；在基因之间插入蛋白水解切割位点；基因之间插入内部核糖体进入位点(IRES)；在基因之间插入自切割肽序列。

如果共表达所述组分，则核酸可以产生多肽，所述多肽包含通过切割位点连接的信号传导链和非信号传导链。所述切割位点可以是自切割的，使得当产生多肽时，其立即被切割成信号传导链和非信号传导链组分，而无需任何外部切割活性。因此，根据本发明的一个进一步方面，提供了编码本文所述的CAR的多核苷酸，其中所述信号传导链和所述非信号传导链通过自切割肽的方式共表达，所述自切割肽在翻译后在信号传导链和非信号传导链之间被切割。

自切割肽的实例是本领域中已知的，例如参见Kim等人 (2011) PLoS ONE 6(4):e18556。

在一个实施方案中，所述自切割肽是2a自切割肽。在一个进一步实施方案中，所述2a自切割肽衍生自猪捷申病毒-1 (porcine teschovirus-1)、

在一个实施方案中，在所述信号传导链和所述自切割肽之间和/或在所述非信号传导链和所述自切割肽之间存在接头。在一个进一步实施方案中，所述接头包含SEQ IDNO:8或9。

在一个实施方案中，所述组分使用包含共表达序列的多核苷酸共表达。在一个进一步实施方案中，所述共表达序列是内部核糖体进入位点(IRES)或内部启动子。

所述多核苷酸可以存在于表达盒或表达载体(例如用于引入细菌宿主细胞的质粒，或用于转染哺乳动物宿主细胞的病毒载体、诸如慢病毒)中。因此，根据本发明的一个进一步方面，提供了包含本文所述的多核苷酸的表达载体。

术语“载体”是指能够将外来遗传物质人工携带至另一细胞中(其可以在另一细胞中复制和/或表达)的媒介物。在一个实施方案中，所述载体是质粒、病毒载体、基于转座子的载体或合成的mRNA。

在一个实施方案中，所述表达载体是逆转录病毒载体。在一个进一步实施方案中，所述逆转录病毒载体衍生自或选自慢病毒、α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒或泡沫-逆转录病毒，诸如慢病毒或γ-逆转录病毒，尤其是慢病毒。在一个进一步实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒是选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV和Visna的慢病毒。慢病毒能够感染未分裂的(即静止的)细胞，这使其成为用于基因疗法的有吸引力的载体。在又一个进一步实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒是HIV-1或衍生自HIV-1。一些逆转录病毒的基因组结构可以在本领域中找到。例如，可以从NCBI Genbank (基因组登录号AF033819)找到关于HIV-1的详情。HIV-1是最佳理解的逆转录病毒之一，且因此经常被用作病毒载体。

免疫调节性细胞

根据本发明的一个进一步方面，提供了包含本文所述的CAR的免疫调节性细胞。根据本发明的另一个方面，提供了包含本文所述的多核苷酸或表达载体的免疫调节性细胞。

在一个实施方案中，所述免疫调节性细胞包含本文所述的CAR的信号传导链和非信号传导链。在一个进一步实施方案中，所述免疫调节性细胞包含许多不同的信号传导链和许多不同的非信号传导链。例如，所述免疫调节性细胞可以包含本文所述的CAR的1、2、3、4、5或更多个不同的信号传导链和1、2、3、4、5或更多个不同的非信号传导链。

术语“免疫调节性细胞”是指功能上参与先天和/或适应性免疫应答的调节(例如起始和/或执行)的造血来源的细胞。根据本发明的所述免疫调节性细胞可以衍生自干细胞。所述干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地是非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导的多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。所述免疫调节性细胞也可以是树突细胞、杀伤性树突细胞、肥大细胞、NK-细胞、B-细胞或T-细胞。所述T-细胞可以选自炎性T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞或其组合。因此，在一个实施方案中，所述免疫调节性细胞衍生自炎性T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞。在另一个实施方案中，所述细胞可以衍生自由CD4

在一个实施方案中，所述免疫调节性细胞可以是人免疫调节性细胞。

在一个实施方案中，所述免疫调节性细胞是同种异体的或自体的。应理解的是，“自体的”是指获得自患者本身的细胞，而“同种异体的”是指获得自供体的细胞。自体细胞具有它们与患者相容的优势，且因此避免导致移植物抗宿主病(GvHD)的任何免疫相容性问题。为了防止同种异体细胞被患者排斥，它们或者需要衍生自相容的供体，或者进行修饰以确保在细胞表面上不存在会起始有害的免疫应答的抗原。

