一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法。

背景技术

猫消化道传染病是猫常见的临床疾病，以不同程度的胃肠道症状为主要特征。而猫泛白细胞减少症病毒(Feline Panleukopenia Virus，FPV)和猫冠状病毒(FelineCoronavirus，FCoV)是临床危害猫消化道的常见病原体。其中，FPV常伴随：引起猫的发热(40℃以上)、腹泻、脱水和明显的白细胞减少等特征，死亡率高，该病传染性极强且排毒方式多样，病猫、康复猫及隐形感染带毒猫都会通过排泄物及分泌物排毒；FCoV感染在猫群中极为普遍，单独感染仅出现轻微的肠胃炎，部分不表现任何临床症状，但与FPV混合感染时，临床症状明显加重。

目前，临床常用诊断方法多为免疫荧光抗体检测、血清学检测、病毒分离鉴定等技术，但仍存在灵敏度低、检测周期长及检测病原单一的缺点。普通PCR方法可特异性的扩增病毒的基因片段，灵敏度较高，但需在扩增后进行凝胶电泳分析，容易造成污染。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种核酸组合物在制备用于检测猫消化道传染病原体的试剂盒中的应用，核酸组合物包括：用于检测猫泛白细胞减少症病毒的第一试剂和/或用于检测猫冠状病毒的第二试剂，第一试剂包括引物对1和/或探针1，第二试剂包括引物对2和/或探针2，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述探针1和探针2的5’端均标记有荧光报告基团，探针1和探针2的3’端均标记有荧光淬灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY；

优选地，每个探针的5’端均标记有不同的荧光报告基团。

本发明还提供了一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物，其包括用于检测猫泛白细胞减少症病毒的第一试剂和/或用于检测猫冠状病毒的第二试剂，第一试剂包括引物对1和/或探针1，第二试剂包括引物对2和/或探针2，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的核酸组合物。

本发明还提供了一种猫消化道传染病原体的检测方法，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用上述的核酸组合物，或者采用上述的试剂盒进行检测；上述的检测方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测手段为PCR检测，PCR扩增检测的程序包括：50-52℃，逆转录10-20min；95-96℃，预变性2-10min；94-96℃，变性2-10s，58-60℃，退火和延伸共20-40s，循环10-40次。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测核酸样本为待测RNA样本。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测手段为PCR检测，待测核酸样本为DNA样本时，PCR扩增检测的程序包括95-96℃，预变性2-10min；94-96℃，变性2-10s，58-60℃，退火和延伸共30-40s，循环30-40次。

在本发明应用较佳的实施方式中，当核酸组合物含有第一试剂和第二试剂时，试剂盒中第一试剂的引物对1的工作浓度为0.1-20μM，探针1的工作浓度为0.1-20μM，试剂盒中第二试剂的引物对2的工作浓度为0.1-20μM，探针2的工作浓度为0.1-20μM。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物及试剂盒，该核酸组合物及其试剂盒可最多实现猫泛白细胞减少症病毒和猫冠状病毒的快速准确检测，这对于猫消化道疾病的临床诊断及治疗有着重要的意义。本发明提供的核酸组合物及试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、检测限低的技术优势，检测用时短，有利于发病猫的早期诊断和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是FCoV引物探针筛选结果图；

图2是FPV引物探针筛选结果图；

图3是试剂盒特异性测试的检测通道结果图；

图4是试剂盒特异性测试的检测通道结果；

图5是试剂盒检测限测试中FCoV在最低检测限的扩增图；

图6是试剂盒检测限测试中FPV在最低检测限的扩增图；

图7是猫冠状病毒引物扩增产物的测序结果BLAST对比结果图；

图8是猫泛白细胞减少症病毒引物扩增产物的测序结果BLAST对比结果图；

图9是FcoV模板浓度在2.5×10

图10是FPV模板浓度在2.5×10

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

本发明提供了一种核酸组合物在制备用于检测猫消化道传染病原体的试剂盒中的应用，核酸组合物包括：用于检测猫泛白细胞减少症病毒的第一试剂和/或用于检测猫冠状病毒的第二试剂，第一试剂包括引物对1和/或探针1，第二试剂包括引物对2和/或探针2，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示。

发明人通过查询猫泛白细胞减少症病毒和猫冠状病毒的资料文献，选择了序列号分别为KX900570.1的猫泛白细胞减少症病毒毒株、DQ848678.1的猫冠状病毒毒株进行引物设计，委托西安擎科生物科技有限公司合成相关病原的质粒，并使用引物探针设计软件选择合适的序列，即尽量避免引物的二聚体和发卡结构，且其引物退火温度在60℃左右。

