一种检测替格瑞洛抗血小板效果的试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，尤其涉及一种检测替格瑞洛抗血小板效果的试剂盒。

背景技术

2018年中国心血管病报告指出，目前我国冠心病患者约为1100万。急性冠脉综合征是冠心病的严重类型，是致死致残的主要原因。随着社会的进步,预期寿命的逐渐延长,急性冠脉综合征已经成为威胁人类健康的难题,是发展中国家患病和死亡的主要原因。急性冠脉综合征是指冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂或糜烂继发新鲜血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征,涵盖了ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定性心绞痛。血小板活化及其聚集在冠状动脉血栓形成中起主导作用，因此抗血小板治疗是急性冠脉综合征治疗的关键。当诊断为急性冠脉综合征时，应尽早进行抗血小板治疗，以降低心血管事件的发生风险。

然而，随着抗血小板药物在临床上的广泛应用，部分患者开始在治疗期间出现药物抵抗、疗效不足、出血或血栓风险较高等现象，而这种现象被称为临床抵抗或实验室抵抗。由于这种现象的出现，个体化用药也逐渐被人们所重视，包括遗传因素在内，急性冠脉综合征患者的抗血小板个体化治疗需要考虑多种因素，如环境因素、遗传因素、患者依从性等。因此，基因多态性即遗传因素在抗血小板个体化治疗中举重若轻。目前为止，在被发现的所有人类基因组的多态性类型中，单核苷酸多态性是最为常见的，也被认为是绝大多数个体间发生遗传变异背后的主要原因。

研究表明，凝血酶可以通过切割和连接F2R样凝血酶/胰蛋白酶受体3(F2RL3)激活血小板，使血小板释放二磷酸腺苷等激动剂，而ADP与血小板P2Y12受体结合在血小板活化和聚集中发挥重要作用，P2Y12受体经ADP结合后，可激活一系列下游蛋白,引起血小板表面膜糖蛋白结构发生改变,使其与粘附蛋白结合，从而启动血小板聚集。因此，F2RL3在血小板活化中起关键作用，而F2RL3由F2RL3基因编码，它位于人的19号染色体，定位于p12。

血小板可以被三种药物抑制，每种药物都有不同的作用机制。阿司匹林可以靶向环氧化酶，抑制血栓素A2的形成，并诱导血小板功能性永久性抑制，然而，为了确保有效治疗和预防冠状动脉血栓形成，必须抑制其他的血小板聚集途径。而P2Y12受体拮抗剂是急性冠脉综合征的主要治疗药物。像氯吡格雷或普拉格雷这类噻吩并吡啶类药物，可以被生物转化为不可逆地结合到P2RY12受体的分子，而新型药物如替格瑞洛，它无需生物转化即可与P2RY12受体可逆性结合，从而拮抗ADP信号传导和血小板活化。

替格瑞洛，以前称AZD6140，是一种新近研发的可逆性P2Y12受体拮抗剂，其血浆半衰期为12小时，可以与ADP竞争性结合P2Y12受体，抑制ADP诱导的血小板聚集，从而发挥抗血小板作用，而其P2Y12受体抑制水平取决于替格瑞洛的血浆水平，在较小程度上，它是一种活性代谢产物。研究表明，相比较氯吡格雷，替格瑞洛不仅可以在不增加致命性出血风险的同时降低心血管事件发生率，并且其抑制血小板聚集的速度更快，效果更好，且可变性更小，具有明显的优势。

目前，关于替格瑞洛抗血小板活性是否受F2RL3基因多态性影响的研究很少，结果也不一致。因此，研究基因多态性对替格瑞洛抗血小板效果的影响具有显著的临床意义。查阅国内外文献发现，F2RL3基因多态性与替格瑞洛抗血小板效果密切相关，在抗血小板过程中发挥关键作用。美国学者Whitley等人通过对健康人群血小板功能评估及基因分型发现，F2RL3基因中SNP rs773902可以改变体外凝血酶诱导的血小板反应性，并且发现替格瑞洛可以消除rs773902A等位基因带来的的血小板高反应性这一特性。然而，这一结论仅限于体外试验，仍需在体内研究及其他人种、性别、疾病状态的人群中加以证实。