在扩增和基因修饰本发明的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可以获得自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员可得和已知的任何数目的T细胞系。在另一个实施方案中，所述细胞可以衍生自健康供体或患病供体，诸如被诊断具有癌症或感染的患者。在另一个实施方案中，所述细胞是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的部分。

在用编码本文所述的CAR的多核苷酸或表达载体转导之前，可以活化和/或扩增免疫调节性细胞。例如，可以用抗CD3单克隆抗体处理细胞以引起活化。

应理解的是，所述免疫调节性细胞可以瞬时或稳定/永久表达本文所述的CAR(取决于所用的转染方法以及编码所述嵌合抗原受体系统的多核苷酸是否已经整合至免疫调节性细胞基因组中)。

在引入CAR之后，可以纯化免疫调节性细胞，例如通过选择表达非信号传导链的靶标结合结构域的细胞。

用途

根据本发明的一个进一步方面，提供了本文所述的免疫调节性细胞，其用于疗法中。在一个实施方案中，疗法包括将所述免疫调节性细胞施用于需要这种疗法的人受试者。

在一个实施方案中，所述疗法是过继细胞疗法。“过继细胞疗法”(或“过继免疫疗法”)是指人T淋巴细胞的过继转移，所述人T淋巴细胞通过基因转移工程改造以表达对于靶标细胞上表达的表面分子特异性的CAR(诸如本发明的CAR)。这可用于治疗多种疾病，这取决于选择的靶标、例如肿瘤特异性抗原(以治疗癌症)。过继细胞疗法涉及使用称为白细胞分离术的方法除去患者的白血细胞的一部分。然后可以将T细胞扩增并与本文所述的表达载体混合，以将所述CAR永久转移至T细胞。再次扩增T细胞，并且在扩增结束时，将T细胞洗涤，浓缩，且然后冷冻以留出时间用于测试，运输和储存，直至所述患者准备好接受工程改造的T细胞的输注。

本文所述的发明首次提供了HIV整合酶-LEDGF/p75相互作用在CAR中的用途。因此，根据本发明的一个进一步方面，提供了LEDGF/p75结构域和HIV整合酶结构域或其功能片段或变体作为嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法中的安全开关(例如，作为可诱导CAR的一部分)的用途。

药物组合物

根据本发明的一个进一步方面，提供了包含多种如本文所定义的免疫调节性细胞的药物组合物。

另外的药物组合物成分的实例包括但不限于任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、混悬剂、稳定剂、等张剂、溶剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲剂(诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS))、碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)、氨基酸、抗氧化剂或螯合剂(诸如EDTA或谷胱甘肽)。

在一个实施方案中，所述药物组合物另外包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。所述载体、赋形剂或稀释剂在与所述组合物的其他成分相容且对其受体无害的意义上必须是“可接受的”。根据本发明，使用的任何赋形剂、媒介物、稀释剂或添加剂必须与本文所述的CAR相容。可以查阅本领域中已知的标准文本，诸如“Remington’sPharmaceutical Science”，第17版，1985 (通过引用并入本文)，以制备合适的制剂。

药物组合物可以通过注射或连续输注(实例包括但不限于静脉内、肿瘤内、腹膜内、皮内、皮下、肌内和门静脉内)来施用。在一个实施方案中，所述组合物适合于静脉内施用。当施用本发明的治疗组合物(例如，含有如本文所述的基因修饰的免疫调节性细胞的药物组合物)时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(溶液、混悬剂、乳剂)。药物组合物可以适合于局部施用(其包括，但不限于，表皮、吸入、鼻内或眼部施用)或经肠施用(其包括，但不限于，经口或直肠施用)。