需要说明的是，在可选的实施方式中，上述核酸组合物可以仅含有用于检测猫泛白细胞减少症病毒的第一试剂。该试剂及含第一试剂的试剂盒用于检测猫泛白细胞减少症病毒。

在一种实施方式中，核酸组合物中仅含有引物对而不含探针，该引物对直接用于PCR扩增。在其他实施方式中，也可以选择添加探针，用于荧光定量PCR检测。

在一种实施方式中，核酸组合物中同时含有第一试剂和第二试剂，该核酸组合可以用于猫泛白细胞减少症病毒和猫冠状病毒的检测。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述探针1和探针2的5’端均标记有荧光报告基团，探针1和探针2的3’端均标记有荧光淬灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY；

在一种实施方式，每个探针的5’端均标记有不同的荧光报告基团，这样设置有利于对不同病毒的特异性检测分型。

在其他实施方式中，探针标记的荧光报告基团和猝灭基团也可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述限定的几种类型。

本发明还提供了一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物，其包括用于检测猫泛白细胞减少症病毒的第一试剂和/或用于检测猫冠状病毒的第二试剂，第一试剂包括引物对1和/或探针1，第二试剂包括引物对2和/或探针2，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的核酸组合物。

在本发明应用较佳的实施方式中，当核酸组合物含有第一试剂和第二试剂时，试剂盒中第一试剂的引物对1的工作浓度为0.1-20μM，探针1的工作浓度为0.1-20μM，试剂盒中第二试剂的引物对2的工作浓度为0.1-20μM，探针2的工作浓度为0.1-20μM。

可选的，上述试剂盒中引物对的工作浓度可选为0.2μM，0.5μM，0.8μM，1μM，2μM，5μM，10μM，15μM或20μM。探针的工作浓度可选为0.2μM，0.5μM，0.8μM，1μM，2μM，5μM，10μM，8μM，15μM，18μM或20μM。

在其他实施方式中，上述试剂盒中引物对的工作浓度可以根据需要进行适应性调整，并不限于上述限定的几种浓度。

本发明还提供了一种猫消化道传染病原体的检测方法，其包括：以待测核酸样本为模板序列，采用上述的核酸组合物，或者采用上述的试剂盒进行检测；上述的检测方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测手段为PCR检测，PCR扩增检测的程序包括：50-52℃，逆转录10-20min；95-96℃，预变性2-10min；94-96℃，变性2-10s，58-60℃，退火和延伸共20-40s，循环10-40次。在上述反应条件下，PCR检测具有更好的检测效果。

在58-60℃延伸的过程中，采集的荧光信号结果生成荧光曲线，当扩增曲线明显呈S型且Ct值≤36即可判定对应荧光检测通道的病原体为阳性。

例如，当核酸组合物中同时含有第一试剂和第二试剂时，若以第一试剂检测样本的扩增曲线明显呈S型且Ct值≤36，则判断FPV阳性，指示待测样本的主体有猫泛白细胞减少症病毒感染。若以第二试剂检测样本的扩增曲线判断为FcoV阴性，指示待测样本的主体有猫冠状病毒感染的可能性很低。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测核酸样本为待测RNA样本。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测手段为PCR检测，待测核酸样本为DNA样本时，PCR扩增检测的程序包括95-96℃，预变性2-10min；94-96℃，变性2-10s，58-60℃，退火和延伸共30-40s，循环30-40次。

可采用上述检测步骤用于常规PCR的快速检测。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种检测猫消化道病原体的核酸组合物。其包括：用于检测猫泛白细胞减少症病毒的第一试剂和用于检测猫冠状病毒的第二试剂，第一试剂包括引物对1和探针1，第二试剂包括引物对2和探针2，引物对1的序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物对2的序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针2的序列如SEQ ID NO.6所示。具体序列参照表1所示：

表1序列信息。

实施例2

本实施例提供了设计筛选获得实施例1的核酸组合物的具体方法。

发明人通过查询猫泛白细胞减少症病毒和猫冠状病毒的资料文献，选择了序列号分别为KX900570.1(猫泛白细胞减少症病毒)、DQ848678.1(猫冠状病毒)的毒株进行引物设计，委托西安擎科生物科技有限公司合成相关病原的质粒，并使用引物探针设计软件选择合适的序列，即尽量避免引物的二聚体和发卡结构，且其引物退火温度在60℃左右。

