抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物载体，特别涉及一种可以在肿瘤组织局部靶向性投递药物的抗肿瘤的PD-L1单抗靶向载药高分子及其制备方法和应用。

背景技术

目前晚期肿瘤治疗的主要手段是内科治疗，但是作为内科治疗重要手段化疗药物存在的毒副作用非常大，使得化疗的应用受到诸多限制。许多和化疗相关的毒副作用是和化疗药物的剂量大小呈正相关关系，降低化疗药物的给药剂量可以减轻毒副作用，但是这又同时会降低抗肿瘤疗效，因此化疗药物的疗效和毒性之间存在着矛盾。近几年来免疫卡控点抑制剂尤其是针对PD-1/PD-L1的免疫治疗在实体肿瘤中的应用越来越广泛，但是免疫不良事件屡见不鲜，其主要的原因是PD1/PD-L1非靶向性摄取导致正常器官的自身免疫不良事件，最严重的可导致致死性事件的发生。

解决这一矛盾的思路是采用靶向性药物载体对药物进行投递，使其在肿瘤局部进行靶向性释放。靶向性药物投递可以使化疗药物在肿瘤局部达到高浓度，但其余正常组织的药物浓度较低，既可以提高药物疗效，又可以避免产生严重的毒副作用。现有技术中，已有许多靶向药物载体被报道：如热靶向，即在肿瘤局部进行热疗，使药物在热疗部位靶向性释放；又如磁靶向，是在肿瘤部位外加磁场，从而磁性载体定向到肿瘤。然而，由于热靶向和磁靶向都需要外界的热疗设施或磁场，在实施时，病灶的部位必须明确，因此对于病灶不明、病灶深在或者广泛转移的病灶，就不能充分发挥作用；从手段来说，也相对较为复杂。而纳米材料投递系统近几年来飞速发展，肿瘤靶向富集(enhanced permeability andretention effect，EPR)效应是其最突出的特点：肿瘤组织的血管内皮不完整，细胞间隙约100～780nm，载体容易穿过肿瘤的血管缺损处进入肿瘤组织，并且由于清除障碍而在肿瘤组织中长时间聚集，保持局部较高的药物浓度，即EPR效应，药物载体通常不能穿过正常毛细血管(内皮间隙﹤100nm)。但是现有技术中的纳米材料也存在靶向效果差的问题。

发明内容

发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子及其制备方法和应用。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子，其结构式如式(I)所示：

其中，所述PD-L1单抗选自阿特珠单抗(atezolizumab)，其分子式为C

所述抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子，是由一端氨基被保护的两端氨基化聚乙二醇2000和己内酯开环聚合反应生成聚乙二醇-聚己内酯，然后聚乙二醇-聚己内酯末端的氨基和PD-L1单抗末端的羧基发生酰胺化反应所制得。

所述的抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子的制备方法，包括以下步骤：

(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：

(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：在三乙胺存在下，以PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；

(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾反应，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；

反应式如下(包括优选反应条件和原料)：

(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH

(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO

反应式如下(包括优选反应条件和原料)：

(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：

(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH

反应式如下(包括优选反应条件和原料)：

(4)PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)的制备；

在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，聚乙二醇-聚己内酯(NH

反应式如下(包括优选反应条件和原料)：

作为优选：

步骤(1.1)中，反应温度为室温，反应时间为18-30h；PEG2000和对甲苯磺酰氯的摩尔用量比为1:(2-3)，反应在三乙胺存在条件下进行，三乙胺在反应溶剂中的质量百分比浓度为0.3-1.0％；

步骤(1.2)中，反应温度为110-130℃，反应时间为8-16h；磺酰化聚乙二醇和邻苯二甲酰亚胺钾的摩尔用量比为1:(2-3)；

步骤(2.1)中，反应温度为70-90℃，反应时间为8-16h；二甲酰亚胺化聚乙二醇和水合肼的摩尔用量比为1:(2-3)；

步骤(2.2)中，反应温度为-5℃-5℃，反应时间为18-30h；两端氨基化聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯的摩尔用量比为1：(1-2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％；反应在碳酸氢钠存在条件下进行，碳酸氢钠在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％，反应体系pH为7.0-7.5。

步骤(3.1)中，反应温度为120-140℃，反应时间为4-8h；一端氨基被保护的两端氨基化聚乙二醇和己内酯的摩尔用量比为1：(1.0-1.5)；步骤(3.2)中，反应温度为室温，反应时间为0.5-2h；末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯和三氟乙酸的用量比为1:(4-6)。

步骤(4)中，反应体系pH8.0-9.0，反应温度为室温，反应时间为8-12h；聚乙二醇-聚己内酯和PD-L1单抗的摩尔用量比为1：(1-2)。所述PD-L1单抗选自阿特珠单抗(atezolizumab)，其分子式为C