目前基因型主要是通过基因测序得到，基因测序的准确率高，但是其价格高昂，测序时间较长，所以基因测序大规模应用到临床目前仍然是不太现实的，可能会带给病人和社会带来额外费用和过重的经济负担，所以仍然需要有经济实用的检测试剂盒替代基因测序。

发明内容

本发明提供一种检测替格瑞洛抗血小板效果的试剂盒，以解决通过基因测序检测基因型时，存在的价格高昂，测序时间较长，不适合临床使用的问题。

本发明采取的技术方案是：包括下列试剂：

rs773902管一：

染色剂：

正向引物1：5ul

反向引物1：5ul

ddH

rs773902管二：

染色剂：

正向引物2：5ul

反向引物2：5ul

ddH

标准品1管三：

rs773902AA基因型DNA：10ul

标准品2管四：

rs773902AG基因型DNA：10ul

标准品3管五：

rs773902AG基因型DNA：10ul。

所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

5'-ACCTCGTCTGCCCTCCACCAT-3'；

所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

5'-CCAGGAGCAGCAGGAGGTCAGCATC-3'；

所述反向引物1的3’末端独特尾巴序列为最后一个碱基C；

所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：

5'-TGCTGCTGATGAACCTCGCGA-3'；

所述正向引物2的3’末端独特尾巴序列为最后一个碱基A；

所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：

5'-AGTGCCAGCAGGAGGTCAGCAGT-3'；

所述反向引物2的3’末端独特尾巴序列为最后一个碱基T。

本发明是针对急性冠脉综合征患者替格瑞洛抗血小板效果评价及用药指导的实时荧光定量(qPCR)检测方法，通过对F2RL3基因中rs773902G＞A多态性进行了研究，并分析各基因型与替格瑞洛抗血小板疗效的相关性，设计了一种便捷可行的检测试剂盒，该试剂盒的优点：设计的特异性的qPCR检测试剂盒可用来检测单核苷酸多态性(SNP)位点基因型，检测结果和测序结果完全吻合，且十分快速方便，同时也在患者的经济承受范围之内，可以作为临床检测的一种可行手段，本试剂盒可以检测F2RL3基因中rs773902G＞A位点，设计的引物经过多次优化修饰，特异性高，避免了引物二聚体的出现，并具有成本低、耗时短、结果分析简单便捷、应用广泛的特点。