设计出的引物序列参照表2所示，表2中，每一种病原体对应设计出2个核酸组合，每个核酸组合包括一个引物对和一个探针。

表2设计出的引物和探针序列。

将上述初步设计后的核酸组合进行扩增筛选，通过比较Ct值以及荧光度筛选出更优的核酸组合。

委托赛默飞世尔科技公司进行合成引物探针，并按照说明书进行引物和探针的稀释处理，稀释至20μM浓度。

分别对来自动物医院馈赠的猫泛白细胞减少症病毒和猫冠状病毒临床样本进行核酸提取。提取使用的是上海基灵的病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)。提取后的病毒核酸先使用市售元亨生物的PCR单项病原体检测试剂进行扩增，以确认提取后的核酸样本中确实含有猫冠状病毒或猫泛白细胞减少症病毒。

配制如下的PCR反应体系：反应体系为25μL，包括12.5μL的PCR反应液(包括逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl

PCR反应条件如下：50℃逆转录10分钟；95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃退火和延伸20s，并采集荧光，共循环40次。

分别采用表2所示的组合物进行PCR扩增，扩增结果参照图1和图2所示。图1是FCoV引物探针筛选结果图。图2是FPV引物探针筛选结果图。

由图1和图2可知，FCoV-F和FCoV-R、FPV-F和FPV-R(即为F+R组合)的引物更优。

为确认各引物或探针的特异性，发明人将PCR的扩增产物进行测序(测序引物即扩增时使用的引物)，测序委托西安擎科生物科技有限公司进行。

测序结果与NCBI中的猫冠状病毒或猫泛白细胞减少症病毒的序列进行BLAST对比，对比结果显示扩增产物确实为FcoV(BLAST结果参照图7所示)或FPV(BLAST结果参照图8所示)中的片段，符合预期。

实施例3

本实施例提供了一种检测猫消化道病原体(FCoV、FPV)的试剂盒，其包括实施例1的核酸组合物。

本实施例中的试剂盒为25μL反应体系，在其他实施方式中，上述试剂盒的体系也可以根据需要进行自适应调整，例如可以选择是15μL或20μL反应体系。

25μL反应体系包括12.5μLPCR反应液(包括逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl等，来自宝锐生物公司的PCR反应液)、FCoV/FPV的引物探针组(0.15μL的FCoV-F，0.2μL的FCoV-R，0.15μL的FCoV-P，0.2μL的FPV-F，0.2μL的FPV-R，0.15μL的FPV-P)、DEPC处理水，模板添加量设置为5μL。

使用上述试剂盒的PCR反应条件为：(1)50℃逆转录5-30min；(2)95℃预变性2-5min；(3)95℃变性5-15s；(4)60℃退火和延伸20-40s，采集荧光。其中(3)-(4)共进行40个循环。

发明人对反应条件进行优选，在不影响性能的条件下尽量缩减时间，最终确定的反应条件为：50℃逆转录10min，95℃预变性3min，95℃变性5s，60℃退火和延伸20s，共40个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

实验例1

本实验例对实施例3的试剂盒进行特异性测试：

按照上述实施例3的PCR试剂盒的组分配制反应体系，分别加入目标病毒和其他干扰病原体进行测试。其他干扰病原体包括猫冠状病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫支原体、猫衣原体。按照实施例3优化后的PCR反应条件进行扩增。

荧光检测结果参照图3和图4所示，图3为FCoV检测通道扩增图，其中有扩增曲线的为FCoV病毒，其余病原均未扩增；图4为FPV检测通道扩增图，其中有扩增曲线的为FPV病毒，其余病原均未扩增。

由上述结果可知，本申请提供的检测试剂盒具有特异性好的优势。

实验例2

本实验例进行试剂盒的重复性测试。

本实验对稀释后的样本进行扩增，样本来源与实施例2相同。每种样本重复扩增10次，得出下表3的数据，变异系数(CV，％)均小于2％。

表3各病原体扩增的平均Ct值以及变异系数表。

实验例3

本实验例进行试剂盒的灵敏度测试。

将各病原体的质粒(由西安擎科生物科技有限公司合成质粒)分别稀释至5×10

图5是FCoV在最低检测限(5×10

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海基灵生物科技有限公司

<120> 一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法

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<170> PatentIn version 3.5

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