OsWRKY53在正向调控BR信号中的应用

技术领域

本发明涉及OsWRKY53正向调控BR信号和水稻株型的分子机理解析。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，世界上一半以上的人口都以其为主食。近年来粮食需求不断增加，耕地面积却持续减少，提高作物产量是稳定经济发展的关键，也是现在农业面临的挑战。水稻株型是影响作物产量的重要指标，主要由叶倾角、粒型等组成。而植物激素BR，即油菜素内脂是影响水稻株型的重要植物激素。BR功能获得型突变体一般表现为叶倾角增大、粒型增大等特征；而BR功能缺陷型突变体一般表现为叶倾角变小、粒型变小等表型。说明可以通过调控BR信号或BR生物合成来调控水稻株型，进而达到提高作物产量的目的。水稻转录因子OsWRKY53被报道是BR信号的一个正调控因子，能够正向调控BR信号和水稻株型，但是其作用机理并不清楚。

发明内容

本发明的目的是首次解析OsWRKY53在BR信号转导通路中的作用机理，进而阐明OsWRKY53正向调控水稻株型的分子机理。为水稻株型育种提供重要理论价值，对筛选水稻高产新株型具有重要的应用价值。

本发明提供OsWRKY53在正向调控BR信号中的应用。

进一步的，所述OsWRKY53通过与OsBZR1相互结合，协同调控BR下游响应基因的表达。

所述OsBZR1为BR信号正调控因子。

本发明还提供OsWRKY53在负向调控BR信号中的应用。

进一步的，所述OsWRKY53通过被OsGSK2结合并磷酸化，而降低蛋白稳定性。

所述OsGSK2为BR信号负调控因子。

在BR含量低的情况下，BR信号负调控因子OsGSK2处于活性状态，通过结合并磷酸化下游的BR信号正调控因子OsWRKY53，降低其蛋白稳定性，负向调控BR信号，使水稻表现为叶倾角变小、粒型变小等表型。而当植物体内BR含量升高时，OsGSK2的活性被抑制，使OsWRKY53和OsBZR1的功能被完全释放，二者在BR信号的调控上处于一种平行的关系，二者通过相互结合，协同激活BR下游响应基因的表达，使水稻表现为叶倾角增大、粒型增大等特征。

本发明的有益效果：

本发明首次阐明OsWRKY53正向调控BR信号和水稻株型的分子机理。

本发明通过在OsGSK2-RNAi转基因水稻中，采用CRISPR/Cas9敲除技术，获得OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体，双突变体能将OsGSK2-RNAi BR信号增强的表型恢复至野生型水平，说明在BR信号的调控上，OsWRKY53作用于OsGSK2的遗传学下游。

本发明通过双分子荧光互补、LUC互补成像系统、免疫共沉淀等技术手段证实OsWRKY53能够与OsGSK2相结合；体内磷酸化分析、蛋白稳定性分析等手段充分证实OsGSK2通过磷酸化OsWRKY53降低后者的蛋白稳定性。

本发明通过遗传转化手段，将OsWRKY53在Osbzr1-D中过量表达，获得Osbzr1-DOsWRKY53-OE双突变体，双突变体表现出更加显著的BR信号増强的表型，说明OsWRKY53与OsBZR1协同调控BR信号。同时，在Osbzr1-D中，采用CRISPR/Cas9敲除技术，获得Osbzr1-Doswrky53双突变体，发现在Osbzr1-D中敲除OsWRKY53基因并不影响Osbzr1-D的BR信号増强的表型，说明OsWRKY53与OsBZR1在遗传学上是一种平行的关系。

本发明通过双分子荧光互补、LUC互补成像系统、免疫共沉淀等技术手段证实OsWRKY53能够与OsBZR1相结合；转录调控能力分析发现，OsWRKY53与OsBZR1协同抑制BR生物合成基因OsD2的表达。说明二者通过相互结合，协同调控BR下游相关基因的表达。

本发明阐明了OsWRKY53正向调控BR信号和水稻株型的分子机理，为水稻株型育种提供重要线索和理论基础，对改造水稻株型，进而提高作物产量提供重要理论依据，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体总体形态图；

