急性心肌梗死生物标志物及其应用

文献发布时间：2023-06-19 11:08:20

技术领域

本发明属于心肌梗死诊断研究领域，具体涉及急性心肌梗死生物标志物及其应用。

背景技术

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。

现有技术中用于诊断急性心肌梗死的方法包括：(1)心电图特征性改变为新出现Q波及ST段抬高和ST-T动态演变；(2)心肌坏死血清生物标志物升高，肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌钙蛋白(T或I)升高。可于发病3～6小时开始增高，CK-MB于3～4d恢复正常，肌钙蛋白于11～14天恢复正常。关于心电图特征性改变的诊断方法，由于缺乏较大样本的临床对照研究，目前各个权威机构推荐的AMI的心电图诊断标准的灵敏度和特异性尚不清楚，没有统一标准，限制了其应用。一个血清蛋白标志物的检测特异性、准确性均不尽人意。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供急性心肌梗死生物标志物及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供血清外泌体来源的miR-532-5p和/或miR-766-5p用于制备急性心肌梗死诊断产品的用途。

本发明第二方面，提供特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂用于制备急性心肌梗死诊断试剂盒的用途。

本发明第三方面，提供一种急性心肌梗死检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括急性心肌梗死检测试剂，所述急性心肌梗死检测试剂选自特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现血清外泌体来源的miR-532-5p和/或miR-766-5p可作为诊断急性心肌梗死的诊断标志物，miR-532-5p和/或miR-766-5p作为诊断急性心肌梗死或预后判断急性心肌梗死的标志物，使急性心肌梗死诊断更加准确、快速，特异性高、灵敏度好。

附图说明

图1血清中外泌体的鉴定分析(A透射电镜检测结果；B.纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测结果)。

图2A血清外泌体差异性表达miRNA的火山图(红色代表上调，绿色代表下调)。

图2B血清外泌体差异性表达miRNA的层次聚类分析图(颜色越红代表上调倍数越大，越蓝色代表下调倍数越大)。

图3 qRT-PCR验证表达倍数前5个血浆外泌体差异性表达miRNAs的相对表达水平。

图4A血浆外泌体来源hsa-miR-766-5p用于急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的诊断效能-ROC曲线图。

图4B血浆外泌体来源hsa-miR-532-5p用于急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的诊断效能-ROC曲线图。

图4C血清血超敏肌钙蛋白用于急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的诊断效能-ROC曲线图。

图5外泌体差异性表达miRNAs靶基因的KEGG通路分析图。

具体实施方式

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明一实施例为血清外泌体来源的miR-532-5p和/或miR-766-5p用于制备急性心肌梗死诊断产品的用途。

具体的，血清外泌体来源的miR-532-5p和/或miR-766-5p作为生物标志物。

miR-532-5p的Accession号为：NR_030241.2。

miR-766-5p的Accession号为：LM383020.1。

所述急性心肌梗死诊断产品用于急性心肌梗死的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估；

急性心肌梗死的预后评估是指对急性心肌梗死病人的病程和/或结局进行预后判断。

所述急性心肌梗死诊断产品包括急性心肌梗死检测试剂，所述急性心肌梗死检测试剂为特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂。

需要说明的是，所述急性心肌梗死检测试剂并不限定为必须为液体形式。

进一步的，所述急性心肌梗死检测试剂是指是指用于检测样本中miR-532-5和/或miR-766-5p表达量的试剂，根据检测结果以对病人是否患有急性心肌梗死、选择何种治疗方案和/或病人的病程和/或结局进行预后判断。

所述样本可以为待检测者血浆RNA样本。

所述miR-532-5p和/或miR-766-5p源于患者的外泌体。

在一种实施方式中，所述特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂选自以下任一种或多种：

1)特异性扩增miR-532-5p和/或miR-766-5p的引物对；

2)特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的探针。

在一种实施方式中，当特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂选自特异性扩增miR-532-5p和/或miR-766-5p的引物对时，所述特异性扩增miR-532-5p和/或miR-766-5p的引物对包括：

如SEQ ID NO：1所示的特异性扩增miR-532-5p的上游引物序列；具体的，CCTTGAGTGTAGGACCGTAA。

如SEQ ID NO：2所示的特异性扩增miR-532-5p的下游引物序列；具体的，CATGCCTTGAGTGTAGGACCGT。

如SEQ ID NO：3所示的特异性扩增miR-766-5p的上游引物序列；具体的，AGGAATTGGTGCTGGTCTTAA。

如SEQ ID NO：4所示的特异性扩增miR-766-5p的下游引物序列。具体的，AGGAGGAATTGGTGCTGGTCTT。

本发明一实施例提供特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂用于制备急性心肌梗死诊断试剂盒的用途。