本发明还提供了所述的抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子所制成的纳米粒子。

作为一种具体方案，将PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)溶于体积比(1-3)：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入20-30倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得所述纳米粒子。

本发明还提供了包含所述抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子的组合物。

本发明还提供了所述的抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子、所述的纳米粒子、或所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明最后还提供了所述抗肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子作为抗肿瘤药物载体的应用。

本发明利用PD-L1-PEG-PCL对部分特异性表达PD-L1的胃癌亚型给药，所制得的载体可靶向将药物投递至肿瘤部位并释放，使药物被肿瘤组织靶向摄取；同时，通过SDS-PAGE检测，PD-L1单抗连接到PEG-PCL上后，其生物学活性没有发生明显的改变。进一步通过体外实验证实，相对于PD-L1单抗裸药，用含有同等PD-L1单抗药物浓度的PD-L1-PEG-PCL和PD-1+PD+TIL细胞共培养后对PD-L1阳性的胃癌细胞抑制率相当；同时，该靶向纳米粒子能有效靶向投递到肿瘤组织，可有效降低正常组织的毒副作用，同时又能通过PD-L1单抗的免疫卡控点抑制作用抑制肿瘤细胞的生长，有效解决了抗肿瘤靶向药物载体，药物投递系统各自存在的缺陷。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供的肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子靶向性好、毒副作用小，通过开环聚合法制备，还可以通过纳米沉淀法获得负载药物的高分子纳米粒子，工艺简单、成本低廉、收率高、副反应少。

附图说明

图1为PD-L1单抗靶向纳米粒子合成示意图；

图2为XPS检测PD-L1单抗连接前后纳米粒子氮原子含量示意图；

图3为PD-L1单抗和PD-L1单抗连接PEG-PCL后SDS-PAGE电泳结果示意图。

图4为不同实验组对PD-L1阳性胃癌细胞株NUGC4(A)和PD-L1阴性胃癌细胞株SGC7901(B)细胞毒性示意图。

图5为NUGC4和SGC7901胃癌细胞株对负载荧光物质香豆素-6的PD-L1单抗-NPs和NPs的摄取示意图。

具体实施方式

以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中PD-L1单抗均选自阿特珠单抗(atezolizumab)，商品名泰圣奇(美国罗氏公司)，其分子式为C

实施例1

肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：

(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：二氯甲烷溶剂中，在三乙胺存在下，以摩尔比1:2.5的PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料，室温反应24h制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；三乙胺在溶剂中的质量百分比浓度为0.5％；

(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：摩尔比1:2.5的磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾120℃反应12h，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；

(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH

(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，摩尔比1：2.5的两端氨基化聚乙二醇(NH

(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：

(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，摩尔比1：1.2的一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH

(4)PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)的制备；

pH8.5硼酸缓冲液中，在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，摩尔比1：1.5的聚乙二醇-聚己内酯(NH

(5)PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：

将PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)溶于体积比1：1的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入25倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。

实施例2

肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：

(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：二氯甲烷溶剂中，在三乙胺存在下，以摩尔比1:2的PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料，室温反应30h制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；三乙胺在溶剂中的质量百分比浓度为1.0％；

(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：摩尔比1:2的磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾110℃反应16h，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；

(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH

(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，摩尔比1：1的两端氨基化聚乙二醇(NH

(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：

(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，摩尔比1：1.0的一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH

(4)PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)的制备；

pH8.0硼酸缓冲液中，在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，摩尔比1：1的聚乙二醇-聚己内酯(NH

(5)PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：

将PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)溶于体积比1：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入20倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。

实施例3

肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：

(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：二氯甲烷溶剂中，在三乙胺存在下，以摩尔比1:3的PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料，室温反应18h制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；三乙胺在溶剂中的质量百分比浓度为0.3％；

(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：摩尔比1:3的磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾130℃反应8h，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；

(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH

(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，摩尔比1：2的两端氨基化聚乙二醇(NH

(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：

(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，摩尔比1：1.5的一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH

(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH

(4)PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)的制备；

pH9.0硼酸缓冲液中，在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，摩尔比1：2的聚乙二醇-聚己内酯(NH

(5)PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：

将PD-L1单抗-聚乙二醇-聚己内酯(PD-L1-PEG-PCL)溶于体积比3：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入30倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。

实施例4

肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备，包括以下步骤：

(1)制备二甲酰亚胺化聚乙二醇：将PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)同溶解在二氯甲烷中的三乙胺常温真空干燥24小时，通过90％乙醚沉淀得合成物对甲苯磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)，溶在二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中的苯二甲酰亚胺钾(phthalimidepotassium)，120℃条件下反应12小时后得产物二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；