用于制备此类药物组合物的方法是本领域技术人员众所周知的。可以将其他赋形剂添加至所述组合物中，以适合于施用模式和所使用的特定蛋白。

用于施用本发明的组合物的有效剂量和治疗方案可以取决于诸如患者的年龄、重量和健康状态以及待治疗的疾病的因素。此类因素在主治医师的权限范围内。

根据本发明的一个进一步方面，提供了如本文所定义的药物组合物，其用于治疗或预防疾病。

在一个实施方案中，所述疾病选自：癌症、致病性免疫应答和感染。

根据本发明的一个进一步方面，提供了如本文所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

试剂盒

根据本发明的一个进一步方面，提供了试剂盒，其包含如本文所述的多核苷酸或表达载体。

根据本发明的一个进一步方面，提供了试剂盒，其包含如本文所述的免疫调节性细胞或药物组合物。

根据本发明的一个进一步方面，提供了试剂盒，其包含如本文所述的CAR。

方法

根据本发明的一个进一步方面，提供了工程改造免疫调节性细胞以表达本文所述的CAR的方法，其包括：

(a) 提供免疫调节性细胞；

(b) 将如本文所定义的多核苷酸或表达载体转导或转染至所述免疫调节性细胞中；和

(c) 在所述免疫调节性细胞中表达所述多核苷酸或所述表达载体。

在一个实施方案中，所述免疫调节性细胞获得自从患者分离的样品(即自体的)。在一个替代实施方案中，所述免疫调节性细胞获得自供体(即同种异体的)。

作为一个非限制性实例，所述CAR可以作为由如本文所述的表达载体编码的转基因引入。所述表达载体还可以含有选择标记，所述选择标记提供接受所述载体的细胞的鉴定和/或选择。

作为将编码所述CAR的多核苷酸引入细胞的结果，可以在细胞中原位合成多肽。或者，所述多肽可以在细胞外部产生，且然后向其中引入。用于将多核苷酸构建体引入细胞的方法是本领域中已知的，并且作为非限制性实例，包括其中将多核苷酸构建体整合至细胞的基因组中的稳定转化方法，或其中未将多核苷酸构建体整合至细胞的基因组中的瞬时转化方法，以及病毒介导的方法。所述多核苷酸可以通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等引入细胞中。例如，瞬时转化方法包括例如显微注射、电穿孔或颗粒轰击。考虑到在细胞中表达，所述多核苷酸可以包含在载体、更具体地质粒或病毒中。

如本文所用的术语“转染”、“转化”和“转导”可用于描述表达载体插入靶标细胞中。载体的插入通常被称为细菌细胞的转化和真核细胞的转染，尽管病毒载体的插入也可以被称为转导。技术人员还将意识到通常使用的不同的非病毒转染方法，其包括但不限于使用物理方法(例如电穿孔、细胞挤压、声穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如磷酸钙、高度分支的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如脂质转染)。许多转染方法要求质粒DNA的溶液与细胞接触，然后使其生长并针对标记基因表达进行选择。

一旦所述CAR已经被引入免疫调节性细胞，则所述细胞可以被称为“转化的免疫调节性细胞”。因此，根据本发明的一个进一步方面，提供了通过本文所述的方法获得的免疫调节性细胞。根据本文所述的方法的从转化的免疫调节性细胞获得的细胞系也在本发明的范围内。

根据本发明的一个进一步方面，提供了抑制受试者中的CAR的方法，其包括向所述受试者施用抑制LEDGF/p75 ̶ HIV整合酶结构域相互作用的药剂。

可以通过改变存在的破坏剂的量或存在所述破坏剂的时间量来调节通过本文所述的系统的CAR信号传导的水平。因此，在一个实施方案中，可以通过减少施用于受试者的破坏剂的剂量或降低其施用的频率来增加CAR细胞活化的水平。在一个替代实施方案中，可以通过增加该药剂的破坏剂量或施用于受试者的频率来降低CAR细胞活化的水平。

较高水平的CAR信号传导可能与疾病进展减少、但毒性活性增加相关，而较低水平的CAR信号传导可能与疾病进展增加、但毒性活性降低相关。

根据本发明的一个进一步方面，提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用如本文所定义的免疫调节性细胞或药物组合物。

在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在一个进一步实施方案中，所述癌症选自：血液癌、骨髓癌、淋巴癌、淋巴系统癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、食道癌、肾癌、大肠癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌或胃癌。在又一个进一步实施方案中，所述癌症是血液癌，例如选自：B细胞白血病、多发性骨髓瘤(MM)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非霍奇金氏淋巴瘤。