附图说明

图1是rs773902G＞A，AA基因型溶解曲线图；

图2是rs773902G＞A，AG基因型溶解曲线图；

图3是rs773902G＞A，GG基因型溶解曲线图；

图4是等位基因与引物图；

图5是目标SNP在样本DNA中的位置图；

图6是等位基因-1与样本DNA正确匹配结合并延伸图；

图7是反向引物的延伸图。

具体实施方式

包括下列试剂：

rs773902管一：

染色剂：

正向引物1：5ul

反向引物1：5ul

ddH

rs773902管二：

染色剂：

正向引物2：5ul

反向引物2：5ul

ddH

标准品1管三：

rs773902AA基因型DNA：10ul

标准品2管四：

rs773902AG基因型DNA：10ul

标准品3管五：

rs773902AG基因型DNA：10ul。

所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

5'-ACCTCGTCTGCCCTCCACCAT-3'；

所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

5'-CCAGGAGCAGCAGGAGGTCAGCATC-3'；

所述反向引物1的3’末端独特尾巴序列为最后一个碱基C；

所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：

5'-TGCTGCTGATGAACCTCGCGA-3'；

所述正向引物2的3’末端独特尾巴序列为最后一个碱基A；

所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：

5'-AGTGCCAGCAGGAGGTCAGCAGT-3'；

所述反向引物2的3’末端独特尾巴序列为最后一个碱基T。

本检测方法包括：

(1)、针对F2RL3基因中的rs773902G＞A设计了2对在3’末端带有独特尾巴序列的等位基因特异性正向引物和反向引物；

(2)、分别将人体DNA样本加入预混液中(SuperMIX、正向引物、反向引物、ddH2O)；

(3)、上机，设定扩增条件，进行DNA产物扩增；

(4)、根据熔解曲线，分析基因型，评价替格瑞洛抗血小板疗效，指导用药。

下边通过实验例来进一步说明本发明。

1.PCR引物序列：

2.试剂及DNA模板置于冰上，PCR条件反应体系如下：

3.室温下将96孔PCR反应板放入离心机3000r，离心2min后置于PCR仪器中进行检测。

4.PCR循环程序如下:

5.结果读取，进行基因分型：

由图1可见，在Tm82℃处出现峰值为3.2左右的特异性溶解曲线及Tm85℃处出现峰值为0.9左右的特异性溶解曲线，表示该样本基因型为AA；

由图2可见，在Tm82℃处出现峰值为2.8左右的特异性溶解曲线及Tm85℃处出现峰值为1.2左右的特异性溶解曲线，表示该样本基因型为AG；

由图3可见在Tm82℃处出现峰值为2.3左右的特异性溶解曲线及Tm85℃处出现峰值为1.9左右的特异性溶解曲线，表示该样本基因型为GG；

每次对样本DNA进行基因测序时均需同时对标准品1、2、3，即管三、四、五进行qPCR检测，由于标准品1、2、3对应的基因型分别为AA型、AG型、GG型，所以，当样本DNA检测所得溶解曲线与标准品溶解曲线形状类似且峰值相近时，该样本DNA基因型即为对应标准品基因型。其中，正、反向引物1所测等位基因为G等位基因，若样本DNA溶解曲线峰值与标准品1溶解曲线一样峰值最低则表示该样本DNA其中一个等位基因为A等位基因；同理，正、反向引物2所测等位基因为A等位基因，若样本DNA溶解曲线峰值与标准品3溶解曲线一样峰值最低则表示该样本DNA其中一个等位基因为G等位基因。

基因测序的准确率高，但是其价格高昂，测序时间较长，本发明建立了特异性的qPCR检测试剂盒用于检测SNP基因型，而且设计的引物经过多次优化修饰，特异性高，避免了引物二聚体的出现。

原理：为了区别等位基因，分别设计了两对在3’末端带有独特尾巴序列的等位基因特异性正向引物和反向引物(见图4)，若目标基因型为纯合子，则其中一对引物形成的溶解曲线峰值最高，另一对引物形成的溶解曲线峰值最低；若为杂合子，则两对引物分别形成两条特异性峰值中等的熔解曲线。为了区别等位基因，设计的两对引物的大小片段不一，所以其熔解曲线峰值出现的温度(Tm)不同。图5为目标SNP，在PCR的第一轮中，等位基因-1引物与样本DNA中的目标SNP G等位基因正确匹配(图6)结合并且延伸，并通过反向引物扩增目标片段，随之进行第2轮PCR，序列不断被扩增，荧光信号不断增强，最终到达反应终点，可在溶解曲线中出现特异性的峰。若为纯合子，则产生一高一低两种特异性峰，若为杂合子，则与两组引物分别结合扩增，在不同的温度(Tm)处出现2个中等高度特异性峰，从而检测出该样本的基因型。

6、评价替格瑞洛抗血小板疗效，指导用药。

rs773902GG超快代谢型，药物疗效好，建议继续服用或减量服用；

rs773902AA、rs773902AG超慢代谢型，药物疗效差，建议换其他类型抗血小板药物。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种检测替格瑞洛抗血小板效果的试剂盒

<130> JLUWangJn

<141> 2021-04-03

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 1

acctcgtctg ccctccacca t 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 2

ccaggagcag caggaggtca gcatc 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 3

tgctgctgat gaacctcgcg a 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 4

agtgccagca ggaggtcagc agt 23