所述特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂选自以下任一种或多种：

(1)特异性扩增miR-532-5p和/或miR-766-5p的引物对；

(2)特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的探针。

如SEQ ID NO：1所示的特异性扩增miR-532-5p的上游引物序列；

如SEQ ID NO：2所示的特异性扩增miR-532-5p的下游引物序列；

如SEQ ID NO：3所示的特异性扩增miR-766-5p的上游引物序列；

如SEQ ID NO：4所示的特异性扩增miR-766-5p的下游引物序列。

本发明一实施例的急性心肌梗死检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括急性心肌梗死检测试剂，所述急性心肌梗死检测试剂选自特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂。

在一种实施方式中，所述特异性识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的试剂选自以下任一种或多种：

(1)特异性扩增miR-532-5p和/或miR-766-5p的引物对；

(2)特异识别miR-532-5p和/或miR-766-5p的探针。

如SEQ ID NO：1所示的特异性扩增miR-532-5p的上游引物序列；

如SEQ ID NO：2所示的特异性扩增miR-532-5p的下游引物序列；

如SEQ ID NO：3所示的特异性扩增miR-766-5p的上游引物序列；

如SEQ ID NO：4所示的特异性扩增miR-766-5p的下游引物序列。

所述试剂盒可以是实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。

除了采用本发明的引物，本发明对PCR反应体系中其它各组分及其终浓度没有特别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR反应体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。

基于本发明所述试剂盒是采用实时荧光定量PCR技术来进行检测的，所述试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的各组引物对，也可以是含有配置好的含有各组引物对的PCR检测混合液。

实施例1

受试者选择:

入选标准：1)急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者组纳入标准参考2012版心肌梗死全球统一定义：血清心肌标志物，主要是肌钙蛋白升高，至少超过99％参考值上限，同时伴有CAG或CCTA证实冠状动脉内血栓形成，一支或一支以上冠状动脉主干或分支狭窄，程度大于70％；心电图ST段弓背向上抬高。

(2)健康对照组纳入标准：与实验组同性别，心电图无冠心病特点，血清心肌酶标志物，主要是肌钙蛋白正常，CAG或CCTA示冠状动脉管腔无任何异常狭窄。

排除标准：①罹患其他心脏疾病的患者，如风湿性心脏病，瓣膜性心脏病病或先天性心脏病等疾病的患者；②合并有以下疾病，如结缔组织病，急、慢性肾功能不全，恶性肿瘤，或其他免疫炎症参与或相关的疾病；③合并有栓塞性疾病，如弥漫性血管内凝血、肺栓塞、下肢动静脉栓塞、肠系膜动静脉栓塞等血管栓塞性疾病；④正在服用抗炎药物的患者，如NSAIDS和/或类固醇类药物。

1.实验步骤

1.1血浆外泌体的提取

采集病人空腹静脉血10mL，分离获得血清。

外泌体的分离步骤(SBI)：

1)取250μL血清样本，室温融化；

2)3000g离心15min，转移上清至新的1.5mL Eppendorf离心管中；

3)加入67μL的ExoQuick，轻弹管底，充分混匀，4℃静置30min；

4)4℃，3000g，离心10min，小心移除上清，注意不要碰到底部的沉淀；

5)200μL Buffer B重悬沉淀；

6)向获得的重悬液中加入200μL Buffer A，获得混合液；

7)取出纯化柱，将底部的帽剪掉(不可丢弃)，将纯化柱放入收集管中，1000g离心30秒；

8)丢掉收集管中的液体；

9)向纯化柱内加入500μL Buffer B，1000g离心30秒，丢掉收集管中的液体；

10)重复步骤8)一次；

11)将步骤6)剪下的帽扣在纯化柱底部，向纯化柱内加入100μL Buffer B；

12)将步骤5)中获得的混合液加入到纯化柱内，充分混匀(时间不可超过5min)；

13)将纯化柱底部的帽取下，立即放入新的1.5mL Eppendorf离心管中；

14)1000g离心30秒，离心管中所得液体即为分离的外泌体。

1.2外泌体粒径分析

提取的外泌体加入1mLPBS，混匀。使用纳米颗粒跟踪分析仪ZetaView-ParticleMetrix对外泌体颗粒的直径进行检测。

1.3外泌体投射电镜分析

向提取的外泌体中加入50～100μL2％多聚甲醛溶液。取5～10μL外泌体溶液滴于Formvar-carbon载样铜网上，室温下放置10min，然后使用PBS缓冲液清洗。先在铜网上使用50μL1％戊二醛液处理5min，再用100μL重蒸水洗8次，2min/次。然后用50μL草酸双氧铀液(pH7.0)处理5min。最后在冰上用50μL甲基纤维素液处理10min。空气干燥5～10min。将铜网放在样品盒里，80kV下调节合适的焦距及亮度并拍照。