图2为OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体剑叶叶倾角形态图；

图3为OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体剑叶叶倾角大小统计结果；

图4为OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体粒型形态图；

图5为OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体粒长统计结果；

图6为OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体粒宽统计结果；

图7为外源BR对OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体叶倾角的敏感性实验结果；

图8为外源BR对OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体叶倾角的敏感性实验的统计结果；

图9为BR生物合成基因在OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体及对照中的表达特征；

图10为OsGSK2与OsWRKY53的双分子荧光互补的成像结果

图11为OsGSK2与OsWRKY53的LUC互补成像结果

图12为OsGSK2与OsWRKY53的染色体免疫共沉淀的结果

图13为OsGSK2磷酸化OsWRKY53的体外磷酸化结果

图14为OsGSK2降低OsWRKY53蛋白稳定性的结果

图15为Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体总体形态图

图16为Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体剑叶叶倾角形态图

图17为Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体剑叶叶倾角大小统计结果

图18为外源BR对Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体叶倾角的敏感性实验结果

图19为外源BR对Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体叶倾角的敏感性实验的统计结果

图20为Osbzr1-D oswrky53双突变体总体形态图

图21为Osbzr1-D oswrky53双突变体剑叶叶倾角形态图

图22为Osbzr1-D oswrky53双突变体剑叶叶倾角统计结果

图23为BR生物合成基因在Osbzr1-D oswrky53双突变体及对照中的表达特征

图24为OsBZR1与OsWRKY53双分子荧光互补的成像结果

图25为OsBZR1与OsWRKY53的LUC互补成像结果

图26为OsBZR1与OsWRKY53的染色体免疫共沉淀的结果

图27为双元荧荧光素酶植物表达载体及效应载体对应的示意图

图28为OsBZR1与OsWRKY53协同抑制OsD2表达的实验结果

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例一、OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体的获得

1、将OsWRKY53基因的CDS序列输入CRISPR Primer Designer软件，设计2对靶位点引物(F1和R1；F2和R2)，构建敲除载体CRISPR/Cas9-OsWRKY53。

正向引物F1：5'-GGCATTCCAGTCGTACCTCTGAGC-3'

反向引物R1：5'-AAACGCTCAGAGGTACGACTGGAA-3'

正向引物F2：5'-GCCGAGCTGGAGGACGGGTACAAC-3'

反向引物R2：5'-AAACGTTGTACCCGTCCTCCAGCT-3'

2、以OsGSK2-RNAi转基因水稻为实验材料，采用农杆菌介导的遗传转化手段获得OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体。

3、设计涵盖靶点序列的一对测序引物(F3和R3)，对靶点序列进行扩增，并对PCR产物进行测序，直到获得纯合的OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体。

正向引物F3：5'-CGGGGTGCCCAAGTTCAAGTC-3'

反向引物R3：5'-ATGGAGCAGCCGTTGTAGGTG-3'

如图1所示，是OsGSK2-RNAi oswrky53双突变体的总体形态图，在OsGSK2-RNAi中敲除OsWRKY53基因能够将其叶倾角增大的表型完全恢复到野生型水平(图2、3)。粒型较GSK2-RNAi相比显著变小(图4、5、6)。叶倾角对外源BR的敏感性恢复至野生型水平(图7、8，图8中■表示ZH11，▲表示GSK2-RNAi，●表示GSK2-RNAi wrky53)，BR生物合成基因的表达量显著降低(图9)。以上结果均表明，在BR信号的调控上，OsWRKY53位于BR信号负调控因子OsGSK2的遗传学下游。

二、OsWRKY53与OsGSK2之间双分子荧光互补分析

1、将OsWRKY53(引物：F4和R4)和OsGSK2(引物：F5和R5)分别连入入门载体pENTR中，获得pENTR-OsWRKY53和pENTR-OsGSK2。随后，通过LR的方式，LR至植物表达载体c-GFP和n-GFP上，获得cGFP-OsWRKY53和nGFP-OsGSK2。