当本文所述的方法用于治疗癌症时，在一个实施方案中，所述方法在受试者中减少肿瘤细胞的数目，减少肿瘤大小和/或根除肿瘤。

在一个实施方案中，所述疾病是致病性免疫应答，诸如自身免疫性疾病、变态反应或移植物抗宿主排斥。自身免疫性疾病源于机体针对体内正常存在的物质和组织的异常免疫应答。这可以导致组织的损害或破坏，或器官生长或功能改变。自身免疫性疾病的实例包括，但不限于：1型糖尿病、关节炎(包括青少年、牛皮癣性、反应性和类风湿性关节炎)、牛皮癣、多发性硬化症、血管炎、斑秃、恶性贫血、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性胰腺炎、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、肖格伦氏综合征、乳糜泻、克罗恩氏病和韦格纳氏综合征。

在一个实施方案中，所述疾病是感染。感染可以由病原体、诸如细菌、病毒、寄生虫、原生动物或真菌引起。在一个进一步实施方案中，所述感染是病毒或细菌感染。

在一个实施方案中，所述受试者是人。

治疗和/或预防的方法可以包括以下步骤：

(a) 提供一种或多种免疫调节性细胞；

(b) 将如本文所定义的多核苷酸或表达载体转导或转染至所述一种或多种免疫调节性细胞中；

(c) 在所述一种或多种免疫调节性细胞中表达所述多核苷酸或所述表达载体；和

(d) 将所述一种或多种免疫调节性细胞施用于患者。

可以将本文所述的免疫调节性细胞或药物组合物施用于已经具有疾病的患者，以减轻、减少或改善与所述疾病相关的至少一种症状和/或减慢、减少或阻断所述疾病的进展(即治疗性地)。本文所述的免疫调节性细胞或药物组合物可以施用于尚未患有所述疾病和/或未显示所述疾病的任何症状的患者，以预防所述疾病的原因(即，预防性地)。所述患者可具有发展所述疾病的倾向，或被认为处于发展所述疾病的风险中。

在一个实施方案中，所述方法另外包括施用破坏本文所述的CAR的LEDGF/p75 ̶ 和HIV整合酶结构域之间的相互作用的药剂。所述药剂可以在所述免疫调节性细胞/药物组合物之前或同时(即，在上文概述的治疗方法步骤中的步骤(d)之前或期间)向所述患者施用，以便施用呈其“非活性”(即，OFF)状态的CAR。然后可以减少药剂的量以活化CAR。以其非活性状态施用CAR允许实现免疫调节性细胞的均匀分布，因此防止活化细胞的局部积累。

或者，可以在施用所述免疫调节性细胞/药物组合物之后(即，在上文概述的治疗步骤的方法中的步骤(d)之后)将所述化合物施用于所述患者，使得以其“活性”(即ON)状态施用CAR。

所述药剂可以药物组合物的形式施用。在该实施方案中，所述组合物可以另外包含如本文概述的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

如本文所述，本发明提供了待与CAR-T细胞疗法一起使用的可逆的OFF开关。所述方法可以涉及监测患者中的毒性活性。因此，如果毒性活性的水平变得太高，则所述方法可以涉及施用抑制LEDGF/p75 ̶ HIV整合酶相互作用的药剂，以减少不良的毒性副作用。毒性活性包括，例如，免疫毒性、胆毒性和呼吸窘迫综合征。

类似地，所述方法可以涉及监测疾病的进展，且然后当达到可接受水平的疾病进展时，施用抑制LEDGF/p75 ̶ HIV整合酶相互作用的药剂(例如改善)。确定为“可接受”的疾病进展的特定水平将根据特定环境而不同，并且应在此基础上进行评价。

监测所述疾病的进展意指随着时间评价与疾病相关的症状，以确定它们是否正在减少/改善或增加/恶化。

根据本发明的一个进一步方面，提供了适合用于抑制如本文定义的CAR的药剂。

将理解的是，本文所述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都如同完全阐述的一样通过引用并入。

实施例

实施例1. 嵌合抗原受体的构建，所述嵌合抗原受体并入充当OFF-开关控制元件的HIV整合酶和人LEDGF/p75的结构域。

用LEDGF/p75和HIV整合酶元件制备的CAR能够以抗原特异性方式活化T-细胞NFAT信号传导级联，条件是将信号传导和抗原结合链两者均拴系至细胞膜。通过LEDGIN化合物BI224436的存在来调节用OFF-开关CAR转染的Jurkat细胞的NFAT活化信号。