1.4外泌体RNA的提取

使用RNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号217184)提取外泌体RNA。先向提取出的外泌体原液中加入600μL裂解液，室温孵育2min，3000g5min离心，取上清。加入氯仿，分层，取上层水相，再加入1.5倍体积100％乙醇，用移液器上下混匀。然后分批加到试剂盒提供的柱子里，8000g15s离心，倒掉废液，回收柱子。然后加入试剂盒的缓冲液到柱子上离心洗涤柱子。再加80％乙醇到柱子上8000g2min离心，离心后把柱子转移到一个新的无RNA酶EP管中，晾干柱子上的过滤膜，加入14μL洗脱液，8000g1min离心后，扔掉柱子，收集滤液，即为外泌体RNA，储存至-80℃冰箱。

1.9外泌体RNA高通量测序

首先对提取的外泌体RNA进行完整度、纯度、质量等的鉴定。合格后反转录合成cDNA第一条链，随后用RNA酶H降解RNA链，并在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、PCR扩增、纯化等步骤得到测序文库，利用IlluminaHiseq平台进行测序。去除测序原始数据中的接头、包含ploy-N的读长和低质量的读长得到干净数据。采用DESeq2R包(1.16.1)对mRNA进行差异表达分析，通过ClusterProfilerR包对差异表达的转录本进行基因本体(geneontoloty，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)信号通路富集分析。

1.10差异表达mRNA分析

用Audics软件对差异表达mRNA进行分析,并且使用Kobas 2.0软件对差异表达mRNA进行GO和KEGG信号通路分析。

1.11 qRT-PCR检测外泌体RNA在mRNA水平的表达

利用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMIX试剂盒将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录体系：总RNA，0.5μg；2×TS miRNA Reaction Mix，5μl；TransScrip miRNA RT Enzyme Mix，0.5μl；Nuclease-free H

引物设计：上海欧易生物医学科技有限公司设计并由北京擎科新业生物技术有限公司合成。引物序列见表1。

表1引物序列

荧光定量PCR：利用PerfectStartTM Green qPCR SuperMix试剂盒在

表达量的计算，采用2-ΔΔCt法。

1.12统计学方法

应用SPSS软件进行统计分析,正态分布数据用x±s表示,非正态分布数据用中位数及(P

2.结果分析

2.1获取3例ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者(徐州医科大学附属医院提供)的静脉血,作为STEMI组；3例健康人的静脉血，作为对照组，运用RNA-seq技术筛选STEMI组和健康对照组人体外周血外泌体miRNA的表达差异分析。

如图1中的A所示，经透射电镜观察发现患者血清外泌体的形态及大小是直径为30-250nm的圆形或椭圆形膜性囊泡，有双层膜性结构。

使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术进一步分析了所得外泌体的浓度和大小分布，结果如图1中的B所示，测得STEMI患者的外泌体浓度为7.3×10

RNA-seq技术筛选3例STEMI组和健康对照组人体外周血浆外泌体miRNA的表达差异分析：分析两组中共表达的外周血浆外泌体miRNA之间的差异，发现与对照组相比，STEMI组存在30个表达明显差异(log2 fold change>1.0,P<0.05)的miRNA，其中13个表达上调，17个表达下调(图2A-图2B)。

2.2从2.1中血清外泌体差异性表达miRNAs中筛选出上调倍数排名前5种miRNA(Novel-120,hsa-miR-766-5p,Novel-54,hsa-miR-657,hsa-miR-532-5p)在另外50例STEMI和健康人50例对照组(来自徐州医科大学附属医院和安徽省立医院)分别进行qRT-PCR验证(具体参数参见方法1.11)，结果如图3所示，表明2种miRNA(hsa-miR-766-5p和hsa-miR-532-5p)的表达水平在STEMI组较对照组显著升高(P＜0.01)。

2.3根据2.2中的50例STEMI和健康人50例对照组获得的数据，绘制hsa-miR-766-5p表达量的ROC曲线，hsa-miR-766-5p的灵敏度90.0％，特异度90.0％,ROC曲线下面积0.953；绘制hsa-miR-532-5p表达量的ROC曲线(图4B)，hsa-miR-532-5p的灵敏度72.0％，特异度96.0％,ROC曲线下面积0.897。临床目前诊断急性心肌梗死的血清血超敏肌钙蛋白的灵敏度92.0％，特异度92.0％,ROC曲线下面积0.954(图4C)。表明hsa-miR-766-5p、hsa-miR-532-5p两种miRNAs作为标志物，对于急性心肌梗死的诊断具有非常高的敏感性和特异性。

2.4血清外泌体差异性表达miRNAs的KEGG通路分析：对差异表达miRNAs进行了KEGG通路注释，结果如图5所示，显示差异表达miRNAs参与包括NF-κB、T细胞受体、Ras、MAPK等信号通路过程。

本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 张步春

<120> 急性心肌梗死生物标志物及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA