控制刚毛藻生长的复合植物提取物、组合物及使用方法

技术领域

本发明属于海水池塘养殖技术领域，具体涉及一种控制刚毛藻生长的复合植物提取物、组合物及使用方法，用于海水养殖池塘刚毛藻异常生长的处理。

背景技术

池塘养殖是我国海水养殖的主要形式之一。近年来，受到“高投入高产出”观点的影响，肥水剂、人工饲料等投入品的乱用滥用问题日益严重，导致养殖池塘营养物质循环紊乱、生态系统失衡，富营养化加剧。

刚毛藻是一种典型的底栖附着藻类，其异常生长是水体富营养化的直观表象，这种现象已经在海水养殖池塘普遍存在，并造成了严重的环境污染和经济损失。刚毛藻的危害主要表现在以下几个方面：摄取水体中有限的营养成分，抑制池塘基础饲料和单胞藻的正常繁殖和生长；与养殖生物竞争生存空间，并且缠绕鱼苗、参苗等养殖对象，影响其生长；分解腐烂后产生毒素，沉积池底后易导致底层缺氧，使养殖环境恶化、养殖对象死亡。

目前，针对海水养殖池塘大型藻类过度繁殖的处理措施主要有三类方法：(1)物理方法：包括常见的人工打捞，以及各种清除设备，如专利CN201621093610.1；(2)化学方法：主要是向池塘水体中泼洒各种化学试剂，如专利CN201911029396.1、CN201611139741.3、CN201510397531.3；(3)生物方法：包括向水体中投放微生态制剂、酶制剂，以及以藻控藻、高等水生植物控藻、滤食性鱼类食藻等方法，如专利CN201710673708.7、CN201810342790.X、CN201710836673.4。但因刚毛藻具有繁殖能力快、生长适应性强、再生能力强等特点，尚无较好的处理方法。人工打捞会导致刚毛藻配子放散后迅速固定发育形成新的个体，生物方法多用于前期防治阶段，化学方法可以抑制刚毛藻的快速生长，但也会进一步破坏池塘生态系统，造成二次污染。

近些年，有研究者发现某些植物可以抑制淡水中微藻的生长。例如大麦秸秆、大萍及其碱类提取物、单宁酸可以显著抑制铜绿微囊藻的生长，可见植物可以通过化感作用或是其某些活性成分抑制藻类的异常生长，但该研究尚处于实验室研究阶段，且多集中于淡水水域。目前，有关处理海水养殖池塘刚毛藻异常生长的方法多以预防为主；针对已经出现刚毛藻异常生长的池塘，还没有较好的快速有效的原位处理方法。

发明内容

本发明利用植物提取物生物活性成分多样、低毒副作用等特点，提供了一种利用复合植物提取物原位处理海水养殖池塘刚毛藻异常生长的使用方法，既能够有效控制海水养殖池塘中刚毛藻的异常生长，且能改善优化养殖环境，不影响养殖对象生长，有效解决了现有技术中药物控制藻类生长导致的环境恶化以及二次污染问题。

本发明是通过如下技术方案来实现的:

一种用于控制海水养殖池塘刚毛藻异常生长的复合植物提取物溶液，其原料及所占比例：百里香提取物的体积百分比10％～15％，紫苏提取物的体积百分比3％～5％，薄荷提取物的体积百分比3％～5％，桉树叶提取物的体积百分比3％～5％，丁香提取物的体积百分比1％～3％，助溶剂的体积百分比10％～15％，增溶剂的质量百分比为3％～5％，其余为蒸馏水。

进一步，所述的助溶剂为无水乙醇。

进一步，所述的增溶剂为非离子型表面活性剂，如泊洛沙姆。

所述植物提取物均使用由水蒸气蒸馏法提炼的植物精油，其含有的主要生物活性成分包括百里香酚、迷迭香酸、薄荷醇、桉叶油素以及丁香酚等，在多种成分的相互协同作用下，可以破坏植物细胞壁和细胞膜的结构，进而改变细胞膜的通透性，导致细胞内容物的渗漏，进而影响细胞代谢。

