一种核壳纳米多聚物的制备方法及其在辅酶循环再生上的应用

技术领域

本发明涉及纳米材料领域，还涉及多酶共固定化和辅酶循环再生领域。

背景技术

氧化还原酶广泛应用于催化制备手性醇,羟基酸,氨基酸等方面。大多数的氧化还原酶催化反应都需要辅酶,在其所需辅酶中,NAD(P)

目前多酶在微尺度或纳米尺度等不同空间组织下的共固定化已经被报道，酶在DNA 支架上的空间定位，如DNA带、DNA链或DNA折叠，已被用于操作两或三酶级联。因此，对于多酶催化级联以及固定化多酶的可行性策略的研究在酶均相/非均相催化中具有重要作用。但是这种载体存在价格昂贵，操作复杂等问题限制其在实际应用中的发展。

目前关于单酶的封装和固定化的研究集中在提高封装酶的稳定性和催化活性上，并在催化代谢过程中的氧化还原反应和对底物的转化效率方面有了较深入的研究。关于多酶的共固定化以及联动体系的构建等仍需要进行大量的研究。多酶共固定化的局限性之一是无法正确地折叠大的多结构域蛋白，因此效率通常较低。尤其是多酶在固定化时或封装的同时往往会因为溶剂的作用而使活性位点损失，而合成金属骨架化合物纳米颗粒时的溶剂热、高温高压、超声辅助等条件对酶的活性位点影响较大。

以下是主要相关的文章和已经公开的专利，但明显与本申请文件不同，如表1：

表1 部分公开文章或专利与申请文件的区别

发明内容

本发明提供了一种用于核壳纳米聚合物的制备方法以及其在辅酶循环再生上的应用。本发明通过采用原位的方法利用材料的生长将不同尺寸的多种酶共固定化，利用多酶的反应催化过程中对不同状态下辅酶的转化实现辅酶的循环再生。

本发明所涉及的所有试剂均购买于试剂公司，如辅酶依赖性酶、辅酶、乙酸锌、硝酸锌、2-甲基咪唑、三乙胺、乙酸钴等。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种核壳纳米多聚物的制备方法，主要利用ZIF-8和ZIF-67晶体的生长特性，将两种辅酶依赖性酶、辅酶多聚物原位共固定化而得。

进一步，所述的制备方法的步骤中，在固定化辅酶时，将介孔硅表面进行羧基修饰后与辅酶的非活性位点结合实现辅酶的固定。

进一步，固定到同一核壳纳米体系中的两个辅酶依赖性酶分别为能够催化转化两种不同状态辅酶，即两个酶能分别进行脱氢和加氢从而实现辅酶的循环再生。当辅酶聚合物固定化辅酶为NAD

进一步，两种辅酶依赖性酶与辅酶聚合物的质量比为1:2-1:10。

进一步，所述的制备方法的步骤中，在15-25℃条件下磁力搅拌10-15h，以原位合成的方式进行多酶共固定，制备具有核壳结构的纳米多酶体系。

进一步，核壳多聚物的ZIF外壳，能够有效保护酶的稳定性，更重要的是ZIF材料具有亲和性将酶吸附到辅酶聚合物周围，减少了底物的扩散。

进一步，核壳多聚物依赖于所制备的纳米复合材料的限域效应，从而实现辅酶的高效率转化。

进一步，核壳多聚物在辅酶循环时，需要引发剂与底物的参与。若辅酶聚合物中固定的为NAD

本发明的有益效果

与游离条件下NAD

附图说明

图1位ZIF-8核壳多聚物的SEM和TEM图。

图2位ZIF-8核壳多聚物的CLSM图：FITC标记醇脱氢酶为乙醇脱氢酶，罗丹明标记乳酸脱氢酶。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的具体实施方式进一步的描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。

实施例1：

制备辅酶多聚物：称取2g羧基修饰后的介孔硅纳米粒子，在30mL去离子水中超声处理8-15 分钟后加入一定量的辅酶NAD

原位共固定多酶：将0.5-1mg乙醇脱氢酶、0.5-1mg乳酸脱氢酶、1-2mg MSN-NAD

辅酶循环：取100-150mM氯化钠，100-150μg/mL多聚物，2-3mM丙酮酸，20-30mM 乙醇，加入200μL PB缓冲溶液(100mM pH 7.4)。以等量的ADH、辅酶聚合物和LDH为对照。通过检测是否有乳酸的产生，监测核壳纳米体系下辅酶的循环再生效果。

本实施例核壳多聚物反应体系中，基于乙醇脱氢酶在引发剂乙醇的作用下转化NAD

实施例2：

称取2g基团修饰后的介孔硅纳米粒子，在30mL去离子水中超声处理8-15分钟后加入一定量的辅酶NADPH，在25-30℃下磁力搅拌。在5分钟内连续加入50mg水溶性碳二亚胺EDC，在加入过程中控制pH保持在7.4-8，在25-30℃下磁力搅拌25-30h。反应结束后，离心除去未反应的NADPH和其他杂质，用0.2M NaCl溶液洗涤，直至洗涤液中未检出NADPH。最后冷冻干燥得到固定化辅酶。分别利用ZIF-67和ZIF-8材料原位生长的方式将谷氨酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共固定化和辅酶聚合物封装。加入一定量的谷氨酸和6-磷酸葡萄糖引发体系内的辅酶循环和多酶级联反应。谷氨酸脱氢酶与体系内的NADPH的存在下催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和NADP