2、采用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草叶片

(1)目的载体转化农杆菌GV3101，将GV3101感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；将500ng～1μg的目的质粒加入100ul GV3101感受态中，冰上放置30min；迅速置于液氮中5min；从液氮中取出，迅速置于37℃水预锅中水浴5min；冰上2min；加入800μl液体LB培养基，置于全温震荡器(购自MKN公司)中，28℃，120rpm孵育4～5h；离心，弃大部分上清，将剩余菌液涂抹于含有壮观霉素(100ug/ml)(购自Amresco)和利福平(50ug/ml)(购自Amresco)的LB固体培养基上，28℃培养3天左右。

(2)待长出菌落后，挑取单克隆于相应抗生素的液体培养基中，160rpm，28℃培养，过夜。

(3)将以上菌液按照1:100的比例加入含有相应抗生素及终浓度为10mM MES(pH＝5.6)和40μM乙酰丁香酮的液体培养基中，28℃，160rpm振荡培养14h。

(4)3200g离心10min，收集菌体，弃上清，用10mM MgCl

(5)各组合2种菌液与P19菌液按1:1:2的体积比混合至10ml离心管中。

(6)选择烟草植株上部生长良好的叶片，一般以叶片较厚，维管束不明显的为好，用去掉针的注射器将菌液注射到烟草叶片背面。

3、注射好的烟草叶片，暗培养12h，正常光照条件培养2～3天，剪取叶片进行激光共聚焦显微镜观察。

正向引物F4：5'-caccATGGCGTCCTCGACGGGG-3'

反向引物R4：5'-CTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'

正向引物F5：5'-caccATGGACCAGCCGGCGCC-3'

反向引物R5：5'-TTAGCTCCCAGTATTGAAGAAGTT-3'

如图10所示，只有将OsWRKY53和OsGSK2共同注射的烟草叶片，才能检测到绿色荧光信号，并且互作复合物定位在细胞核内；单独转入其中一方的烟草叶片，检测不到绿色荧光信号；说明OsWRKY53和OsGSK2在植物体内能够相互结合。

三、OsWRKY53与OsGSK2的LUC互补成像系统分析

1、将OsWRKY53(引物：F6和R6)和OsGSK2(引物：F7和R7)分别连入植物表达载体pCAMBIA1300-cLUC和pCAMBIA1300-nLUC中，获得cLUC-OsWRKY53和nLUC-OsGSK2。

2、采用农杆菌介导的遗传转化方法，注射烟草叶片(方法同上)。

3、培养3天后，剪取待观察叶片，在表面涂抹终浓度为1mM的Beetle luciferinpotassium salt(Promega,E1605)，暗处理10min，于化学发光成像仪(Tanon 5200)上进行显像。

正向引物F6：5'-TACGCGTCCCGGGGCGGTACCATGGCGTCCTCGACGGGGGG-3'

反向引物R6：5'-ACGAAAGCTCTGCAGGTCGACGCAGAGGAGCGACTCGACGA-3'

正向引物F7：5'-ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGACCAGCCGGCGCC-3'

反向引物R7：5'-CGCGTACGAGATCTGGTCGACGCTCCCAGTATTGAAGAAGTT-3'

如图11所示，只有将WRKY53和GSK2同时转入的烟草叶片，才能检测到LUC信号；而单独将其中一方与空载体转入的烟草叶片，检测不到LUC信号；说明在植物体内，OsWRKY53与OsGSK2存在互作关系。

四、OsWRKY53与OsGSK2的免疫共沉淀分析

1、将OsWRKY53(引物：F8和R8)和OsGSK2(引物：F9和R9)分别连入植物表达载体HBT-FLAG和PRT107中，获得mOsGSK2-FLAG和MYC-OsWRKY53。

2、转化水稻原生质体

(1)预先配制0.6M甘露醇溶液

(2)将培养好的水稻苗从茎基部截断后，用刀片切成0.5mm薄片，将切好的水稻细条迅速转移入0.6M甘露醇溶液中，在28℃，60-80rpm条件下培养30min。

(3)用Miracloth过滤后，将Miracloth上的水稻薄片转移入含有酶液的250ml三角瓶中，用锡箔纸包住，避免见光，放入28℃摇床，在黑暗条件下60-80rpm酶解4-5h。