所述复合植物提取物溶液配置完成后作为母液使用，密封避光保存。

本发明还提提供一种控制海水养殖池塘刚毛藻异常生长的组合物，所述组合物包括以下组合和质量分数：生物质炭30份～40份，沸石粉30份～40份，膨润土25份～30份，复合植物提取物溶液10份～15份，淀粉3份～5份，上述组合物混合均匀制成颗粒。

进一步，所述生物质炭为植物提取物百里香和紫苏加工过程中形成的剩余固形物，经过晾晒粉碎后，过100目筛，密封包装保存；

进一步，所述沸石粉粒径为80目～200目。

进一步，所述膨润土粒径为200目～300目。

进一步，所述组合物的颗粒粒径为5mm～10mm。

本发明提供了一种控制海水养殖池塘刚毛藻异常生长的组合物的使用方法方法，所述方法具体步骤如下：

1)刚毛藻开始生长的前期，将池塘水位提升至1.5m～2.0m的高位，透明度保持在30cm～40cm；待池塘水温上升至25℃～30℃，选择晴日中午阳光强烈、池塘水温高的时候，将所述组合物颗粒泼洒于池塘中，使用量为3kg/亩～5kg/亩，颗粒泼洒后，池塘10天～15天不换水。待生长的刚毛藻藻体陆续上浮、藻体变色死亡时，及时人工打捞出死亡藻体，防止其下沉至池底腐烂，破坏底质。

本发明与现有技术相比的有益效果：

(1)本发明所用原料为纯植物提取物，具有天然性，相比化学药物，既不影响养殖对象生长，对养殖动物无损害，保证食品安全，也不会对养殖环境造成二次污染。

(2)本发明中利用复合植物提取物中多种生物活性物质之间的协同作用，通过破坏细胞结构抑制刚毛藻生长繁殖，相比除草剂等的单一分子结构，不易产生抗药性。

(3)本发明中通过构建载体，以颗粒的形式使用，能克服植物提取物易氧化、易挥发的问题，也减少了复合植物提取物被提前稀释，使得植物提取物能保持更高有效浓度沉降于池塘底部，作用于刚毛藻藻体及根部，相比除草剂等仅杀灭地上部分，本发明组合物能够有效清除刚毛藻整个植株，抑制二次生长；同时，可以使得植物提取物的活性成分缓慢释放，作用效果舒缓长效，避免对养殖对象和养殖环境的剧烈影响。

(4)本发明中利用生物质炭本身的孔隙结构为植物提取物的吸附和包埋提供了场所，同时所选择生物质炭自身沉降于池塘底部后也具有改良池底的作用。

(5)使用方法简单、易操作，更符合海水池塘养殖实际应用需求。

附图说明

图1为不同浓度植物提取物溶液对刚毛藻生长存活的影响。

图2为不同温度下植物提取物溶液对刚毛藻生长存活的影响。

图3不同温度下添加载体对植物提取物作用于刚毛藻的影响。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

植物提取物溶液的提取方法:

将所用植物原料(百里香、紫苏、薄荷、桉树叶和丁香)洗净并晾干，粉碎至20目～80目，加入蒸馏水，液料比4:1～10:1，浸泡8h～12h，进行加热蒸馏，回流提取时间3h～8h。

实施例1

将一部分刚毛藻移入含有100mL天然海水中，并分别添加5种不同组方的植物提取物溶液，组方1：百里香提取物15％；组方2：百里香提取物15％+紫苏提取物3％；组方3：百里香提取物15％+薄荷提取物3％；组方4：百里香提取物15％+桉树叶提取物3％；组方5：百里香提取物15％，紫苏提取物3％，薄荷提取物3％，桉树叶提取物3％，丁香提取物1％。5种组方所用助溶剂均为无水乙醇，其体积百分比10％，增溶剂为泊洛沙姆，其质量百分比为3％，其余为蒸馏水添加浓度为500ppm和1000ppm。跟踪观察刚毛藻生长状况及变化。