材料和方法

构建体的生成：将以下构建体克隆至pG3载体中。图1中显示构建体的示意图，并且在下面给出所述构建体的完整序列细节。

构建体1 (SEQ ID NO:21) :

构建体1的说明

构建体2 (SEQ ID NO:22):

说明如对于构建体1所述。

构建体3 (SEQ ID NO:23)

说明如对于构建体1所述。

构建体4 (SEQ ID NO:24)

说明如对于构建体1所述。

构建体5 (SEQ ID NO:25)

用构建体转染Jurkat细胞和NFAT-荧光素酶测定

将NFAT-luc2 Jurkat细胞(Promega)在以下Jurkat培养基中进行培养：没有L-谷氨酰胺且具有酚红(Gibco)、10% (v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)(Gibco)、1% (v/v)最小基本培养基非必需氨基酸(MEM NEAA) (ThermoFisher)、1% (v/v)丙酮酸钠(Sigma)、1% (v/v) L-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI培养基1640 (1x)。将ARH-77-10B5细胞在Jurkat培养基加1mg/mL G418 (Thermo, 10131035)中培养。将细胞在37℃与5% CO

结果

构建体1至4编码OFF-开关CAR，其中靶标结合结构域(抗BCMA scFv)与人LEDGF/p75结构域或HIV整合酶结构域融合(图1)。在这些构建体中，所述信号传导链没有拴系至质膜。当用抗原呈递细胞刺激时，构建体1-4显示没有NFAT活化或低NFAT活化，并且BI224436(HIV整合酶的小分子结合剂，其抑制HIV整合酶与LEDGF/p75的结合)的添加没有降低活化的水平(图2)。构建体5编码OFF-开关CAR，其中所述信号传导链经由与CD8α跨膜结构域的融合而拴系至质膜。当用表达抗原的细胞(ARH-77-10B5)呈递时，构建体5活化Jurkat细胞中的NFAT，并且在BI224436存在的情况下，NFAT活化减少。

实施例2. 通过并入HIV整合酶增溶突变来提高含有off-开关元件的嵌合抗原受体的活化。

可以通过引入Jenkins等人(1995) PNAS Vol. 92, pp 6057-6061中描述的一种HIV整合酶突变来提高LEDGF/p75和HIV整合酶OFF-开关CAR以抗原特异性方式活化NFAT启动子的能力。该突变是整合酶结构域中的苯丙氨酸185取代为赖氨酸(F185K)。该突变对应于具有Uniprot条目P12497的HIV Gag-Pol多蛋白上的苯丙氨酸1332。

构建体的生成：构建体5在实施例1中生成。将以下构建体克隆至pG3载体中。下面给出构建体的完整序列细节。

构建体6 (SEQ ID NO:26):

用构建体转染Jurkat细胞和NFAT荧光素酶测定

方法描述于实施例1。

结果

相对于构建体5，构建体6中的野生型HIV整合酶苯丙氨酸1332 (Uniprot条目P12497)向赖氨酸的突变导致Jurkat细胞中的NFAT启动子的活化增加三倍(图3)。在构建体5和6两者中都保持了化合物BI224436对NFAT的下调的作用。

实施例3.

通过将LEDGF/p75结构域交换至抗原结合链来提高含有OFF-开关元件的嵌合抗原受体的活化。

通过使LEDGF/p75结构域与抗原结合链融合并且使HIV整合酶结构域与信号传导链融合，可以进一步提高LEDGF/p75和HIV整合酶OFF-开关CAR活化NFAT启动子的能力。

构建体的生成：构建体6在实施例2中生成。将以下构建体克隆至pG3载体中。下面给出构建体的完整序列细节。

构建体7 (SEQ ID NO:27):

说明如对于构建体6所述。

用构建体转染Jurkat细胞和NFAT-荧光素酶测定：方法描述于实施例1。

结果

与构建体6 (其中HIV整合酶结构域与抗原结合链融合且LEDGF/p75与信号传导链融合)相比，构建体7 (其中LEDGF/p75结构域与抗原结合链融合且HIV整合酶结构域与信号传导链融合)中的NFAT活化高超过4倍(图4)。在构建体6和7两者中都保持了化合物BI224436对NFAT的下调的作用。

