目标物质的分离方法和定量方法

技术领域

本发明涉及目标物质的分离方法和定量方法。

背景技术

在生物体内存在的肽中，有因疾病而导致存在量变化的肽，这些肽可以作为特定的疾病的标志物。例如，糖尿病是一种由于胰岛素的作用降低、分泌不足而导致的血液中的葡萄糖水平(血糖值)高的状态的疾病。如果长时间地维持高血糖值，则对肾脏、视网膜、末梢神经会有损害，对血管也会有损害，促进动脉硬化，成为心肌梗塞和脑梗塞的危险因素。因此，糖尿病的诊断、预防和治疗中，重要的是把握血糖值、与糖尿病有关的因子的血中成分浓度。例如，在日本特开2014-145680号公报中，报告了使用分子量大的2种受体来形成目标物质(例如作为胰岛素原的构成物质的血清C-肽)与受体的复合物，利用电泳下的分子量差来分离复合物和游离受体的方法。

发明内容

作为受体优选的蛋白质具有规定的电荷。但是，由于受体与目标物质的电荷、分子量的大小关系，有时即使利用日本特开2014-145680号公报记载的方法也难以明确地分离复合物和受体。

因此，本发明鉴于上述情况，其目的在于提供一种能分离目标物质的方法。

本发明人为了解决上述课题，进行了深入研究。其结果是，发现通过将电泳与基于磁性的分离进行组合，能够解决上述课题。即，通过使用下述目标物质的分离方法，可以实现上述目的，该目标物质的分离方法包括：使用含有目标物质的样品和固定有特异性识别上述目标物质的部位的第1受体的磁性粒子，形成目标物质-磁性粒子的复合物，利用磁性和电泳来分离上述目标物质-磁性粒子的复合物。

附图说明

在图1-1中，图1A和B为用于说明本发明的方法的工序图。在图1A和图1B中，2、3表示电极；4表示试剂；5表示电泳基材；6表示基板；7表示含有目标物质的样品；8表示磁铁。

在图1-2中，图1C和D为用于说明本发明的方法的工序图。在图1C和D中，2、3表示电极；5表示电泳基材；6表示基板；8表示磁铁；9表示目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物。

在图2中，图2A为实施例(填充泳动溶液的玻璃方管的制作)中的利用磁性回收前的玻璃方管的照片。图2B为实施例(填充泳动溶液的玻璃方管的制作)中的利用磁性回收后的玻璃方管的照片。

图3为实施例(电泳)中使用的电泳装置的照片。

图4为实施例(电泳)中在电泳前后用荧光扫描仪进行测定时的玻璃方管的照片。

图5为表示实施例中荧光强度相对于H-FABP的终浓度的关系的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。应予说明的是，本发明并不仅限于以下的实施方式。

本发明的第1方式是一种目标物质的分离方法，包括：使用含有目标物质的样品和固定有特异性识别上述目标物质的部位的第1受体的磁性粒子，形成目标物质-磁性粒子的复合物，利用磁性和电泳来分离上述目标物质-磁性粒子的复合物。根据该方式，可以不论目标物质的种类(例如电荷、分子量)地分离目标物质。此外，根据该方式，可以分离难以检测的目标物质。

本发明的第2方式为一种目标物质的量的测定方法，包括：将含有目标物质的样品、固定有特异性识别上述目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、以及固定有特异性识别与上述目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质进行混合，得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物，利用磁性和电泳来分离上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物后，检测上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度。根据该方式，可以不论目标物质的种类(例如电荷、分子量)地高精度地测定目标物质的量。此外，根据该方式，即使是难以检测的目标物质，也能够高精度地测定目标物质的量。

在本说明书中，“特异性识别目标物质的部位的第1受体”也简称为“第1受体”。此外，“固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子”也简称为“固定有第1受体的磁性粒子”或“本发明的磁性粒子”。“特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体”是指第2受体特异性地识别与第1受体所识别的目标物质的部位不同的部位，也简称为“第2受体”。此外，“固定有特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质”也简称为“固定有第2受体的标记物质”或“本发明的标记物质”。

在本说明书中，表示范围的“X～Y”包含X和Y，是指“X以上Y以下”。此外，只要没有特别记述，操作和物性等的测定在室温(20～25℃)/相对湿度40～50％RH的条件下进行，但并不限于该条件。

＜目标物质的分离方法(本发明的第1方式)＞

本发明的第1方式是一种目标物质的分离方法，包括：使用含有目标物质的样品和固定有特异性识别上述目标物质的部位的第1受体的磁性粒子，形成目标物质-磁性粒子的复合物，利用磁性和电泳来分离上述目标物质-磁性粒子的复合物。

如果使用本发明的方法，则经由第1受体而形成目标物质与磁性粒子的复合物(目标物质-磁性粒子的复合物)。通过磁性在规定的位置上捕捉该复合物所包含的磁性粒子。因此，如果在用磁性捕捉复合物时或在捕捉之后进行电泳，则复合物会因磁性而被固定在规定的位置，不移动。但是，复合物以外的成分(例如，血细胞等来自生物体的成分)进行移动，或不移动。因此，可以选择性地分离、回收目标物质(目标物质-磁性粒子的复合物)。本发明的方法是使用磁性粒子来回收作为目的的目标物质的方法，因此，可以不论目标物质的种类(例如，电荷、等电点、分子量)地有效地分离目标物质。

以下、对本发明的第1方式进行说明。

(含有目标物质的样品)

目标物质可以根据目的(要诊断的疾病的种类)而适当选择。因此，作为目标物质没有特别限定。具体而言，可举出：胰岛素、胰岛素前体(例如，C-肽)、GLP-1(胰高血糖素样肽-1)、GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)、脂联素、H-FABP(心肌型脂肪酸结合蛋白质)、肌红蛋白、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、BNP(脑钠利尿肽)、NT-ProBNP(N末端脑利尿钠肽前体)、脂肪酸结合蛋白质等蛋白质、肽、糖链、核酸、低分子化合物、高分子化合物以及它们的复合物等。其中，从有益性、通用性等的观点出发，目标物质优选为蛋白质或肽，更优选为可用于血液、尿等体液的检查的蛋白质、肽(例如，胰岛素、C-肽等)。应予说明，上述蛋白质或肽包含游离体、接受了磷酸基、甲基、乙酰基、糖链、脂质、腈基等的修饰的修饰体、与酸(例如无机酸、有机酸)或碱(例如碱金属盐)等的盐、与核酸结合的核蛋白质等与其他物质结合的蛋白质或肽。此外，上述蛋白质可以来自天然，也可以是合成物。在本说明书中，“蛋白质”是指10kDa以上的多肽，肽是指小于10kDa的多肽。

含有目标物质的样品只要包含上述那样期望的目标物质，就没有特别限定。具体而言，可举出被检试样(血液、血浆、血清、组织、关节液、尿、淋巴液等)、细胞(培养细胞、细胞株等)、其培养上清液、它们的萃取物、它们的部分纯化组分等。在此，被检试样的来源也没有特别限定，可以来自人或人以外的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类；绵羊、猪、牛、马等家畜；兔、猫、狗等宠物；猕猴、绿猴、食蟹猴、黑猩猩等灵长类)中的任一种。此外，也可以使用各种环境的土壤、水等样品，或来自上述检体的萃取物。在它们之中，如果考虑有益性(例如，诊断目的)等，则含有目标物质的样品优选为被检试样，更优选为血液(例如，全血、血浆、血清等)、间质液和尿。即，从本发明的优选方式来看，样品可以选自血液、间质液和尿。

应予说明，目标物质可以不经纯化(萃取)而将上述被检试样直接用作样品，也可以在纯化(萃取)后再使用。例如，可以使用被检者的血液、血浆、血清、组织、关节液、尿、淋巴液等生物体成分等被检试样。此时，可以对被检试样进行稀释、纯化等处理。或者，目标物质也可以通过使用公知的蛋白质的纯化方法来进行纯化，从而制备。具体而言，例如，可以在合适的缓冲液存在下，将哺乳动物的组织或细胞进行均质化，将得到的组织的粗萃取物组分用反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等色谱来进行纯化。或者，目标物质也可以是市售品。