(2)制备一端氨基被保护的两端氨基化聚乙二醇：PI-PEG-PI和水合肼(hydrazinehydrate)80℃无水乙醇回流反应12小时得两端氨基化聚乙二醇(NH

(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物的合成：Boc-PEG-NH

(4)将NH

(5)将PD-L1-PEG-PCL聚合物溶于等体积的乙醇和丙酮中，再将所制得的溶液滴入25倍等体积的冷存水中，减压抽除以有机溶剂，将溶液冷冻干燥得到载体，-20℃保存。

采用本发明制备的药物载体，可输送多种治疗肿瘤的药物(如多西紫杉醇，紫杉醇，阿霉素)，中药单体(如藤黄酸，汉防己甲)和分子靶向药物(C-225)。

实验例1比较负载化疗物后得细胞毒作用

以PD-L1-PEG-PCL和PEG-PCL为载体，通过纳米沉淀法构建了负载化疗药物多西他赛的PD-L1单抗靶向纳米粒子PD-L1单抗-NPs-多西他赛，和无靶向作用的载药纳米粒子NPs-多西他赛。

结果显示：PD-L1单抗-NPs-多西他赛对PD-L1高表达的胃癌细胞株NUGC4毒性明显高于PD-L1单抗+NPs-多西他赛和PD-L1单抗+多西他赛组，见图4A；而对于PD-L1低表达的胃癌细胞株SGC7901 PD-L1单抗-NPs-多西他赛，PD-L1单抗+NPs-多西他赛和PD-L1单抗+多西他赛组细胞毒性无明显区别，和单独应用多西他赛的细胞毒性相当，见图4B。

实验例2细胞摄取实验

通过纳米沉淀法将PD-L1-PEG-PCL和PEG-PCL负载宿舍性荧光染料香豆素-6(模拟多西他赛)进行细胞摄取实验。

结果显示：NUGC4的对TNPs-罗丹明B的摄取明显高于NPs-罗丹明B的摄取，而在SGC7901中的摄取两者相当，且都明显低于TNPs-罗丹明B在NUGC4中的摄取，见图5。这一结果也解释了PD-L1单抗靶向纳米粒子负载化疗药物后对胃癌细胞的抑制作用最强。

PEG链段上的每个乙二醇单元，都可以紧密结合两个或三个相关联的水分子，形成一层水化层，有效保护了载药颗粒之间的碰撞，增加了颗粒的稳定性；同时该水化层也像保护一样减少了颗粒与血浆蛋白的粘附，避免颗粒被快速清除，有效延长颗粒的血液循环时间，改善颗粒的药代动力学。但是，PEG修饰在一定程度上妨碍纳米载药颗粒与靶细胞膜的相互作用，而且降低了颗粒的内含体逃逸能力，所以设计合理的PEG化修饰的纳米体系，成为非常需要的科学问题。

本发明构建了PD-L1单抗靶向PEG-PCL纳米载药系统，制得的肿瘤PD-L1单抗靶向载药高分子采用PD-L1单抗、聚乙二醇、聚己内酯的组合，其在PEG的保护下完成血液循环，通过PD-L1单抗和胃癌表面PD-L1受体相互作用，增加颗粒内吞(见图1)。

本发明聚合物纳米粒子具有良好的生物相容性和稳定性。其中，嵌段共聚物PEG-PCL在水溶液中可自发形成胶束，PCL形成疏水“内核”，亲水段PEG为“外壳”；疏水性内核可作为疏水性化疗药物的载体，为其提供一个稳定的内环境，而亲水性外壳可以使胶束稳定存在于水溶液或体液中。亲水片段采用分子量2000的PEG，有利于从人体肾脏中排出体外。疏水片段采用的聚己内酯，为生物可降解材料，水解后对人体无毒性。

PD-L1单抗含有1714个氮原子，通过X射线光电子能谱学检测到连接上PD-L1单抗的PEG-PCL其氮原子含量肯定要明显高于单纯的PEG-PCL纳米粒子，见图2：在396(ev)位置，连接PD-L1单抗后纳米粒子(PD-L1-PEG-PCL)氮原子含量明显要高于未连接状态下的纳米粒子(PEG-PCL)。因为PD-L1单抗本身对PD-L1阳性的胃癌细胞具有ADCC作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)抑制肿瘤细胞的生长，我们通过SDS-PAGE检测其通过酰胺化反应和PEG-PCL连接后是否发生变性，电泳结果表明在连接前后PD-L1单抗并没有发生蛋白变性，见图3。该靶向纳米粒子既有靶向投递药物的能力，同时又具有抑制肿瘤细胞的功能。

本发明载药系统通过载体自身的性质和化学修饰形成被动靶向和主动靶向效应可以一定程度上实现药物的靶向作用，在增加肿瘤局部药物浓度的同时，降低了药物全身其他部位的浓度。