实施例4. 通过改变人LEDGF/p75结构域来提高具有OFF-开关元件的CAR的表达水平。

可以通过突变LEDGF/p75结构域来提高OFF-开关CAR的表达水平。生成五种LEDGF/p75工程改造的变体：三种变体包括向构建体7 C-末端添加非结构化(基于PDB条目1Z9E)野生型LEDGF/p75序列，且其他两种变体包括增强OFF-开关CAR的表达的新型点突变。

构建体的生成：构建体7在实施例3中生成。将以下构建体克隆至pG3载体中。下面给出构建体的完整序列细节。

构建体8 (SEQ ID NO:28)

说明如对于构建体7所述，除了：

构建体9 (SEQ ID NO:29)

说明如对于构建体7所述，除了：

构建体10 (SEQ ID NO:30)

说明如对于构建体7所述，除了

构建体11(SEQ ID NO:31):

说明如对于构建体7所述，除了：

构建体12 (SEQ ID NO:32)：该构建体在构建体8的LEGF/p75结构域的C-末端将LEDGF/p75残基亮氨酸428突变为谷氨酰胺，并将残基缬氨酸429突变为谷氨酰胺。

说明如对于构建体7所述，除了：

慢病毒载体产生、Jurkat细胞的转导和流式细胞术：对于慢病毒载体产生，将3.0x10

Jurkat细胞如实施例1中所述生长。在转导之前，将细胞分至2x10

结果

LEDGF/p75的C-末端部分的延伸(构建体8、9和10)以及LEDGF/p75残基428和429的突变(构建体11和12)，导致表达HIV LEDGF/p75 OFF-CAR的细胞的百分比的增加(图5)。

实施例5. 用HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-CAR转导的原代T-细胞的细胞因子释放。

当用抗原呈递细胞刺激时，用HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-CAR转导的原代T-细胞以细胞因子释放的形式产生功能性应答。BI224436的添加负性调节细胞因子释放。

材料和方法

原代T-细胞转导和细胞因子释放：通过在含有15mL Histopaque-1077 (Sigma)的Accuspin管(Sigma)中通过密度梯度离心且遵循制造商的说明，从两个健康人供体的新鲜血液分离外周血单核细胞(PBMC)。将细胞以1x10

用编码构建体10和构建体11的慢病毒载体转导来自两个供体的T-细胞。制备转导反应以达到5的MOI。将T-细胞在具有100单位/mL IL-2的TEXMacs培养基(MiltentyiBiotec)中培养，每3天添加新鲜培养基。ARH-77-10B5细胞如实施例1所述培养。将100%DMSO中的100 mM的储备浓度的BI224436化合物在Jurkat培养基中稀释，以达到100μM的储备浓度。将每种T-细胞群体在Jurkat培养基中以10 µM或0 µM(仅培养基)BI224436的最终浓度在37℃与5% CO

结果

在用BCMA阳性细胞(ARH-77-10B5)刺激后，用OFF-开关CAR(构建体10和11)转导的原代T-细胞释放细胞因子TNF-α、IL-2和IFN-γ (图6)。在所有情况下，通过添加BI224435化合物，减少了细胞因子释放。

实施例6. 调节用HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-CAR转导的原代T-细胞的细胞因子释放水平

可以通过BI224436的浓度来调节用HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-开关CAR转导的原代T-细胞的细胞因子释放。使用在信号传导链上具有Myc-标签的OFF-开关CAR。

材料和方法

构建体的生成：将构建体13克隆至pG3载体中。下面给出构建体的完整序列细节。

构建体13 (SEQ ID NO:33)：该构建体等同于构建体10，其中用Myc-标签替代3xFlag标签。

说明如对于构建体10所述，除了：

慢病毒载体产生和原代T-细胞的转导：用于慢病毒产生的方法描述于实施例4中，并且用于原代T-细胞转导的方法描述于实施例5中。

细胞因子释放：ARH-77-10B5细胞如实施例1中所述培养。将100% DMSO中的100 mM的储备浓度的BI224436化合物稀释于Jurkat培养基中，以达到100 µM的储备浓度。将每种T-细胞群体在Jurkat培养基中在10 µM、3.3 µM、1.1 µM、0.37 µM、0.12 µM、0.04 µM、0.013µM、0.004µM、0.001µM或0µM(仅培养基) BI224436的最终浓度在37℃与5% CO

