一种天然抗菌剂及其提取方法和应用以及诱导昆虫幼虫产生抗菌剂的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种天然抗菌剂及其提取方法和应用以及诱导昆虫产生抗菌剂的方法。

背景技术

昆虫是地球上最昌盛的群体，已知的种类超过了100万种，昆虫纲按照有无翅膀的特点分为无翅亚纲和有翅亚纲两大类。其中无翅亚纲体型较小，外观原始，没有翅膀，不具备变态的能力。有翅亚纲体型偏大，基本都长有翅膀(个别种类已经退化)，存在变态的成长过程。

目前已有从昆虫中提取抗菌肽或抗菌蛋白的相关文献和专利申请，例如中国专利申请CN110272474A公开了一种大麦虫天然抗菌蛋白的及其制备方法与应用，其中以大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌的菌液接种幼虫对幼虫进行诱导，对诱导后的提取其中的蛋白质得到抗菌蛋白。这种方法能诱导大麦虫幼虫产生抗菌蛋白，但是由于细菌的在幼虫体内的快速繁殖，不利于幼虫的生长甚至会导致幼虫的大量死亡，抗菌蛋白的得率也比较低。抗菌蛋白是一类蛋白质，与油脂是不同类型的物质，且两者的抗菌作用机制也不相同。昆虫幼虫中，油脂的含量很高，但是，目前对于幼虫的油脂是否均有抗菌效果并没有相关的报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种天然抗菌剂，来源于昆虫幼虫，是一种天然的广谱抗菌剂，可以广泛应用于多个领域。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种天然抗菌剂，该天然抗菌剂是从昆虫幼虫或者经过诱导处理后的昆虫幼虫虫体中提取的油脂。

作为进一步优选的方案，本发明所述的诱导处理的方法至少包括紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤中的两个步骤；其中

紫外光诱导步骤：按照预定时间对昆虫幼虫进行紫外光照射；

几丁质酶处理步骤：对昆虫幼虫虫体喷洒几丁质酶；

饲料诱导步骤：用添加有真菌、细菌、细菌脂多糖中至少一种成分的饲料喂养昆虫幼虫。

作为进一步优选的方案，本发明所述的紫外光诱导步骤中，经紫外线照射10-15s，强度为15-25W。

作为进一步优选的方案，本发明所述的几丁质酶浓度为300-500ppm。

作为进一步优选的方案，本发明所述饲料中真菌的添加量为10

作为进一步优选的方案，本发明所述的昆虫幼虫包括鞘翅目昆虫幼虫、双翅目昆虫幼虫以及鳞翅目昆虫。

本发明还提供了一种天然抗菌剂的提取方法，该提取方法包括

匀浆步骤：将活体的昆虫幼虫虫体中加入纯水，用高速组织匀浆机进行匀浆，离心后通过油水分离器分理处脂类物质；

溶剂提取步骤：将上述脂类物质中加入复合有机溶剂提取，得到提取液；

蒸发浓缩步骤：将上述提取液旋转蒸发仪浓缩，至有机溶剂蒸发完后，得到抗菌剂。

作为进一步优选的方案，本发明所述的匀浆步骤昆虫幼虫与纯水的质量比为1:5，匀浆的时间为10-15min，离心时转速为3000-3500r/min，离心时间为10-15min。

作为进一步优选的方案，本发明所述的复合有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚按照体积比为1：(1～5)：(1～3)：(1～3)比例混合后的有机溶剂。

一种诱导昆虫幼虫产生抗菌剂的方法，至少包括紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤中的两个步骤；其中

紫外光诱导步骤：按照预定时间对昆虫幼虫进行紫外光照射；

几丁质酶处理步骤：对昆虫幼虫虫体喷洒几丁质酶；

饲料诱导步骤：用添加有真菌、细菌、细菌脂多糖中至少一种成分的饲料喂养昆虫幼虫。

本发明还提供了一种天然抗菌剂，该天然抗菌剂是通过诱导方法处理获得的昆虫幼虫经过干燥粉碎后得到的虫体干粉。

本发明还提供了一种天然抗菌剂在制备动物饲料中的应用。该天然抗菌剂作为添加剂与动物饲料中。

发明还提供了一种天然抗菌剂在制备抗菌材料中的应用。该天然抗菌剂作为抗菌材料的有效成分用于制备抗菌材料。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的天然抗菌剂是来源于昆虫幼虫的，是一种天然的抗菌剂，具有广谱的抗菌效果。

2.本发明所述的天然抗菌剂来源于诱导的昆虫幼虫，本发明所采用的诱导方法是通过两种或两种以上的诱导相结合，相对于现有技术中直接用细菌接种幼虫或者注射的方式来说是一种缓和的诱导方式，能保证幼虫的生长促进大量油脂的产生；避免了细菌大量繁殖造成的污染和致使幼虫大量死亡。

3.本发明所述的天然抗菌剂采用复合有机溶剂进行提取，提高了油脂的得率，提取方法简单，容易操作。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

本发明所述的天然抗菌剂是从昆虫幼虫或者经过诱导处理后的昆虫幼虫虫体中提取的油脂。

具体的，本发明所述的诱导处理的方法至少包括紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤中的两个步骤；其中

紫外光诱导步骤：按照预定时间对昆虫幼虫进行紫外光照射10-15s，强度为15-25W。

几丁质酶处理步骤：对昆虫幼虫虫体喷洒几丁质酶，所述几丁质酶浓度为300-500ppm。

饲料诱导步骤：用添加有真菌、细菌、细菌脂多糖中至少一种成分的饲料喂养昆虫幼虫。

在本发明中，饲料诱导步骤所采用的饲料中添加了细菌、真菌、细菌脂多糖中的一种或两种以上的成分，在饲料中添加细菌、真菌或细菌脂多糖中能有效提高油脂的得率，也能明显提高油脂的抗菌效果。所述细菌的种类具体可以列举但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、链杆菌、球杆菌等，所述真菌中种类具体可列举但不限于霉菌、酵母、蕈菌等。所述饲料中真菌的添加量为10

采用紫外光照射对昆虫体表的表皮细胞造成损伤，引起昆虫机体动用能量或营养因子来修补，因此会刺激昆虫产生更多的抗菌油脂。由于昆虫体表有厚的角质层，含丰富几丁质，构成体表防御体系，几丁质酶处理后，能够溶解几丁质，导致体表损伤，细菌和真菌易引起昆虫感染，此时，昆虫会利用机体的脂类物质或免疫因子进行保护，势必分泌更多的有效抗菌成分应对外来侵害。而通过在饲料添加细菌、真菌或细菌脂多糖，通过肠道诱导，刺激昆虫肠道内和黏膜细胞上有丰富的免疫器官，发挥更大的效果，通过昆虫肠道微生物和外来细菌、真菌，相互发生排斥，机会也会动用肠道的免疫功能帮助防御外来侵害，这样使用自身分泌的抗菌物质就更多。在本发明中，优选的诱导处理的方法包括紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤中至少两个步骤的组合。优选的，采用紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤三个步骤的结合，其中步骤实施的顺序可以是紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤依次进行，也可以不依次进行，但是从本发明的效果来看，采用紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤依次进行诱导的方式是最佳的组合。

在本发明对昆虫幼虫诱导的过程中，紫外光照的时间和强度会影响抗菌油脂的得率。而且，紫外光强度太大，时间太长会造成昆虫体细胞死亡，进而影响诱导的效果。因此在本发明中，为了保证诱导效果和抗菌油脂的得率以及油脂的抗菌效果，在本发明，紫外光诱导时，紫外光照射10-15s，强度为15-25W。

进一步的，几丁质酶的浓度对油脂的得率和抗菌有存在影响，几丁质酶的浓度太小起不到诱导的作用，浓度太高也会导致昆虫幼虫死亡，进而影响诱导效果，因此，优选的，在本发明中当所述几丁质酶浓度为300-500ppm时，诱导的效果最佳。

作为进一步优选的方案，本发明所述的昆虫幼虫包括鞘翅目昆虫幼虫、双翅目昆虫幼虫以及鳞翅目昆虫。具体可以列举的鞘翅目昆虫包括大麦虫、黄粉虫、萤火虫、蜣螂、斑蝥、双叉犀金龟、吉丁虫、芫菁、金龟子、锹形虫、叩头虫、龙虱中的一种；其中，大麦虫和黄粉虫幼虫的脂肪含量较，而且也是目前确认安全的可食用幼虫，因此，在本发明中优选的方案，所述天然抗菌及来源于大麦虫幼虫和和黄粉虫幼虫。具体可以列举的双翅目昆虫包括黑水虻，蝇蛆、寄生蝇、食虫虻等，优选的以黑水虻幼虫，蝇蛆幼虫作为原料。

本发明还提供了一种天然抗菌剂的提取方法，该提取方法包括

匀浆步骤：将活体的昆虫幼虫虫体中加入纯水，用高速组织匀浆机进行匀浆，离心后通过油水分离器分理处脂类物质；

溶剂提取步骤：将上述脂类物质中加入复合有机溶剂提取，得到提取液；

蒸发浓缩步骤：将上述提取液旋转蒸发仪浓缩，至有机溶剂蒸发完后，得到抗菌剂。

作为进一步优选的方案，本发明所述的匀浆步骤昆虫幼虫与纯水的质量比为1:(3-10)，匀浆的时间为10-15min，离心时转速为3000-3500r/min，离心时间为10-15min。

作为进一步优选的方案，本发明所述的复合有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚按照体积比为1:(1～5):(1～3):(1～3)比例混合后的有机溶剂，优选的，复合有机溶剂中甲醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚的体积比为1:2:1:1。

一种诱导昆虫幼虫产生抗菌剂的方法，至少包括紫外光诱导步骤、几丁质酶处理步骤、饲料诱导步骤中的两个步骤；其中

紫外光诱导步骤：按照预定时间对昆虫幼虫进行紫外光照射10-15s，强度为15-25W；

几丁质酶处理步骤：对昆虫幼虫虫体喷洒几丁质酶；所述几丁质酶浓度为300-500ppm；

饲料诱导步骤：用添加有真菌、细菌、细菌脂多糖中至少一种成分的饲料喂养昆虫幼虫。

本发明还提供了一种天然抗菌剂，该天然抗菌剂是通过诱导方法处理获得的昆虫幼虫经过干燥粉碎后得到的虫体干粉。

本发明还提供了一种天然抗菌剂在制备动物饲料中的应用。该天然抗菌剂作为添加剂与动物饲料中。

发明还提供了一种天然抗菌剂在制备抗菌材料中的应用。该天然抗菌剂作为抗菌材料的有效成分用于制备抗菌材料。

以下是本发明具体的实施例，下述实施例只是对本发明的进一步说明，不能看作是对本发明范围的限制。

在下述实施例中，昆虫幼虫蜕皮一次即为1龄。

实施例1

取8龄左右的大麦虫和黄粉虫幼虫，分别置于养殖盘中常规饲养，用15W紫外灯照射10s后，移出养殖盘，恢复24小时后，向幼虫体表喷洒浓度为300ppm几丁质酶，作用时间为0.5h，用含浓度为0.03mg/kg细菌脂多糖(LPS)的饲料饲喂幼虫进行诱导，连续饲喂3天，收集虫体；虫体经洗净消毒处死，按1:5比例加入纯净水，用高速组织匀浆机(型号：A-88)进行匀浆10min，3500r/min离心10min,取出经油水分离器(型号：QSL-50)分离出脂类物质，脂类物质按比例1:1加入复合有机溶剂(甲醇:乙酸乙酯:丙酮:石油醚＝1:2:1:1)提取3天，再经旋转蒸发仪(Buchl Rotavapor RIL型)对提取液进行浓缩，旋转温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为3档；直至有机溶剂蒸发完毕，获得大麦虫和黄粉虫脂类抗菌组合物；经检测分析，大麦虫和黄粉虫油脂得率分别为30.52％和20.64％，化合物数量分别为22个和18个。

实施例2：

取9龄左右的大麦虫和黄粉虫幼虫，分别置于养殖盘中常规饲养，用18W紫外灯照射12s后，移出养殖盘，恢复24小时后，向幼虫体表喷洒浓度为350ppm几丁质酶，作用时间为0.7h，用含浓度为0.035mg/kg细菌脂多糖(LPS)的饲料饲喂幼虫进行诱导，连续饲喂4天，收集虫体。虫体经洗净消毒处死，按1:5比例加入纯净水，用高速组织匀浆机(型号：A-88)进行匀浆12min，3500r/min离心12min,取出经油水分离器(型号：QSL-50)分离出脂类物质，脂类物质按比例1:3加入复合有机溶剂(甲醇:乙酸乙酯:丙酮:石油醚＝1:2:1:1)提取4天，再经旋转蒸发仪(Buchl Rotavapor RIL型)对提取液进行浓缩，旋转温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为3档；直至有机溶剂蒸发完毕，获得大麦虫和黄粉虫脂类抗菌组合物；经检测，大麦虫和黄粉虫油脂得率分别为65.48％和55.23％，化合物数量分别为45个和36个。

实施例3：

取10龄左右的大麦虫和黄粉虫幼虫，分别置于养殖盘中常规饲养，用20W紫外灯照射13s后，移出养殖盘，恢复24小时后，向幼虫体表喷洒浓度为400ppm几丁质酶，作用时间为0.8h，用含浓度为0.04mg/kg细菌脂多糖(LPS)的饲料饲喂幼虫进行诱导，连续饲喂5天，收集虫体；虫体经洗净消毒处死，按1:5比例加入纯净水，用高速组织匀浆机(型号：A-88)进行匀浆13min，3500r/min离心13min,取出经油水分离器(型号：QSL-50)分离出脂类物质，脂类物质按比例1:5加入复合有机溶剂(甲醇:乙酸乙酯:丙酮:石油醚＝1:2:1:1)提取5天，再经旋转蒸发仪(Buchl Rotavapor RIL型)对提取液进行浓缩，旋转温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为3档；直至有机溶剂蒸发完毕，获得大麦虫和黄粉虫脂类抗菌组合物；经检测，大麦虫和黄粉虫油脂得率分别为90.75％和72.82％，化合物数量分别为92个和75个。

实施例4：

取11龄左右的大麦虫和黄粉虫幼虫，分别置于养殖盘中常规饲养，用24W紫外灯照射14s后，移出养殖盘，恢复24小时后，向幼虫体表喷洒浓度为450ppm几丁质酶，作用时间为0.9h，用含浓度为0.045mg/kg细菌脂多糖(LPS)的饲料饲喂幼虫进行诱导，连续饲喂7天，收集虫体。虫体经洗净消毒处死，按1:5比例加入纯净水，用高速组织匀浆机(型号：A-88)进行匀浆14min，3500r/min离心14min,取出经油水分离器(型号：QSL-50)分离出脂类物质，脂类物质按比例1:7加入复合有机溶剂(甲醇:乙酸乙酯:丙酮:石油醚＝1:2:1:1)提取7天，再经旋转蒸发仪(Buchl Rotavapor RIL型)对提取液进行浓缩，旋转温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为3档；直至有机溶剂蒸发完毕，获得大麦虫和黄粉虫脂类抗菌组合物；经检测，大麦虫和黄粉虫油脂得率分别为84.66％和60.08％，化合物数量分别为74个和61个。

实施例5：

取12龄左右的大麦虫和黄粉虫幼虫，分别置于养殖盘中常规饲养，用25W紫外灯照射15s后，移出养殖盘，恢复24小时后，向幼虫体表喷洒浓度为500ppm几丁质酶，作用时间为1.0h，用含浓度为0.05mg/kg细菌脂多糖(LPS)的饲料饲喂幼虫进行诱导，连续饲喂9天，收集虫体；虫体经洗净消毒处死，按1:5比例加入纯净水，用高速组织匀浆机(型号：A-88)进行匀浆15min，3500r/min离心15min，取出经油水分离器(型号：QSL-50)分离出脂类物质，脂类物质按比例1:9加入复合有机溶剂(甲醇:乙酸乙酯:丙酮:石油醚＝1:2:1:1)提取9天，再经旋转蒸发仪(Buchl Rotavapor RIL型)对提取液进行浓缩，旋转温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为3档；直至有机溶剂蒸发完毕，获得大麦虫和黄粉虫脂类抗菌组合物。经检测，油脂得率分别为62.78％和50.45％，化合物数量分别为52个和49个。

对比实施例1

以幼虫有效油脂得率为评价指标，按照已公开的超临界流体萃取方法提取油脂，其他条件按照实施例1-5的方法进行，其中序号1-5分别对应实施例1-5，本发明采用的复合有机溶剂提取方法提取的油脂进行综合评估，结果如下表1和表2所示。

表1：本发明实施例1-5复合有机溶剂方法提取大麦虫和黄粉虫幼虫有效油脂

表2：超临界CO

根据上述表1和表2的结果可知，相对于目前通常使用的超临界CO

对比实施例2

为了进一步验证以超临界流体萃取方法提取油脂与所述的采用复合有机溶剂方法提取的油脂的抑菌效果，按照上述实施例3的步骤和条件，分别采用超临界流体萃取方法提取油脂和复合有机溶剂方法提取的油脂。将得到的油脂用于抑菌实验。

参考依据：《中华人民共和国兽药典》2015年版一部中生物活性测定法(附录208)和NCCLS药敏试验标准。质控菌株(大肠杆菌(ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923)和氨苄青霉素(AMP)购于广东环凯微生物科技有限公司；目标菌株(短小芽孢杆菌(CMCC(B)63202)、大肠杆菌O78、肠炎型沙门氏菌分离株、致病性猪链球菌(2型)、产肠毒素型大肠杆菌K88、产肠毒素型大肠杆菌K99、鸡源产气夹膜梭菌分离株及猪源产气夹膜梭菌分离株)甘油保种的菌株均来源于广东省农业科学院农业基因研究中心。

抗菌效果测定的方法：采用管碟法进行细菌敏感性测定。吸取M-H固体培养基(含2％兔血清)20ml倒入培养皿(直径：9.0cm±0.1cm)，待凝固；滴加一定量(比例：3滴/100ml)质控菌株和目标菌株菌悬液(菌浓：OD

表3：对比实施例2两种提取方法获得的油脂对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：方法1代表超临界CO

根据上表3的数据可知，有效油脂经体外抑菌试验发现，复合有机溶剂提取法获得的油脂抑菌效果优于超临界CO

对比实施例3

为了比较不同的诱导方法得到的脂类提取物的抑菌效果，进行以下实验

按照上述实施例3的方案，分别取10龄左右的不同幼虫，分别置于养殖盘中常规饲养，用20W紫外灯照射13s后，移出养殖盘，恢复24小时后，向幼虫体表喷洒浓度为400ppm几丁质酶，作用时间为0.8h，用含有细菌(记为细菌诱导组)、或细菌脂多糖(记为脂多糖诱导组)的饲料饲喂幼虫进行诱导，连续饲喂5天，收集虫体；虫体经洗净消毒处死，按1:5比例加入纯净水，用高速组织匀浆机(型号：A-88)进行匀浆13min，3500r/min离心13min,取出经油水分离器(型号：QSL-50)分离出脂类物质，脂类物质按比例1:5加入复合有机溶剂(甲醇:乙酸乙酯:丙酮:石油醚＝1:2:1:1)提取5天，再经旋转蒸发仪(Buchl Rotavapor RIL型)对提取液进行浓缩，旋转温度设定为55℃，压力为0.09Mpa，转速为3档；直至有机溶剂蒸发完毕，获得幼虫脂类抗菌组合物。

根据上述方案，分别设置两组对比，其中一组中仅采用20W紫外灯照射13s进行诱导(记为紫外光照诱导组)，不包括几丁质酶诱导和进行饲料诱导；另一组单独采用进行饲料诱导(记为单独饲料诱导组)。

所述幼虫包括大麦虫幼虫、黄粉虫幼虫、黑水虻幼虫、蝇蛆幼虫、家蚕幼虫及柞蚕幼虫。其中所述脂类抗菌组合物经体外评估，试验数据均采用SPSS 13.0进行统计分析，采用One-Way ANOVA方差分析和Duncan's进行多重比较，数据结果以平均数±标准误(M±SE)。试验结果参见表4-9。抑菌效果的测定方法采用与上述对比实施例2相同的方法。

表4：大麦虫幼虫脂类提取物对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表5；黄粉虫幼虫脂类提取物对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表6：黑水虻幼虫脂类提取物对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表7：蝇蛆脂类提取物对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表8：家蚕幼虫脂类提取物对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表9：柞蚕幼虫脂类提取物对几种细菌抑菌直径测定(单位：mm)

注：同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

由表4至表9可知，大麦虫幼虫、黄粉虫幼虫、黑水虻幼虫、蝇蛆幼虫、家蚕幼虫及柞蚕幼虫脂类提取物经诱导后均有效抑制短小芽孢杆菌(CMCC(B)63202)、大肠杆菌O78、肠炎型沙门氏菌分离株、致病性猪链球菌(2型)、产肠毒素型大肠杆菌K88、产肠毒素型大肠杆菌K99、鸡源产气夹膜梭菌分离株及猪源产气夹膜梭菌分离株(P<0.05或P<0.01)，且细菌脂多糖诱导后的抑菌效果优于空白组和抗生素组(AMP)(P<0.05或P<0.01)，同时也优于细菌诱导后的效果。

对比例4

为了进一步探讨细菌脂多糖的浓度对油脂得率的影响，在该对比例中，按照上述实施例3的步骤，分别考察了细菌脂多糖浓度为0.01mg/kg、0.02mg/k、0.03mg/kg、0.04mg/k、0.05mg/kg、0.06mg/k、0.08mg/k饲料的条件下提取大麦虫和黄粉虫幼虫有效油脂。结果参见表10。

表10：细菌脂多糖的浓度对油脂得率的影响

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。