结果显示，在1000ppm浓度下，5种不同组方的植物提取物均使得刚毛藻发生褪色，组方1中刚毛藻褪色，上层悬浮部分为白色，下层为黄色，7天～10天后逐渐恢复绿色；组方2、3、4中刚毛藻绝大部分白化，仅余极少部分藻体为黄色，7天～10天后逐渐恢复绿色，并长出新的分枝，其中起效较快的是组方3和组方4，组方2中的刚毛藻较晚长出新枝；组方5中刚毛藻完全白化并死亡。在500ppm浓度下，组方1中刚毛藻初始褪色为黄色，经过3天后逐渐变为绿色；组方2、3、4中刚毛藻部分上层悬浮枝干白化，剩余部分逐渐恢复并长出新的分枝；组方5中刚毛藻完全白化死亡。可见，在高浓度下不同组方的植物提取物均能对刚毛藻细胞结构产生一定的破坏作用，且复合组方的作用效果优于单一组方；同时，通过优化组方，可以减少植物提取物的有效作用浓度，提高不同生物活性成分之间的协同效果。

实施例2：不同浓度植物提取物溶液对刚毛藻生长存活的影响。

实验用刚毛藻藻样采集于青岛即墨海水养殖池塘。首先用海水初步清洗样品然后用灭菌后的海水多次冲洗藻体，以去除藻体表面的泥沙等杂物，并于含有天然海水的室内模拟池中进行暂养。实验中所有实验组均在12:12光照：黑暗循环下进行培养，光照强度为100μmol﹒photon﹒m

复合植物提取物中各成分所占比例为：百里香提取物15％，紫苏提取物3％，薄荷提取物3％，桉树叶提取物3％，丁香提取物1％，助溶剂无水乙醇的体积百分比10％，增溶剂泊洛沙姆的质量百分比为3％，其余为蒸馏水。

将一部分刚毛藻移入含有100mL天然海水中，并分别添加复合植物提取物至相应的浓度值(设置3个浓度梯度，依次为：500ppm、250ppm、100ppm)，于室温下(18℃～22℃)进行7天的培养观察。在实验过程中，每天取一部分藻体于显微镜下进行细胞形态观察。

结果显示，根据对实验中刚毛藻外观的观察发现，随着实验的进行，500ppm和250ppm浓度组下的刚毛藻发生明显变化，并停止生长；500ppm浓度组的刚毛藻完全褪色白化；250ppm浓度组的刚毛藻虽发生白化现象但仍有新枝长出，100ppm条件下的刚毛藻与初始状态无明显差异，但生长缓慢。通过在显微镜下对各实验组刚毛藻的细胞形态进行观察发现(如图1所示)，500ppm和250ppm浓度组刚毛藻的细胞结构发生变化，细胞质渗漏萎缩，细胞褪色至白化状态，失去活性，藻体有解体分离的趋势；而100ppm浓度组的藻细胞形态与对照组无明显差异，仍具有活性。可见，复合植物提取物对刚毛藻细胞结构的影响显著，可以抑制其生长，甚至死亡；在实验室条件下，复合植物提取物对刚毛藻的最低有效作用浓度在100ppm～250ppm之间，完全杀灭刚毛藻的浓度在250ppm～500ppm之间。

实施例3：不同温度下植物提取物溶液对刚毛藻生长存活的影响

实验用刚毛藻样品的采集及室内培养参见实施例2。将一部分刚毛藻移入含有100mL天然海水中，并添加复合植物提取物，根据第一部分的实验结果选取200ppm为实验浓度值，培养温度为20℃、25℃、30℃三个梯度，实验周期为7天。在实验过程中，每天取一部分藻体于显微镜下进行细胞形态观察。