Enzyme solution：0.6M甘露醇，10mM MES(pH＝5.7)，1.5％Cellulase R-10(Yakult)，0.75％Macerozyme R-10(Yakult)，0.1％BSA，3.4mM CaCl

(4)加入与酶液等体积的W5溶液，用力摇晃15s，充分释放原生质体。

W5 solution：154mM NaCl，125mM CaCl

(5)用W5溶液润洗灭菌过的网筛，将酶解的原生质体通过网筛，过滤到50ml离心管中，水平转子450g离心3min，离心机升降速调整为3，小心去除上清。

(6)用15ml左右W5溶液重悬原生质体，450g，离心3min。

(7)弃上清，用适量MMG溶液重悬原生质体。

MMG solution：0.6M甘露醇，15mM MgCl

(8)根据实验目的，混合质粒，每种质粒转化的量为10μg，加入100μl上述制备好的水稻原生质体，再加入110μl 40％PEG，轻轻混匀，28℃转化15min。

40％PEG solution：0.6M甘露醇，100mM CaCl

(9)加入1.8ml W5溶液终止反应，450g，离心3min，弃上清。用750μl W5溶液重悬原生质体，转移至24孔培养板中，28℃培养12-16h。

3、CO-IP实验

(1)取40μl proteinA/G beads，incubation buffer洗beads 3次，加入400μlincubationbuffer(加入相应体积的PMSF和PI)，用移液器吹打混匀，平均分配至1.5ml EP管中，各加入2μl FLAG标签抗体，置于静音混合器孵育2～3h。

(2)收集水稻原生质体

(3)加入Extraction buffer裂解目的蛋白，具体视蛋白量而定；冰上裂解30min，每隔5min涡旋震荡，使原生质体充分裂解。

(4)4℃，12000rpm高速离心10min，将上清液转移至步骤1中的EP管中，加入相应体积预冷的水或Incubation buffer至TritionX-100浓度小于2％，置于静音混合器上混合2～3h。

(5)吸取50～100μl混合后的蛋白提取液作为Input；用Wash buffer洗beads 3～4次，最终加入50μl Wash buffer洗脱beads，加入10μl loading buffer煮沸5～10min，4℃，12000rpm高速离心5min。

(6)上样，进行SDS-PAGE电泳。

(7)Western blot分析，用FLAG抗体(Abmart，M20008)检测IP结果，用MYC抗体(ThermoFisher，9E10)检测CO-IP结果。

Incubation buffer:50mM Tris-HC(l PH7.5)，150mM NaCl，0.5M EDTA，1mM PI，1mM PMSF，20μM MG132。

Extraction buffer：50mM Tris-HCl(PH7.5)，150mM NaCl，0.5M EDTA，1mM PI，1mM PMSF，20μM MG132，10％甘油，0.5％Trition X-100。

Wash buffer：50mM Tris-HCl(PH7.5)，250mM NaCl，0.1％TritionX-100，1mM PI，1mM PMSF，20μM MG132。

正向引物F8：5'-CTCCCCTTGCTCCGTGGATCCATGGACCAGCCGGCGCC-3'

反向引物R8：5'-GTCGTCCTTGTAGTCAGGCCTGCTCCCAGTATTGAAGAAGTT-3'

正向引物F9：

5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCGGGTTAATTAACGGTGAACAAGTGAACAA-3'

反向引物R9：5'-TTTGCGGAGTACCCGGGTACCCTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'

如图12所示，只有加入mOsGSK2-FLAG的泳道，才能检测到MYC-OsWRKY53的杂交信号；未加入mOsGSK2-FLAG的泳道，不能将MYC-OsWRKY53的蛋白免疫沉淀下来；说明在植物体内，OsWRKY53与OsGSK2能够相互结合。

五、OsGSK2对OsWRKY53的体外磷酸化分析

1、将Gateway系统的pENTR-OsWRKY53和pENTR-OsGSK2通过LR的方式，LR至原核诱导表达载体pVP13和pDEST15上，获得MBP-OsWRKY53和GST-OsGSK2。

2、原核诱导表达纯化蛋白

(1)将pVP13-OsWRKY53和pDEST15-OsGSK2转化大肠杆菌BL21

(2)挑取单克隆于含有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，160rpm过夜培养。

(3)按1:100的比例，将菌液加入到新鲜的液体培养基中，37℃，160rpm孵育3～4h，至菌液OD值为0.5左右。

(4)将步骤3的菌液转移至冰上，待菌液冷却下来，加入IPTG至终浓度为1mM，18℃，120rpm培养14～18h。

(5)收集菌体，加入裂解buffer，重悬菌体，冰上放置30min。

(6)超声破碎，4℃，12000rpm，高速离心1h。

(7)将上清转移至新的50ml离心管中，加入相应的结合beads，4℃，静音混合器上孵育3～4h。

(8)收集beads，弃上清，用wash buffer洗8～10次。

(9)加入相应洗脱buffer洗脱目的蛋白。

MBP裂解buffer：200mM NaCl；20mM Tris-HCl，pH＝7.4；1mM EDTA；1mM DTT；1mMPMSF。

MBP wash buffer：200mM NaCl；20mM Tris-HCl，pH＝7.4；1mM EDTA；1mM DTT；1mMPMSF。

MBP洗脱buffer：200mM NaCl；20mM Tris-HCl，pH＝7.4；1mM EDTA；1mM DTT；1mMPMSF；10mM maltose。

GST裂解buffer：140mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na

GST wash buffer：140mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na

GST洗脱buffer：100mM NaCl；50mM Tris-HCl，pH＝10；1mM PMSF。

3、体外磷酸化分析

(1)体外磷酸化反应：

MBP-OsWRKY53(适量)；GST-GSK2(适量)；1M Tris-HCl(PH7.5)0.5μl；

2M MgCl

(2)加Loading buffer，煮沸5～10min。

(3)上样，进行SDS-PAGE电泳。

(4)转膜后，根据Phos-tag Biotin BTL-104反应试剂盒进行化学发光检测(APExBIO,F4001)。

如图13所示，GST-OsGSK2蛋白能够磷酸化MBP-OsWRKY53蛋白；并且，在GST-OsGSK2蛋白量足够的情况下，加入MBP-OsWRKY53蛋白量越多，OsWRKY53的磷酸化信号越强。为验证OsGSK2对OsWRKY53磷酸化的特异性，加入OsGSK2的竞争性抑制剂bikinin，发现随着bikinin加入量的增多，OsWRKY53的磷酸化信号逐渐减弱。以上实验充分表明，OsGSK2能够特异的磷酸化OsWRKY53。

五、OsGSK2降低OsWRKY53的蛋白稳定性分析

1、制备水稻原生质体(方法同上)

2、根据实验目的，混合质粒，转化水稻原生质体，过夜培养14h。

3、收集水稻原生质体，加入SDS裂解液(含1mM PMSF，1mM PI，20μM MG132)，冰上裂解30min。

4、加入Loading buffer，煮沸5～10min。

5、上样，进行SDS-PAGE电泳。

6、转膜后，用MYC抗体检测MYC-OsWRKY53的表达特征。

如图14所示，加入OsGSK2的泳道，MYC-OsWRKY53蛋白水平的表达量显著降低，说明OsGSK2能够降低OsWRKY53的蛋白稳定性。

六、Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体的获得

1、载体构建：以日本晴cDNA为模板，参照TaKaRa公司的

正向引物F10：5'-GTTACTTCTGCACTAGGTACCATGGCGTCCTCGACGGGG-3'

反向引物R10：

5'-TCTTAGAATTCCCGGGGATCCCTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'

2、以BR功能获得型突变体Osbzr1-D为实验材料，采用农杆菌介导的遗传转化手段获得Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体。

3、通过qRT-PCR以及Western blot的方式对双突变体进行鉴定。

如图15所示，Osbzr1-D OsWRKY53-OE双突变体表现出较单突变体更加显著的BR信号增强的表型，双突变体叶倾角大于单突变2倍左右，说明OsBZR1和OsWRKY53在叶倾角的调控面上存在协同作用(图16，17)。叶倾角对外源BR的敏感性实验分析发现，Osbzr1-DOsWRKY53-OE双突变体叶倾角对外源BR的敏感性显著强于单突变体，说明OsBZR1和OsWRKY53协同调控BR信号反应(图18，19，图19中■表示WT，●表示WRKY53-OE，▲表示bzr1-D，◆表示bzr1-DWRKY53-OE)。

七、Osbzr1-D oswrky53双突变体的获得

1、以Osbzr1-D转基因水稻为实验材料，采用农杆菌介导的遗传转化手段获得Osbzr1-Doswrky53双突变体。

2、通过测序以及Western blot的方式对双突变体进行鉴定。

如图20所示，是Osbzr1-D oswrky53双突变体的总体形态图，从图中可以发现，在Osbzr1-D中敲除OsWRKY53基因后，并不影响Osbzr1-D在BR表型方面的表现，主要体现在叶倾角大小的调控以及BR生物合成基因的表达上，双突变体与Osbzr1-D的表现都无显著差异(图21，22，23)。说明在在BR信号的调控上，OsWRKY53与OsBZR1是一种平行的关系，二者协同调控BR下游相关基因的表达。

八、OsWRKY53与OsBZR1的双分子荧光互补结果

1、将OsWRKY53和OsBZR1(引物：F11和R11)分别连入入门载体pENTR中，获得pENTR-OsWRKY53和pENTR-OsBZR1。随后，通过LR的方式，LR至植物表达载体c-GFP和n-GFP上，获得cGFP-OsWRKY53和nGFP-OsBZR1。

2、采用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草叶片(方法同上)

3、注射好的烟草叶片，暗培养12h，正常光照条件培养2～3天，剪取叶片进行激光共聚焦显微镜观察。

正向引物F11：5'-caccATGACGTCCGGGGCGGCGG-3'

反向引物R11：5'-TCATTTCGCGCCGACGCCGAG-3'

如图24所示，只有将OsWRKY53和OsBZR1共同注射的烟草叶片，才能检测到绿色荧光信号，并且互作复合物定位在细胞核内；单独转入其中一方的烟草叶片，检测不到绿色荧光信号；说明OsWRKY53和OsBZR1在植物体内能够相互结合。

九、OsWRKY53与OsBZR1的LUC互补成像系统分析

1、将OsWRKY53和OsBZR1(引物：F12和R12)分别连入植物表达载体pCAMBIA1300-cLUC和pCAMBIA1300-nLUC中，获得cLUC-OsWRKY53和nLUC-OsBZR1。

2、采用农杆菌介导的遗传转化方法，注射烟草叶片(方法同上)。

3、培养3天后，剪取待观察叶片，在表面涂抹终浓度为1mM的Beetle luciferinpotassium salt(Promega,E1605)，暗处理10min，于化学发光成像仪(Tanon 5200)上进行显像。

正向引物F12：5'-ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGACGTCCGGGGCGGCGG-3'

反向引物R12：5'-CGCGTACGAGATCTGGTCGACTTTCGCGCCGACGCCGAG-3'

如图25所示，只有将OsWRKY53和OsGSK2同时转入的烟草叶片，才能检测到LUC信号；而单独将其中一方与空载体转入的烟草叶片，检测不到LUC信号；说明在植物体内，OsWRKY53与OsBZR1存在互作关系。

十、OsWRKY53与OsBZR1的免疫共沉淀分析

1、将OsWRKY53和OsBZR1(引物：F13和R13)分别连入植物表达载体HBT-FLAG和1300-221-Flag中，获得MYC-OsWRKY53和FLAG-OsBZR1。

2、转化水稻原生质体(方法同上)

3、CO-IP实验(方法同上)

正向引物F13：5'-ACGATGATAAGGGCGGTACCATGACGTCCGGGGCGGCGG-3'

反向引物R13：5'-AGGCTACGTAGGATCCTTTCGCGCCGACGCCGAG-3'

如图26所示，只有加入OsBZR1-FLAG的泳道，才能检测到MYC-OsWRKY53的杂交信号；未加入OsBZR1-FLAG的泳道，不能将MYC-OsWRKY53的蛋白免疫沉淀下来；说明在植物体内，OsWRKY53与OsBZR1能够相互结合。

十一、OsWRKY53与OsBZR1协同抑制OsD2转录表达分析

1、将OsWRKY53(引物：F14和R14)和OsBZR1(引物：F15和R15)分别连入植物表达载体PRT107中，获得效应载体PRT107-OsWRKY53和PRT107-OsBZR1。将OsD2(引物：F16和R16)连入pGreenII 0800-LUC，获得报告载体pGreenII 0800-LUC-OsD2。

2、转化水稻原生质体(方法同上)

3、采用碧云天的植物双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)检测相对LUC活性。

正向引物F14：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGGCGTCCTCGACGGGG-3'

反向引物R14：

5'-TTTGCGGAGTACCCGGGTACC CTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'

正向引物F15：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGACGTCCGGGGCGGCGG-3'

反向引物R15：5'-TTTGCGGAGTACCCGGGTACCTCATTTCGCGCCGACGCCGAG-3'

正向引物F16：5'-GGGCCCCCCCTCGAGGTCGACTTACTTGTTTTCTTTTCTGT-3'

反向引物R16：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCTTTTCTACCCCTCGAG-3'

如图28所示，OsBZR1和OsWRKY53都降低OsD2启动子驱动的LUC基因的表达，而将两者共同转入后，其LUC基因的表达受到更加显著的抑制(图27，28)。以上结果充分说明，OsWRKY53和OsBZR1通过相互结合协同调控BR下游响应基因的表达。

序 列 表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120> OsWRKY53 在正向调控BR信号中的应用

<160> 32

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F1

<400> 1

ggcattccagtcgtacctctgagc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R1

<400> 2

aaacgctcagaggtacgactggaa 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F2

<400> 3

gccgagctggaggacgggtacaac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R2

<400> 4

aaacgttgtacccgtcctccagct 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F3

<400> 5

cggggtgcccaagttcaagtc 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R3

<400> 6

atggagcagccgttgtaggtg 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F4

<400> 7

caccatggcgtcctcgacgggg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R4

<400> 8

ctagcagaggagcgactcgacg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F5

<400> 9

caccatggaccagccggcgcc 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R5

<400> 10

ttagctcccagtattgaagaagtt 24

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F6

<400> 11

tacgcgtcccggggcggtaccatggcgtcctcgacgggggg 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R6

<400> 12

acgaaagctctgcaggtcgacgcagaggagcgactcgacga 41

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F7

<400> 13

acgggggacgagctcggtaccatggaccagccggcgcc 38

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R7

<400> 14

cgcgtacgagatctggtcgacgctcccagtattgaagaagtt 42

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F8

<400> 15

ctccccttgctccgtggatccatggaccagccggcgcc 38

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R8

<400> 16

gtcgtccttgtagtcaggcctgctcccagtattgaagaagtt 42

<210> 17

<211>50

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F9

<400> 17

cgctctagaactagtggatccgggttaattaacggtgaacaagtgaacaa 50

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R9

<400> 18

tttgcggagtacccgggtaccctagcagaggagcgactcgacg 43

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F10

<400> 19

gttacttctgcactaggtaccatggcgtcctcgacgggg 39

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R10

<400> 20

tcttagaattcccggggatccctagcagaggagcgactcgacg 43

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F11

<400> 21

caccatgacgtccggggcggcgg 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R11

<400> 22

tcatttcgcgccgacgccgag 21

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F12

<400> 23

acgggggacgagctcggtaccatgacgtccggggcggcgg 40

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R12

<400> 24

cgcgtacgagatctggtcgactttcgcgccgacgccgag 39

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F13

<400> 25

acgatgataagggcggtaccatgacgtccggggcggcgg 39

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R13

<400> 26

aggctacgtaggatcctttcgcgccgacgccgag 34

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F14

<400> 27

cgctctagaactagtggatccatggcgtcctcgacgggg 39

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R14

<400> 28

tttgcggagtacccgggtaccctagcagaggagcgactcgacg 43

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F15

<400> 29

cgctctagaactagtggatccatgacgtccggggcggcgg 40

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R15

<400> 30

tttgcggagtacccgggtacctcatttcgcgccgacgccgag 42

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F16

<400> 31

gggccccccctcgaggtcgacttacttgttttcttttctgt 41

<210> 32

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R16

<400> 32

cgctctagaactagtggatccccttttctacccctcgag 39