(固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子)

本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)是(例如在表面)固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体而成。

在本说明书中，“受体”是指能够与目标物质特异性结合的物质。应予说明，受体在电泳中(例如，在电泳缓冲液中)可以维持对于目标物质的结合活性。在本发明中，第1受体特异性地识别目标物质的某个部位(部位1)。此外，第2受体特异性地识别与第1受体所识别的目标物质的部位(部位1)不同的目标物质的部位(部位2)。

作为受体，没有特别限定，可举出例如抗体、具有与目标物质的结合活性的抗体的片段(抗体片段)、DNA适体等核酸、蛋白质、由蛋白质构成的受体、结合蛋白、肽、生物体受体、化学合成受体、糖链等。在它们之中，从与目标物质的特异性结合性高的方面等出发，优选将抗体或抗体的片段用作受体。第1受体优选为识别目标物质的由特定序列构成的结构单元(表位)(表位1)的抗体或抗体的片段。此外，第2受体优选为识别与表位1不同的表位(表位2)的抗体或抗体的片段。或者，第2受体也可以是特异性识别第1受体的受体(包括是配体的情况)。

作为抗体，可举出单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、修饰抗体(例如，仅将抗原识别位点人源化的“人源化抗体”等)、嵌合抗体、可以同时识别2个表位的双功能抗体等。抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等中的任一类。从与表位的特异性结合性的观点出发，优选使用单克隆抗体，更优选使用IgG单克隆抗体。

作为抗体的片段(Fragment)，可举出例如Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链抗体(scFv)、scFv-Fc、微抗体、双链抗体等基因工程制作的偶联分子、或者由聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定化作用的分子等修饰的它们的衍生物等。受体可以将抗体用各种蛋白酶进行处理，也可以根据目的来赋予任意的标记(Tag)。

与目标物质结合的受体的制造可以通过现有公知的方法来制作。例如，单克隆抗体可以按下述步骤来制作。首先，在动物的通过抗原给予能产生抗体的部位上，将抗原本身进行给药，或者与载体、稀释剂一起进行给药。为了在给药时提高抗体产生能力，可以将完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂进行给药。作为使用的动物，可举出例如猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等哺乳动物。抗血清中的抗体效价的测定可以按照常规方法进行。从免疫抗原的动物中选择确认了抗体效价的个体，在最终免疫的2～5天后采取脾脏或淋巴结，将它们所包含的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行融合，能够制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。融合操作可以按照已知的方法，例如Nature 256:495(1975)记载的方法来实施。作为融合促进剂，可举出例如聚乙二醇(PEG)等。作为骨髓瘤细胞，可举出例如NS-1、P3U1、SP2/0等。单克隆抗体的筛选可以按照公知或依据其的方法来进行，但通常用添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的动物细胞用培养基等来进行。作为筛选和育种用培养基，只要可以繁育杂交瘤细胞，则可以使用任何培养基。杂交瘤细胞培养上清液的抗体效价可以与抗血清中的抗体效价的测定同样地进行测定。单克隆抗体的分离纯化可以按照与通常的多克隆抗体的分离纯化同样的例如盐析法、醇沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、使用离子交换剂(例如DEAE)的吸附/解吸法、超速离心法、凝胶过滤法、使用了抗原结合固相或蛋白A或蛋白G、抗原亲和纯化等的利用特异性纯化法的免疫球蛋白的分离纯化法来进行。

此外，多克隆抗体例如可以按下述步骤来制作。多克隆抗体例如可以将包含表位的肽等制成抗原，制造与载体的复合物，与上述单克隆抗体的制造法同样地对哺乳动物进行免疫，从该免疫动物采取对于活性触珠蛋白的抗体含有物，进行抗体的分离纯化，从而制造。在形成抗原与载体的复合物时，载体的种类和抗原与载体的混合比只要对于交联于载体的抗原能有效地制造抗体，就可以以任意的比例来使用任意的物质进行交联。作为载体，可以使用例如牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白等。此外，在抗原与载体的偶联中，可以使用各种缩合剂，可以使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯、含有硫醇基、二硫代吡啶基的活性酯试剂等。抗原与载体的复合物在免疫的动物的能够产生抗体的部位可以将其自身进行给药，也可以与载体、稀释剂一起进行给药。为了在给药时提高抗体产生能力，可以将完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂进行给药。给药通常可以每约2～6周各进行1次，总计进行约3～10次左右。作为使用的动物，可举出与单克隆抗体制作的情况同样的哺乳动物。多克隆抗体可以从以上述方法而免疫的动物的血液、腹水等中采取，优选从血液中采取。抗血清中的多克隆抗体效价的测定与上述血清中的抗体效价的测定同样地进行测定。多克隆抗体的分离纯化可以按照与上述单克隆抗体的分离纯化同样的步骤来进行。

抗体也可以使用市售品。例如，在胰岛素为目标物质的情况下，可举出单克隆小鼠抗人(C7C9)、单克隆小鼠抗人(D4B8)、单克隆小鼠抗人(7F8)、单克隆小鼠抗人(3A6)、单克隆小鼠抗人(8E2)、单克隆小鼠抗人(7F5)(均为Hytest制)等。此外，例如在脂肪酸结合蛋白质为目标物质的情况下，可举出单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(28)、单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(25)、单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(5B5)、单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(9F3)、单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(10E1)、单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(22)、单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(30)(均为Hytest制)等。进而，例如在C-肽为目标物质的情况下，可举出选自单克隆小鼠抗人C-肽(7E10)(abcam公司制)、抗C-肽抗体(5B8)(小鼠单克隆(abcam公司制))、抗C-肽抗体(2B7)(小鼠单克隆(abcam公司制)、抗C-肽抗体(2A11)(小鼠单克隆(abnova公司制))和抗-h C-肽9101SPTN-5(小鼠单克隆(Medix Biochemica公司制))中的任一种单克隆抗体与抗-h C-肽9103 SPRN-5(小鼠单克隆(Medix Biochemica公司制))的组合，或者抗C-肽抗体(2A11)(小鼠单克隆(abnova公司制))与抗C-肽抗体(4H8)(小鼠单克隆(abcam公司制))的组合、抗C-肽抗体(4H8)(小鼠单克隆(abcam公司制))与抗C-肽抗体(5B8)(小鼠单克隆(abcam公司制))等的组合等。

磁性粒子(固定第1受体前的磁性粒子)只要是具有磁性的粒子，就没有特别限定。例如，磁性粒子可以由以式MFe

此外，磁性粒子可以被聚合物等被覆表面。在此，作为聚合物没有特别限定，可以同样地使用生物化学领域(例如，载体、聚合物珠、磁性粒子)所使用的公知的聚合物，或适当修饰后使用。具体而言，可举出(甲基)丙烯酸酯系聚合物、苯乙烯系聚合物等自由基聚合性聚合物等。在它们之中，可以优选使用能与生物化学物质结合的聚苯乙烯、聚环己基甲基丙烯酸酯等具有疏水表面的聚合物、具有羧基、甲苯磺酰基等表面官能团的聚合物。应予说明，在本说明书中，“(甲基)丙烯酸酯”包含“丙烯酸酯”和“甲基丙烯酸酯”这两者。此外，在磁性粒子被聚合物等被覆表面的情况下，被膜可以具有选自氨基、醛基、羧基、甲苯磺酰基、巯基、羟基和环氧基中至少1种的极性基团。在这样的情况下，可以经由上述极性基团，将目标物质或抗体等受体与磁性粒子容易地结合(担载)。

可以代替上述被覆而在磁性粒子的表面固定修饰物质，也可以在上述被覆的基础上，在磁性粒子的表面固定修饰物质。在此，修饰物质没有特别限定，可以根据期望的用途而适当选择。具体而言，可举出生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗原、抗体、酶等蛋白质；DNA、RNA等核酸；以及低分子药品、生理活性物质、寡肽、寡核苷酸、脂质等低分子化合物等。通过用这样的修饰物质来进行修饰，可以使与受体的结合更为容易。在此，上述修饰物质对磁性粒子的固定化(修饰)方法没有特别限定，例如可以与日本特开2007-262114号公报、日本特开2008-32411号公报(相当于US 2008/026222 A1)、日本特开2012-177691号公报等记载的方法同样地进行，或者适当修饰后再使用。