结果

当用BCMA阳性细胞(ARH-77-10B5)呈递细胞刺激时，BI224436的浓度调节从用OFF-开关CAR (构建体13)转导的原代T-细胞释放的TNF-α、IL-2和IFN-γ的水平(图7)。BI224436的IC50浓度为100 nM。该浓度比200 mg口服剂量的BI224436后24小时后的人受试者的血浆中达到的BI224436浓度相比低10倍 (临床试验ID NCT01276990，作为会议报告http://www.natap.org/2011/ICAAC/ICAAC_35.htm呈现的分析)。

实施例7. 用HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-开关CAR转导的原代T-细胞的细胞毒性。

HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-开关CAR活化细胞毒性应答，并且化合物BI224436的存在减弱细胞毒性。

材料和方法

原代T-细胞的转导：实施例5中描述的方法

xCelligence细胞毒性测定：ARH-77-10B5细胞如实施例1中所述。将100% MSO中的100 mM的储备浓度的BI224436化合物稀释于Jurkat培养基中，以达到100 μM的储备浓度。通过遵循制造商对于B-细胞杀伤(抗CD40)测定试剂盒(ACEA, 8100004)的说明，将xCelligence E-板(ACEA, 06472460001)用抗CD40拴系剂包被。将板插入xCelligence站(ACEA)(37℃，5% CO

结果

用OFF-开关CAR(构建体10)转导的原代T-细胞诱导针对BCMA-阳性细胞(ARH-77-10B5)的细胞毒性应答(图8)。在化合物BI224436存在的情况下，应答降低。

实施例8.

BI224436对用HIV整合酶LEDGF/p75 OFF-开关CAR或等同的常规CAR转导的原代T-细胞的细胞毒性的影响

OFF-开关CAR的抗原特异性细胞毒性与等同的常规CAR相当，并且BI22436仅减弱OFF-开关CAR的细胞毒性。来自OFF-开关CAR的基本CAR组分(抗BCMA scFv，CD8-α铰链和跨膜，4-1BB和CD3-ζ)用于生成等同的常规单链CAR。

材料和方法

构建体的生成：将构建体14克隆至pG3载体中。下面给出构建体的完整序列细节。

构建体14 (SEQ ID NO:52)：该构建体是常规的单链CAR，并使用来自构建体10的组分。

慢病毒载体产生：方法描述于实施例4中。

CD4+和CD8+ T-细胞的分离和转导：通过在含有15 mL Histopaque-1077 (Sigma)的Accuspin管(Sigma)中通过密度梯度离心且遵循制造商的说明，从一个健康人供体的新鲜血液分离外周血单核细胞(PBMC)。使用CD4和CD8微珠(Miltenyi Biotec)和AutoMACSPro-separator (Miltenyi Biotec)分离CD4+和CD8+ T-细胞。将细胞以1x10

T-细胞用编码构建体14或构建体10的慢病毒载体转导。将转导的T-细胞和未转导的(UT) T-细胞在具有100单位/mL IL-7 (Sigma)和IL-15 (Sigma)的TEXMacs培养基(Miltenyi Biotec)中培养，并且每3天添加新鲜培养基。制备转导反应以实现在构建体14和构建体10之间相当的CAR表达水平。1x10

在Jurkat培养基加0.8 mg/mL G418 (Gibco)中培养K562 BCMA细胞(BCMA阳性)，并且在Krkat培养基中培养K562细胞(BCMA阴性)。两种细胞系均在37℃与5% CO

结果：用OFF-开关CAR(构建体10)转导的原代T-细胞和用等同的常规CAR(构建体14)转导的原代T-细胞杀死BCMA-阳性细胞(K562 BCMA)，但不杀死BCMA-阴性细胞(K562WT) (图9B)。BI224436没有影响常规CAR(构建体14)的细胞毒性，但有效地减弱OFF-开关CAR (构建体10)的细胞毒性。