另外，磁性粒子也可以使用市售品。就使用的磁性粒子而言，可以使用磁珠、琼脂糖磁珠这样的多个磁性体被聚合物或凝胶(例如甲基丙烯酸酯、右旋糖酐)被覆的珠等，也可以是抗体结合磁珠、标记抗体结合珠等根据目的而适当修饰后的磁性粒子。具体而言，可举出Magnosphere

在磁性粒子表面固定第1受体的方法也没有特别限定。例如，可以与下述方法同样地进行，或在适当修饰后再使用：在受体(如抗体)上标记生物素、将该生物素标记受体与链霉亲和素标记磁珠结合的方法，在受体(如抗体)上标记链霉亲和素、将该链霉亲和素标记受体与标记了生物素的磁珠结合的方法等，使对一对物质表现出特异性的结合特性的物质进行化学结合的特异性结合对标记化法；将羧基引入磁珠的羧基用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)选择性地活性化后，在珠表面形成-COO-NHS基，经由该-COO-NHS基与受体(如抗体)结合的NHS法；将受体(如抗体)的二硫键用还原剂还原而形成巯基(-SH)，另一方面在磁性粒子表面导入马来酰亚胺基，使该马来酰亚胺基与受体的巯基反应的马来酰亚胺法；将酶的糖链部分用过碘酸氧化，导入醛基，将该醛基与受体(如抗体)的氨基反应，形成希夫碱基(-CH＝N-)，将该希夫碱基还原为-CH

本发明的固定有第1受体的磁性粒子的使用量没有特别限定，可以根据目标物质的量而适当选择，通常比目标物质的量多。本发明的固定有第1受体的磁性粒子的使用量是相对于目标物质1摩尔存在优选为1～10000摩尔以下、更优选超过1摩尔且为1000摩尔、特别优选为10～1000摩尔的第1受体(如抗体)的量。应予说明，在2个目标物质结合于1个磁性粒子的情况下(例如，固定有IgG抗体的磁性粒子中)，上述固定有第1受体的磁性粒子的量以重量计，为上述优选量的2倍的量。此外，本领域技术人员可以在一定程度上预测目标物质的量，如血液中所含的胰岛素量等，可以将预测范围的上限作为目标物质的量。应予说明，在本领域技术人员无法预测目标物质的量的情况下，可以使用过量(例如，在反应液中为0.1～100μg/mL的第1受体)的第1受体。

(目标物质-磁性粒子的复合物的形成)

将上述含有目标物质的样品与上述本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)混合，经由第1受体使目标物质与磁性粒子结合，形成目标物质-磁性粒子的复合物。此时的目标物质-磁性粒子的复合物形成条件只要是可以形成希望的复合物的条件即可，没有特别限定。例如，可以在缓冲液中混合含有目标物质的样品和固定有第1受体的磁性粒子。在此，缓冲液没有特别限定，可以使用公知的缓冲液。具体而言，例如可举出含有柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等有机酸及其盐类等的溶液等；甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等氨基酸类；含有盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸等无机酸及其盐类等的溶液等。作为具体的电泳用缓冲液，可举出例如，Good's缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、Tris-Tricine缓冲液、Bis-Tris缓冲液、PIPES缓冲液、Tris-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、MOPS缓冲溶液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、ACES缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、TES缓冲液、DIPSO缓冲液、TAPSO缓冲液、POPSO缓冲液、HEPPSO缓冲液、EPPS缓冲液、TAPS缓冲液、Bicine缓冲液、CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液等)、磷酸缓冲液(PBS)、乙酸缓冲液、碳酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。上述缓冲液可以单独使用1种，也可以以2种以上的混合物的方式使用。此外，缓冲液也可以包含EDTA、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、聚乙二醇等稳定化剂、Tween、Triton-X等非离子表面活性剂等。缓冲液的pH没有特别限定，只要在受体维持目标物质结合活性的环境下，就没有特别限定。如果考虑受体与目标物质的结合活性维持能力等，则通常优选中性至弱碱性附近。从这样的观点出发，缓冲液的pH更优选为6.0～9.0，特别优选为6.0～8.0。混合温度优选为4～40℃，更优选为4～25℃。此外，混合时间优选为1～72小时，更优选为8～24小时。另外混合时间优选为1～60分钟，更优选为5～30分钟。

通过含有目标物质的样品与本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)的混合(反应)，从而得到包含1个或2个目标物质结合于1个磁性粒子的目标物质-磁性粒子的复合物(应予说明，在使用还原抗体的情况下，为1个目标物质结合于1个磁性粒子的目标物质-磁性粒子的复合物)和未反应的磁性粒子的反应液。

(目标物质-磁性粒子的复合物的分离)

将如此形成的目标物质-磁性粒子的复合物利用磁性和电泳进行分离。即，通过磁性在规定的位置捕捉目标物质-磁性粒子的复合物中所包含的磁性粒子。因此，如果在用磁性捕捉复合物时或在捕捉之后进行电泳，则复合物会因磁性而被固定在规定的位置，复合物以外的成分(例如，血细胞等来自生物体的成分)进行移动，或完全不移动。因此，根据本发明的方法，可以不论目标物质的种类地有效地分离·回收目标物质(目标物质-磁性粒子的复合物)，或者，即使是难以检测的目标物质，也能够有效地分离·回收。应予说明，目标物质-磁性粒子的复合物可以如上述(目标物质-磁性粒子的复合物的形成)得到的那样，是被包含在缓冲液中的形态，或者也可以是从缓冲液中分离出来的形态，或者还可以是从缓冲液中分离出来后又在其他缓冲液中分散的状态。

电泳没有特别限定，可以使用公知的电泳。具体而言，可举出琼脂糖凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis；PFGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis；PAGE)等凝胶电泳，在电泳凝胶中形成pH梯度的等电点电泳，组合了等电点电泳(1维)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的二维电泳，将尿素、甲酰胺用作改性剂的改性剂浓度梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient GelElectrophoresis；DGGE)等载体电泳；以及无载体等电点电泳、微芯片电泳等无载体电泳等。应予说明，在上述载体电泳中，除上述以外，还可以使用下述记载的毛细管高分子等载体来代替右旋糖酐等凝胶。在它们之中，根据以下的理由，优选无载体电泳。例如，在将血液(全血)作为样品来进行载体电泳的情况下，血细胞聚集可以在样品和载体(例如凝胶)之间的界面处形成。该血细胞聚集只要在可以检测通常浓度范围的目标物质(例如，在样品中以mM～μM的程度包含目标物质的情况)的情况下，就可以排除对目标物质的测定的影响。但是，在目标物质的荧光为微量的情况下，在检测荧光时，样品和载体之间的界面处的血细胞聚集所包含的血细胞中地蛋白质等通过发出荧光(自身荧光)，从而会产生较大的噪声，进而引起灵敏度降低。此外，在使用载体的电泳的情况下，该血细胞聚集会残留目标物质-受体的复合物的一部分，有可能会引起信号降低。另一方面，在无载体电泳的情况下，由于不存在样品和载体的界面，因此不会有血细胞聚集。血细胞可以通过电泳而(通常为正极侧)泳动。即，可以防止·抑制作为灵敏度降低的一个原因的、由血细胞导致的自身荧光。因此，可以实现高灵敏度的测定。此外，无载体电泳由于不含有载体，因此分离后的处理较容易。除此之外，能够进行大量的连续泳动，与其它的分离方法的接续也较容易。即，根据本发明的优选方式，电泳为无载体电泳。

此外，目标物质-磁性粒子的复合物可通过磁性来与其它成分分离。在此，可分离的其他成分是指目标物质以外的成分。具体而言，有样品中所包含的目标物质以外的成分(例如血液成分)、(如果使用的话)稀释液(例如缓冲液)的构成成分等。

在本发明中，在电泳方向的规定的位置上设置磁铁。作为磁铁，只要能捕捉磁性粒子，就没有特别限定。具体而言，可举出稀土类磁铁(钕磁铁、粘结磁铁等)、铁氧体磁铁、电磁铁等。

在下文中，参照附图说明通过无载体电泳和磁性来进行目标物质-磁性粒子的复合物的分离的方式。应予说明，本发明并不限定于下述方式。

图1A～D为用于说明本发明的方法的工序图。

首先，如图1A所示，在电泳基材(例如毛细管)5中填充包含固定有第1受体的磁性粒子的试剂4。将该电泳基材5配置在电泳装置的基板6上。此外，在电泳基材5的两端设置电极(例如铂电极)2、3。由此，在电泳基材5的长度方向施加电场。上述试剂可以仅由固定有第1受体的磁性粒子构成。或者，试剂除固定有第1受体的磁性粒子之外，也可以包含pH调节剂(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、盐酸、磷酸等)、缓冲剂(磷酸氢钠、磷酸钠、Tris-HCL等)、皂苷等溶血剂、表面活性剂等。

电泳基材5没有特别限定，从复合物的流动可见性等观点出发，优选为透明。具体而言，电泳基材优选由丙烯酸树脂等透明树脂、石英玻璃、合成石英等透明材料形成。从自身荧光更少的观点出发，更优选石英玻璃、合成石英制的电泳基材，特别优选合成石英制的电泳基材。另外，从成本方面考虑，特别优选透明树脂制的电泳基材。此外，电泳基材5的形状也没有特别限定，可以是圆柱、棱柱等任一种。如果考虑设置稳定性等，则优选电泳基材5的截面形状为方形的棱柱，特别优选电泳基材5的截面形状为四边形的棱柱。电泳基材5的大小也没有特别限定。如果考虑缓冲液、样品的流动容易度、电渗流(Electro OsmoticFlow：EOF)的防止·抑制效果等，则电泳基材5截面的最大长度(截面为方形的情况下为1边(内边)的长度，截面为圆形的情况下为内径(直径))优选为0.1～2mm，更优选为0.5～1mm。此外，如果考虑复合物的分离容易度、操作容易度等，则电泳基材5的长度优选为1～10cm，更优选为2～5cm。

此外，基板6没有特别限定，从复合物的流动的可见性等观点出发，优选为透明。具体而言，基板优选由丙烯酸树脂等透明树脂、石英玻璃、合成石英等透明材料形成。从自身荧光更少的观点出发，更优选石英玻璃、合成石英制的基板，特别优选合成石英制的基板。或者，从成本方面考虑，特别优选透明树脂制的基板6。

接下来，如图1A所示那样，在铂电极2侧滴加含有目标物质的样品7。由此，样品7由于毛细管现象而进入电泳基材5内，与试剂4混合。由此，在电泳基材5内，样品7中的目标物质与存在于固定有第1受体的磁性粒子中的第1受体进行反应，形成目标物质-磁性粒子的复合物。在此，含有目标物质的样品7(检体1)的滴加量没有特别限定，可以根据电泳基材的大小等适当设定。此外，反应条件没有特别限定，可以使用与上述的条件同样的条件。在本方式中是将样品7在正(+)极的电极2侧进行滴加，但并不限定于该方式。该方式如上所述，在存在于蛋白质中的羧基(-COOH)带负电的情况下特别优选使用。

试剂中的固定有第1受体的磁性粒子的量没有特别限定，可以使用与上述(固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子)一项中记载的量同样的量。

本方式中是在电泳基材5内预先填充了包含固定有第1受体的磁性粒子的试剂，但是也可以预先使固定有第1受体的磁性粒子与目标物质进行反应，形成目标物质-磁性粒子的复合物后，再将该反应物填充到电泳基材5中(第2实施方式)。在该第2实施方式的情况下，优选在基板6上另外设置用于上述反应的室(未图示)。

另外，在其它方式中，在电泳基材的两端部滴加包含固定有第1受体的磁性粒子和缓冲液的试剂溶液，制作液体聚集部，通过毛细管现象用试剂溶液充满电泳基材内，在电泳基材5的两端设置电极(例如铂电极)2、3，将含有目标物质的样品在任一电极处进行滴加(第3实施方式)。在该第3实施方式中，作为缓冲液，只要是在受体可以维持目标物质结合活性的环境下就没有特别限定，可以使用与通常电泳中所使用的缓冲液同样的缓冲液，或者进行适当修正后使用。具体而言，作为缓冲液，只要是含有具有缓冲能力的现有公知的缓冲液组合物的溶液，就没有特别限定。例如，可举出与上述(目标物质-磁性粒子的复合物的形成)一项中例示的缓冲液同样的缓冲液等。或者，也可以使用市售的电泳用试剂盒中提供的缓冲液等。泳动用缓冲液通常可以在能用作电泳用缓冲液的浓度下进行使用。缓冲液的pH没有特别限定，只要在受体维持目标物质结合活性的环境下，就没有特别限定。其中，如果考虑受体与目标物质结合活性维持能力、试剂的稳定性、反应性等，则通常优选pH在中性～弱碱性附近。从这样的观点出发，缓冲液的pH更优选为6～9。特别是在目标物质为蛋白质的情况下，通过缓冲液的pH为碱性侧，蛋白质中存在的羧基(-COOH)带负电(成为-COO-)，因此可以促进电泳中的复合物的移动。对于缓冲液的pH调节而言，使用盐酸等酸性物质、氢氧化钠等碱性物质来适当调节即可。

接下来，如图1B所示，将磁铁8设置在电泳基材5的铂电极2(阳极)侧。由此，可以用磁铁8来捕捉目标物质-磁性粒子的复合物所包含的磁性粒子。接下来，如图1C所示，在电泳基材5的长度方向上使磁铁8移动后，开始电泳。由此，可以选择性地分离目标物质-磁性粒子的复合物。即，根据本发明的优选方式，在得到包含目标物质-磁性粒子的复合物的混合物后，通过磁性在规定的位置捕捉上述目标物质-磁性粒子的复合物，然后，进行电泳，从而从上述混合物中分离上述目标物质-磁性粒子的复合物。

在此，磁铁8的移动场所没有特别限制，优选将磁铁8设置在电泳基材5的阴极侧(在图1C中为铂电极3侧)。如果为该方式，则想要与样品中的目标物质分离的成分(例如，在检测时引起噪声、背景噪音上升的物质(在下述第2实施方式中为发出自身荧光的血细胞、具有检测对象外的荧光的物质等))会向阳极侧移动。因此，在检测时，在电泳基材5内，可以增加目标物质-磁性粒子的复合物与可能产生噪声的物质之间的距离。因此，可以更有效地防止·抑制灵敏度降低，使背景噪音、噪声减少，从而进一步提高灵敏度。具体而言，优选将磁铁设置在从泳动开始地点到泳动结束地点为止的全泳动过程中更靠近阴极的一半(图1C中的Y/X≦1/2的位置)。更优选将磁铁设置在如下位置：从阴极到磁铁的距离(图1C中的Y)为在从阴极(图1C中的Y＝0)到阳极的全泳动过程(图1C中的Y＝X)中超过阴极到中点为止的位置(图1C中的超过Y/X＝0且为1/2以下的位置)。特别优选将磁铁设置在如下位置：阴极到磁铁的距离(图1C中的Y)相对于从阴极到阳极的全泳动过程(图1C中的X)的比例(Y/X)为1/10～3/5的位置(图1C中的Y/X＝1/10～3/5的位置)；最优选将磁铁设置在如下位置：阴极到磁铁的距离(图1C中的Y)相对于从阴极到阳极的全泳动过程(图1C中的X)的比例(Y/X)为1/10～2/5的位置(图1C中的Y/X＝1/10～2/5的位置)。通过设置在上述位置，从而能够进一步有效地防止·抑制自身荧光等灵敏度降低。应予说明，在图1C中，“X”表示阴极与阳极之间的长度(相当于电泳基材5的总长度)(mm)。此外，“Y”表示从阴极到磁铁宽度的中点(中心)的距离(mm)。此外，该磁铁相对于阴极、阳极的设置距离的关系根据检测物质的种类，也能够设为与第2实施方式相反的关系。

在将磁铁8配置在电泳基材5上规定的位置后，开始电泳。在此，电泳条件只要是能分离复合物以外的成分(例如来自样品的杂质)的条件即可，没有特别限定，可以使用通常的条件。例如，电泳中的施加电压从通常该领域所使用的范围中适当选择即可，通常可以使用直流电压在优选5～200V、更优选10～100V的范围内施加。电泳时间通常可以是30～180分钟。从迅速分离的观点出发，泳动时间优选为数分钟～10分钟左右。应予说明，电泳温度没有特别限定，通常在室温(20～25℃)进行。

如上所述，即将进行电泳的样品(以下也称为“检体1”)除了含有样品中所包含的成分(例如，血细胞等来自生物体的成分)、缓冲液所包含的成分之外，还含有目标物质-磁性粒子的复合物和未反应的磁性粒子。在上述电泳中，可以用磁铁捕捉目标物质-磁性粒子的复合物和未反应的磁性粒子。此外，通常在1处捕捉的磁性粒子是可以目视的(例如参照图2B)。因此，通过仅切除配置磁铁的电泳基材部分等而取出，从而能够有效地从样品、缓冲液所包含的成分(例如，血细胞等)中有效地分离目标物质。应予说明，为了防止目的物(目标物质-磁性粒子的复合物)的扩散，仅将配置磁铁的电泳基材部分取出的操作优选在配置着磁铁的状态下进行。

＜目标物质的量的测定方法(本发明的第2方式)＞

本发明的第2方式为一种目标物质的量的测定方法，包括：将含有目标物质的样品、固定有特异性识别上述目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、以及固定有特异性识别与上述目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质进行混合，得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物，利用磁性和电泳来分离上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物后，检测上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度。

根据本发明的方法，经由第1受体使目标物质与磁性粒子结合，经由第2受体使目标物质与标记物质结合，形成磁性粒子、目标物质和标记物质的复合物(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物)。通过磁性在规定的位置上捕捉该复合物所包含的磁性粒子。因此，如果在用磁性捕捉复合物(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物)时或在捕捉之后进行电泳，则复合物会因磁性而被固定在规定的位置，复合物以外的成分(例如，血细胞等来自生物体的成分、蛋白质)移动。特别是，在使用荧光标记了测定对象物的受体进行检测的情况下，可以通过电泳将不是检测对象的杂质(蛋白质、肽、氨基酸、细胞膜、脂肪酸等)泳动到阴极侧或阳极侧。特别是，如果通过电泳将自身具有荧光的氨基酸、肽、不是检测对象的蛋白质进行分离，则能够大幅减少噪声、背景噪音。因此，可以选择性地分离·回收目标物质(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物)。本发明的方法是使用磁性粒子来回收作为目标的目标物质的方法，因此，可以不论目标物质的种类(例如，电荷、等电点、分子量)而有效地分离目标物质。此外，由于可以选择性地回收目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物，因此可以高精度地测定作为目标的目标物质的量。

以下对本发明的第2方式进行说明，由于关于重复事项(例如，含有目标物质的样品、本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)、磁铁、电泳)的说明与本发明的第1方式中的说明相同，因此在此处省略其说明。

(固定有特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质)

本发明的标记物质(固定有第2受体的标记物质)是(例如在表面)固定有特异性识别与第1受体的识别部位不同的部位的第2受体而成的。在此，第2受体没有特别限定，由于与本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)中所说明的内容相同，因此在此省略其说明。应予说明，第2受体识别与第1受体不同的部位，即，第1受体、第2受体(如抗体)分别识别1个目标物质的不同部位。例如，在第1受体和第2受体识别脂肪酸结合蛋白质的情况下，将单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(25)用作第1受体，将单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(28)用作第2受体等这样地选择不同的受体(如抗体)。

标记物质(固定第2受体前的标记物质)只要能够在之后的工序中用于测定期望的目标物质的量即可，没有特别限定。例如，可优选举出荧光物质、放射性同位素、酶和氧化还原物质等。上述标记物质可以单独使用1种，或也可以组合2种以上使用。即，根据本发明的优选方式，标记物质为选自荧光物质、放射性同位素、酶和氧化还原物质中的至少一种。在此，作为荧光物质，没有特别限定，通常可以使用可用于测定目标物质的量的荧光物质。具体而言，可举出：Alexa Flour(Life公司)、Hilyte Flour(Ana spec公司)、IRDye(LI-CORBiosciences制)、IRDye 800CW马来酰亚胺(LI-COR Biosciences制)、FITC(FluoresceinIsothiocyanate)、PE(phycoerythrin)、APC(Allophycocyanin)、Cy-3、Cy-5、四甲基罗丹明异氰酸酯、半导体量子点等。在它们之中，优选使用在长波长侧激发的荧光色素。由于在短波长发出荧光的物质在自然界中大量存在，因此通过使用在长波长侧激发的荧光色素，可以更有效地减少自身荧光。如果考虑上述方面，则优选使用在700～1000nm、特别是在750～900nm激发的荧光色素。在这样的波长区域激发的荧光色素具有检测效率好、能进一步提高灵敏度的优点。作为放射性同位素，没有特别限定，通常可以使用能用于测定目标物质的量的放射性同位素。具体而言，可举出

将第2受体固定到标记物质的方法也没有特别限定，由于与本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)中所说明的内容相同，因此在此省略其说明。应予说明，上述(固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子)中的“磁性粒子固定第1受体的方法”的说明中，将“磁珠”或“磁性粒子”换成“标记物质”即可使用。

本发明的固定有第2受体的标记物质的使用量没有特别限定，可以根据目标物质的量进行适当选择，通常比目标物质的量多。例如，在1个目标物质结合于标记物质的情况(例如在固定有还原抗体的标记物质的情况)下，本发明的固定有第2受体的标记物质的使用量是相对于目标物质1摩尔，存在优选超过1摩尔且为100摩尔以下、更优选超过1摩尔且为50摩尔以下、特别优选为2～50摩尔的第2受体(如抗体)的量。应予说明，在2个目标物质结合于标记物质的情况下(例如，在固定有IgG抗体的标记物质中)，上述固定有第2受体的标记物质的量为上述优选量的2倍的量。此外，本领域技术人员可以在一定程度上预测标记物质的量，如血液中所含的胰岛素量等，可以将预测范围的上限作为标记物质的量。应予说明，在本领域技术人员无法预测标记物质的量的情况下，可以使用过量(例如，反应液中包含0.1～100μg/mL的固定有第2受体的标记物质或1～100nM的第2受体(如抗体)的量)的固定有第2受体的标记物质。

此外，本发明的标记物质(固定有第2受体的标记物质)与本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)的混合比例也没有特别限定，优选存在的固定有第1受体的磁性粒子比存在的固定有第2受体的标记物质多。由此，可以更为有效地抑制由未反应的标记物质导致的灵敏度降低，且更有效地捕捉样品中存在的标记物质。具体而言，在标记物质和磁性粒子共同结合1个目标物质的情况(例如，固定有还原抗体的磁性粒子或标记物质的情况)下，本发明的标记物质(固定有第2受体的标记物质)与本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)的混合比例是：相对于本发明的结合于标记物质的第2受体1摩尔，存在优选超过1摩尔且为10000摩尔以下、更优选为10～1000摩尔、特别优选超过10摩尔且为50摩尔以下的本发明的结合于磁性粒子的第1受体的比例。如果是这样的混合比例，则可以进一步有效地抑制由未反应的标记物质导致的灵敏度降低，进一步有效地捕捉样品中存在的标记物质。

(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的形成)

将上述含有目标物质的样品与上述本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)和上述本发明的标记物质(固定有第2受体的标记物质)进行混合，从而经由第1受体使目标物质与磁性粒子结合，经由第2受体使目标物质与标记物质结合，形成目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物。此时的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物形成条件只要是可以形成期望的复合物的条件即可，没有特别限定。例如，可以在缓冲液中混合含有目标物质的样品、固定有第1受体的磁性粒子和固定有第2受体的标记物质。在此，缓冲液没有特别限定，可以使用公知的缓冲液。具体而言，可举出与上述(目标物质-磁性粒子的复合物的形成)一项中例示的缓冲液相同的缓冲液等。此外，缓冲液的pH没有特别限定，只要在受体维持目标物质结合活性的环境下，就没有特别限定。但是，如果考虑抑制受体与目标物质结合活性的降低等，则通常优选中性至弱碱性附近。从这样的观点出发，缓冲液的pH更优选为6.0～9.0，特别优选为6.0～8.0。混合温度优选为4～40℃，更优选为25～37℃。此外，混合时间优选为1～60分钟，更优选为5～30分钟。

通过含有目标物质的样品、本发明的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)和本发明的标记物质(固定有第2受体的标记物质)的混合(反应)，从而可以得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物。具体而言，上述混合物包含：经由目标物质而结合了磁性粒子和标记物质的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物、目标物质仅结合于磁性粒子的目标物质-磁性粒子的复合物、目标物质仅结合于标记物质的目标物质-标记物质的复合物、未反应的磁性粒子和未反应的标记物质。

(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的分离)

对如此形成的包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物进行电泳，在上述电泳中通过磁性来分离上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物。即，在电泳途中或电泳前，通过磁性来捕捉目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物中存在的磁性粒子，回收作为目标的目标物质(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物)。应予说明，目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物可以如上述(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的形成)得到的那样，是被包含在缓冲液中的形态，或者也可以是从缓冲液中分离出来的形态，或者还可以是从缓冲液中分离出来后又在其他缓冲液中分散的状态。在此，电泳没有特别限定，可以使用公知的电泳。具体而言，由于与上述(目标物质-磁性粒子的复合物的分离)一项中说明的内容相同，因此在此省略其说明。

在上述电泳中，通过磁性来分离作为目标的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物。详细来说，可以通过磁性捕捉目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物、目标物质仅结合于磁性粒子的目标物质-磁性粒子的复合物、以及未反应的磁性粒子。因此，在电泳中，可以分离样品中所包含的目标物质以外的成分、(如果使用的话)试剂稀释液(例如缓冲液)、目标物质非特异性结合的物质(仅结合于标记物质的目标物质-标记物质的复合物等)、以及未反应的标记物质。

本发明中，在电泳途中设置磁铁。在此，磁铁的具体的说明与上述(目标物质-磁性粒子的复合物的分离)一项中说明的内容相同，因此在此省略其说明。

(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度的检测)

通过检测上述分离的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度，从而测定作为目标的目标物质的量。应予说明，在上述分离工序中，除目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物之外，还会用磁铁捕捉目标物质仅非特异性结合于磁性粒子的目标物质-磁性粒子的复合物、未反应的磁性粒子。在本实施方式中，作为标记物质，使用特异性结合目标物质的抗体。因此，在未反应的磁性粒子中不存在目标物质，因此标记物质不会与未反应的磁性粒子结合。即，未反应的磁性粒子不会对目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度(即测定精度)产生实质上的影响。因此，在该工序中可以选择性地检测到来自目标物质的信号强度，即，可以高精度地测定目标物质的量。此外，作为灵敏度降低的原因的样品中的其他成分(例如血细胞)、未反应的标记物质会通过电泳由该磁铁向阴极或阳极侧移动。对于标记物质的配合量而言，在考虑目标物质的种类、磁性粒子等其他试剂成分的使用量、样品的种类的基础上，以目标物质在测定对象范围内能被充分检测的方式进行配合。因此，根据本发明的方法，可以高灵敏度(高精度)地测定作为目标的目标物质的存在量。

在下文中，参照附图说明通过无载体电泳和磁性来进行目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的分离后，检测该复合物的信号强度的方式。应予说明，本发明并不限定于下述方式。

图1A～D为用于说明本发明的方法的工序图。

在图1A、B和C的说明中，对于与上述本发明的第1方式中的说明重复的事项，在此省略其说明。

首先，如图1A所示，在电泳基材(例如毛细管)5中填充包含固定有第1受体的磁性粒子和固定有第2受体的标记物质的试剂4。将该电泳基材5配置在电泳装置的基板6上。此外，在电泳基材5的两端设置电极(例如铂电极)2、3。由此，在电泳基材5的长度方向施加电场。上述试剂可以包含固定有第1受体的磁性粒子和固定有第2受体的标记物质中的任一者。或者，试剂除固定有第1受体的磁性粒子和固定有第2受体的标记物质之外，也可以包含pH调节剂(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、盐酸、磷酸等)、缓冲剂(磷酸氢钠、磷酸钠、Tris-HCL等)、皂苷等溶血剂、表面活性剂等。

试剂中的固定有第1受体的磁性粒子的量没有特别限定，可以使用与上述(固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子)一项中记载的量同样的量。同样地，固定有第2受体的标记物质的量、固定有第1受体的磁性粒子与固定有第2受体的标记物质的混合比例也没有特别限定，可以使用与上述(固定有特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质)一项中记载的同样的量、比例。

在本方式中是在电泳基材5内预先填充了包含固定有第1受体的磁性粒子和固定有第2受体的标记物质的试剂，但是也可以预先使固定有第1受体的磁性粒子与固定有第2受体的标记物质与目标物质(样品)进行反应，形成目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物后，再将该反应物填充到电泳基材5中(第2'实施方式)。在该第2'实施方式的情况下，优选在基板6上另外设置用于上述反应的室(未图示)。

或者，在其它方式中，在电泳基材的两端部滴加包含固定有第1受体的磁性粒子、固定有第2受体的标记物质和缓冲液的试剂溶液，制作液体聚集部，通过毛细管现象用试剂溶液充满电泳基材内，在电泳基材5的两端设置电极(例如铂电极)2、3，将含有目标物质的样品在任一电极处进行滴加(第3'实施方式)。

接下来，如图1B所示，将磁铁8设置在电泳基材5的铂电极2(阳极)侧。由此，可以用磁铁8来捕捉目标物质-磁性粒子的复合物所包含的磁性粒子。接下来，如图1C所示，在电泳基材5的长度方向上使磁铁8移动后，开始电泳。由此，可以选择性地分离目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物。因此，在以下详述的信号强度的检测中，可以高精度地测定目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物(即该复合物所包含的标记物质)的量。即，根据本发明的优选方式，在得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物后，通过磁性将上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物集中在规定的位置，然后进行电泳，由此将上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物与固定有未反应的第2受体的标记物质(未与目标物质结合的固定有第2受体的标记物质)分离。在此，磁铁8的移动场所没有特别限定，优选将磁铁设置在与上述(目标物质-磁性粒子的复合物的分离)中的图1C项中记载的同样的位置。

使磁铁8在电泳基材5的外表面上或电泳基材5的外表面附近位置上，沿着电泳基材5在阴极与阳极之间移动至少1次。然后，将磁铁8配置在规定的位置，开始电泳。作为磁铁8的配置位置，没有特别限定，只要是能给予电泳基材5适当的磁力的位置即可，可以将磁铁配置在与上述(目标物质-磁性粒子的复合物的分离)一项中规定的同样的位置。

如上所述，即将电泳的样品(以下也称为“检体2”)除了含有样品中所包含的成分(例如，血细胞等来自生物体的成分)、缓冲液所包含的成分之外，还包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物、目标物质-磁性粒子的复合物、目标物质-标记物质的复合物、未反应的磁性粒子和未反应的标记物质。在上述电泳中，可以用磁铁捕捉目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物、目标物质-磁性粒子的复合物和未反应的磁性粒子。但是，通过使标记物质与磁性粒子的混合比为适当的比例，可以使目标物质-磁性粒子的复合物的混入量为最小限度。因此，可以用磁铁选择性地捕捉目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物和未反应的磁性粒子。但是，标记物质不会特异性地结合于该未反应的磁性粒子(在下述信号强度的检测中不会被检测)。因此，通过测定电泳后的分离物的信号强度，从而能以高灵敏度(高精度)来测定目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物(即目标物质)的存在量。

接下来，如图1D所示，对配置有磁铁8的电泳基材5部分中存在的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物9的信号强度进行检测。在此，该复合物中存在的标记物质的信号强度对应于目标物质的量。即，可以预先制作测定的目标物质-磁性粒子-标记物质的带的信号强度与目标物质的量的标准曲线，基于该标准曲线，将检测到的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的带的信号强度进行比较，从而正确地测定样品中的目标物质的量。即，根据本发明的优选方式，使用已经提前知道量的目标物质，制作目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度相对于目标物质的量的标准曲线，基于上述标准曲线和上述检测到的目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度，测定上述样品中所包含的目标物质的量。

在本发明中，优选：使用已经提前知道目标物质的量的样品，制作目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的带的信号强度相对于目标物质的量的关系(标准曲线)。即，对于已经提前知道目标物质的量的样品，进行与上述同样的操作，算出目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的带的信号强度，制作标准物质的量与带的信号强度的标准曲线。在此，信号强度的测定方法能够根据标记物质的种类来使用公知的方法。例如，在标记物质为荧光物质并进行定量的情况下，使用荧光测定器(荧光扫描仪)、图像处理系统来测定荧光强度。此外，在标记物质为放射性同位素的情况下，用放射线计数装置来测定放射线量。在标记物质是酶的情况下，由酶产生的产物的检测和/或定量可以通过测定该产物的吸光度来进行。例如，在使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺来作为酶底物的情况下，测定655nm的吸光度即可。此外，在标记物质为氧化还原物质的情况下，可以通过测定生成的电化学信号来进行。

在目标物质的定量中，例如通过使用包含已知浓度的目标物质的标准试样，利用得到的荧光强度制作标准曲线，从而简便地将试样中所包含的目标物质的量进行定量。

通过本发明求出的标准曲线是恒定的，与泳动条件等外来因素无关，因此，其作为标准曲线是有效的。因此，通过利用该标准曲线，从而可以正确地测定样品中的目标物质的量。

特别是在目标物质是与某种疾病相关的标志物的情况下，上述检测方法在临床检査中会成为非常有用的检测手段。

应予说明，在图1D中，虽然去掉磁铁，但为了防止目标物(目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物)的扩散，因此，优选在将磁铁配置在电泳基材5的状态下适当(例如，从基板的下方)地检测信号强度。从这一点来考虑，也优选基板、电泳基材是透明的。

[诊断方法]

本发明的第3方式是使用了第1或第2实施方式的分离·测定方法的、与目标物质相关的疾病的诊断方法。具体而言，与目标物质相关的疾病的诊断方法包括：从被检者采取试样的阶段，将上述试样中的目标物质、上述固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、以及固定有特异性识别与上述目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质进行混合，得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物，对上述混合物进行电泳，利用磁性和电泳将上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物分离后，检测上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度，与健康者的目标物质的值相比较，判断被检者是否罹患与目标物质相关的疾病。因此，本发明也提供一种与目标物质相关的疾病的诊断方法，其包括：从被检者采取试样，将上述试样中的目标物质、上述固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、以及固定有特异性识别与上述目标物质所识别的部位不同的部位的第2受体的标记物质进行混合，得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物，利用磁性和电泳将上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物分离后，检测上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度(信号强度1)；从健康者采取试样，将上述试样中的目标物质、上述固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、以及固定有特异性识别与上述目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质进行混合，得到包含目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的混合物，利用磁性和电泳将上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物分离后，检测上述目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度(信号强度2)；将上述信号强度1与上述信号强度2相比较，判断被检者是否罹患与目标物质相关的疾病。在此，被检者或健康者优选为人或人之外的哺乳动物。作为上述疾病，例如，在目标物质是胰岛素的情况下，可举出胰岛素瘤、肥胖、肝疾病、库欣综合征、末端肥大症、异常胰岛素血症、胰岛素自身免疫综合征、糖尿病、低血糖、低营养状态、褐色细胞瘤、垂体肾上腺功能降低症等。如果与健康者的值相比较，被检者的信号强度高，则可能罹患上述那样的疾病如胰岛素瘤、肥胖、肝疾病、库欣综合征、末端肥大症、异常胰岛素血症、胰岛素自身免疫综合征等。另一方面，如果与健康者的值相比较，被检者的信号强度低，则可能罹患糖尿病、低血糖、低营养状态、褐色细胞瘤、垂体肾上腺功能降低症等。即，在上述目标物质为胰岛素、且上述信号强度1比上述信号强度2低的情况下，判断为上述被检者具有罹患糖尿病、低血糖、低营养状态、褐色细胞瘤或垂体肾上腺功能降低症的危险性。

[检査试剂盒或检査系统]

本发明的第4方式为与目标物质相关的疾病的检査试剂盒，包含：固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子(固定有第1受体的磁性粒子)、固定有特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质(固定有第2受体的标记物质)、以及磁铁。因此，本发明也提供一种与目标物质相关的疾病的检査试剂盒，包含：固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体而成的磁性粒子、固定有特异性识别与所述目标物质识别的部位不同的部位的第2受体而成的标记物质、以及磁铁。

本发明的第5方式为与目标物质相关的疾病的检査系统，包含：固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、固定有特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质、磁铁、以及电泳装置(优选为无载体电泳装置)。因此，本发明也提供一种与目标物质相关的疾病的检査试系统，包含：固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体而成的磁性粒子、固定有特异性识别与所述目标物质识别的部位不同的部位的第2受体而成的标记物质、磁铁、以及电泳装置。在本方式中，上述电泳装置优选为无载体电泳装置。

检査试剂盒所包含的固定有第1受体的磁性粒子、固定有第2受体的标记物质可以都放入1个容器，也可以放入不同的容器。此外，固定有第1受体的磁性粒子、固定有第2受体的标记物质也可以与缓冲液一起放入容器。此外，上述检査试剂盒可以是包含化验用缓冲液或其浓缩原液等的电泳用套装。即，本发明的第6方式为与目标物质相关的疾病的检査系统，包含：固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体的磁性粒子、固定有特异性识别与目标物质的部位不同的部位的第2受体的标记物质、磁铁、以及电泳套装(优选为无载体电泳套装)。因此，本发明也提供一种与目标物质相关的疾病的检査系统，包含：固定有特异性识别目标物质的部位的第1受体而成的磁性粒子、固定有特异性识别与所述目标物质识别的部位不同的部位的第2受体而成的标记物质、磁铁、以及电泳套装。在本方式中，上述电泳套装优选为无载体电泳套装。在此，在电泳用套装中，也可以包含其他的电泳槽、电泳用玻璃板、缓冲液槽、间隔物、梳形、夹子、电源、或佩里斯塔泵等一般的电泳用器械；电泳用试剂；检测试剂等。

本方式的检査试剂盒或检査系统可以在试剂盒或系统中进一步包含量(浓度)已知的标准样品和包含其的容器。检査试剂盒或检査系统所包含的各试剂可以以按1个试样的测定量来分注到容器中的方式而提供，也可以以按试剂种类将多个试样测定量的试剂合并放在各自的容器中而提供。在后者的情况下，在使用时将各试剂分注到规定的测定用容器中进行使用。在试剂按1个试样的测定量来提供的情况下，包含各试剂的容器作为盒子可以是一体成型，也可以将各试剂收纳在该盒子的不同区域中。在固定有第1受体的磁性粒子、固定有第2受体的标记物质以固体形状而被包含于试剂盒的情况下，检査试剂盒或检査系统可以进一步包含用于形成复合物的上述那样的缓冲液。检査试剂盒或检査系统可以包含的容器只要是与固定有第1受体的磁性粒子、固定有第2受体的标记物质不发生相互作用，不妨碍用于化验的反应例如酶反应、化学发光反应的材料即可，可以是任何材质。如果必要的话，也可以预先对表面进行处理后再提供，使其不会产生那样的相互作用。在检査试剂盒或检査系统中，通常附有操作说明书。

实施例

使用以下的实施例和比较例来说明本发明的效果。但是，本发明的技术范围并不仅限于以下的实施例。应予说明，在下述实施例中，只要没有特别记述，操作在室温(25℃)进行。此外，只要没有特别记述，“％”和“份”分别表示“质量％”和“质量份”。

实施例1

(固定有第1受体的磁性粒子的制备)

使用生物素标记试剂盒-SH(株式会社同仁化学研究所制)，按照制造商的协议，将小鼠抗人脂肪酸结合蛋白质(H-FABP)IgG单克隆抗体28(单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白质(FABP)28、Hytest Ltd.制)0.032mL(0.2mg)进行生物素化，得到包含生物素标记抗H-FABP(28)(生物素化H-FABP抗体)的PBS溶液(pH 7.4)(溶液A-1)0.2mL(1mg/mL)。

在0.2mL的该溶液A-1中，加入MagnosphereMS300/Streptavidin(平均粒径：3.0μm、JSR生命科学株式会社制)(磁性粒子)0.2mL(磁性粒子量：2mg)，在4℃使生物素化FABP抗体的生物素部分与磁性粒子的链霉亲和素部分反应一晚，得到包含生物素标记抗H-FABP(28)/Streptavidin磁珠复合物(固定有第1受体的磁性粒子)的反应液(溶液A-2)。在孵育规定的时间后，使用永久磁铁，从反应液(溶液A-2)中分离固定有第1受体的磁性粒子，用包含0.1％BSA的PBS(pH 7.4)进行清洗。在最终清洗后，将固定有第1受体的磁性粒子用倾析进行分离，之后，加入包含0.1％BSA的PBS(pH 7.4)0.2mL，制备固定有第1受体的磁性粒子溶液(溶液A-3)。应予说明，溶液A-3中的固定有第1受体的磁性粒子、抗体和磁性粒子的浓度分别为11mg/mL、1mg/mL和10mg/mL。

(固定有第2受体的标记物质的制备)

将小鼠抗人脂肪酸结合蛋白质(FABP)IgG单克隆抗体25(单克隆小鼠抗人脂肪酸结合蛋白(FABP)25、Hytest Ltd.制)0.055mL(0.3mg)添加到包含50mM EDTA的0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)0.3mL中，制备抗体溶液(溶液B-1)。在该抗体溶液(溶液B-1)中，加入包含0.1M巯基乙胺盐酸盐和50mM EDTA的0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)0.05mL。将该溶液在37℃孵育2小时，将抗体的二硫键还原，形成巯基(-SH)，得到包含还原抗体的溶液(溶液B-2)。对于该溶液(溶液B-2)进行脱盐处理，得到包含还原抗体的PBS溶液(溶液B-3)0.4mL。

另外，在IRDye(注册商标)800CW马来酰亚胺(LI-COR Biosciences制)(标记物质)(激发波长：800nm)0.5mL中加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)0.03mL进行溶解，制备标记物质溶液(溶液B-4)。将该标记物质溶液(溶液B-4)0.01mL添加到包含上述还原抗体的PBS溶液(溶液B-3)0.4mL中，在37℃孵育30分钟，使还原抗体的巯基(-SH)与标记物质的马来酰亚胺基反应，得到包含IRDye800CW标记抗H-FABP(25)复合物(固定有第2受体的标记物质)的反应液(溶液B-5)。在孵育规定的时间后，对于如此得到的反应液(溶液B-5)，使用Zeba旋转脱盐柱(Zeba

最后，将如此得到的溶液B-6用包含0.1％BSA的PBS(pH 7.4)稀释至抗体浓度成为0.1mg/mL，制备固定有第2受体的标记物质溶液(溶液B-7)。

(H-FABP溶液的制备)

对人脂肪酸结合蛋白质(H-FABP)(Fatty acid binding protein(FABP),human、Hytest Ltd.制)0.1mg添加包含0.1％BSA的PBS溶液2mL并溶解，制备H-FABP溶液(H-FABP浓度：0.05mg/mL)。

(泳动溶液的制作)

将上述制备的固定有第1受体的磁性粒子溶液(溶液A-3)、固定有第2受体的标记物质溶液(溶液B-7)、H-FABP溶液、包含0.1％BSA的PBS(pH 7.4)(下述表1中的“0.1％BSAPBS”)和0.1M Tris-HCl(pH 8.5)(下述表1中的“Tris-HCl”)以成为下述表1所示的组成(pH8.5)的方式混合，在25℃反应5分钟，制作包含脂肪酸结合蛋白质-生物素标记抗H-FABP(28)/Streptavidin磁珠-IRDye800CW标记抗H-FABP(25)的复合物1～5(复合物1～5)的泳动溶液1～5(样品1～5)。应予说明，在下述表1中，“H-FABP溶液的稀释率”表示将上述制备的H-FABP溶液稀释时的稀释倍率，“稀释后的H-FABP溶液”表示以上述规定的稀释率进行稀释后的H-FABP溶液的添加量。因此，例如样品1是指使用1μL的将上述制备的H-FABP溶液稀释2倍而得到的溶液。此外，在下述表1中，“溶液A-3的抗体/H-FABP(摩尔比)”是指抗H-FABP(28)(第1受体)相对于各样品中的脂肪酸结合蛋白质(H-FABP、目标物质)的摩尔比。同样地，“溶液B-7的抗体/H-FABP(摩尔比))”是指抗H-FABP(25)(第2受体)相对于各样品中的脂肪酸结合蛋白质(H-FABP、目标物质)的摩尔比。应予说明，生物素对磁性粒子的结合量可以基于使用的磁性粒子的使用说明书记载的量而算出。此外，可以假定抗体与生物素以1:1的摩尔比完全结合来进行计算。

[表1]

(填充泳动溶液的玻璃方管的制作)

将0.04mL的在上述(泳动溶液的制作)中制备的样品1～5分别填充到玻璃制的方管(外边：1.5mm、内边：1.0mm、厚度：0.25mm、长度：40mm、材质：石英)中(图2A)。将钕永久磁铁沿管的延伸方向，在填充了各样品的管上滑动，将复合物1～5和未反应的固定有第1受体的磁性粒子集中在一处(位置A)，分别得到玻璃方管1～5(图2B)。应予说明，磁铁设置在阴极到磁铁的距离(Y)相对于阴极到阳极的距离(X)的比例(Y/X)为1/5的地点。

(电泳)

将上述(泳动溶液的制作)制作的玻璃方管1～5分别设置在图3所示的电泳装置中，然后，用100V的电压进行5分钟的电泳。

电泳后，将钕永久磁铁固定在位置A以使各管中的复合物不移动，与此同时，将玻璃方管1～5分别从电泳装置取下。将该玻璃方管1～5的位置A处的荧光强度分别用荧光扫描仪(Odyssey CLx成像系统、LI-COR Biosciences制)进行测定。此外，在图4中示出填充了样品1的玻璃方管在电泳前后用荧光扫描仪测定时的照片。在图4中，白色方形所围住的部分表示复合物存在的场所。根据图4可知，在电泳后，复合物1可以与未反应的(未结合脂肪酸结合蛋白质的)固定有第2受体的标记物质良好地分离。

此外，将相对于H-FABP的终浓度的荧光强度进行作图。结果示于图5。从图5中可以观察到，在H-FABP浓度为0～9.2nM(138ng/mL)的范围中，目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物的信号强度(荧光强度)与H-FABP浓度之间存在良好的正相关(线性)(y＝21384x+7190(在此，y表示信号强度(荧光强度)，x表示H-FABP浓度(nM))，R

本申请基于2018年10月26日所申请的日本特许申请号2018-201908号，其公开内容全部作为参照而并入本说明书的一部分。

符号说明

2、3…电极；

4…试剂；

5…电泳基材；

6…基板；

7…含有目标物质的样品；

8…磁铁；

9…目标物质-磁性粒子-标记物质的复合物