结果显示，根据对实验中刚毛藻的外观进行观察发现，不同温度条件下的刚毛藻均发生变化，在20℃和25℃条件下，刚毛藻从起始的绿色逐渐变为黄色，并有部分藻体发生白化现象；30℃条件下的刚毛藻从最初的绿色至实验结束完全褪色至白化状态。通过在显微镜下观察各实验条件下刚毛藻的细胞形态发现(如图2所示)，复合植物提取物对各温度条件下的刚毛藻均有抑制作用，20℃条件下的刚毛藻有明显的损伤，细胞壁破裂，藻细胞呈现部分细胞质萎缩并失去活性的状态；25℃条件下的刚毛藻的细胞质发生渗漏萎缩，并出现藻体解体分离的趋势；30℃条件下的藻细胞已经完全失去活性，藻体纤维化，细胞质萎缩并分解。可见，温度的升高与复合植物提取物的作用效果呈正相关，在实验温度范围内(20℃～30℃)，在30℃时复合植物提取物对刚毛藻的作用效果最显著。

实施例4：不同温度下添加载体对植物提取物作用于刚毛藻的影响.

实验用刚毛藻样品的采集及室内培养参见实施例2。将一部分刚毛藻移入含有1000mL的天然海水中进行培养，添加1g含有复合植物提取物的载体(两个浓度组：20ppm和10ppm)，每一浓度组均设三个培养温度：20℃、25℃、30℃。在实验过程中，每天取一部分藻体于显微镜下进行细胞形态观察。

结果显示，与实施例2、3相比，加入载体之后，复合植物提取物对刚毛藻的作用效果得到了显著提升。通过对20ppm浓度下的各实验组的观察发现，在20℃、25℃和30℃三个温度条件下的刚毛藻与起始状态相比均发生明显变化，藻体全部褪色至白化状态。根据各组中刚毛藻细胞形态的观察结果显示(如图3所示)，20ppm浓度下各实验组的藻细胞均出现纤维化，细胞渗漏质萎缩，藻体分解；10ppm浓度下，20℃和25℃条件下的刚毛藻出现部分白化现象，但大部分的藻体仍为绿色，生长缓慢，而在30℃条件下的藻体整体发黄，并有部分白化，显微观察结果显示，刚毛藻的细胞均受到不同程度的损伤，在20℃条件下藻细胞的细胞质出现黑色斑点，颜色也变为黄色，藻体的生长得到抑制，但仍有继续生长繁殖的能力；25℃条件下的藻细胞出现部分细胞质萎缩并失去活性的现象，藻体的生长得到完全抑制；30℃条件下的部分藻细胞出现纤维化，完全失去活性，细胞质萎缩并分解。可见，在加入载体之后，复合植物提取物在10ppm时对刚毛藻的生长有抑制作用，在20ppm时可以杀灭刚毛藻，并在高温(30℃)条件下达到更好的作用效果；载体的使用减缓了复合植物提取物的挥发和稀释，能保持更高有效浓度沉降于藻体上，并作用于藻体细胞。

实施例5：海水养殖池塘施用效果

步骤1：制备复合植物提取物母液，包括百里香提取物15％，紫苏提取物5％，薄荷提取物3％，桉树叶提取物3％，丁香提取物1％，助溶剂无水乙醇的体积百分比10％，增溶剂泊洛沙姆的质量百分比为3％，其余为蒸馏水。

步骤2：制备颗粒。分别称取生物质炭30份，沸石粉30份，膨润土25份，复合植物提取物溶液12份，淀粉3份，将上述原料混合并搅拌均匀。

步骤3：将步骤2中所述混合物放入颗粒机中压制成颗粒，颗粒粒径为8mm，经过60min晾干定型后，密封包装保存。

步骤4：待生长有刚毛藻的池塘平均水温上升至25℃以上后，选择连续晴天的中午13：00，人工将步骤3中所获得的颗粒泼洒于池塘中，使用量为3kg/亩，在刚毛藻生长较多的区域适当增加泼洒量。颗粒泼洒后，池塘15天未进排水。

步骤5：复合植物提取物施用后，每天观察池塘内刚毛藻的生长状况；施用前及施用后15天，采集池塘水样，检测浮游植物数量、氨氮以及亚硝酸盐；采集沉积物样品，检测硫化物含量。

施用效果：使用至7天时，悬浮于水体中的刚毛藻植株褪色发白并逐渐分解，至10天时，底层刚毛藻植株漂浮于池塘表面。采用人工方式，及时打捞出池塘表面悬浮藻体及碎片。处理后，池底着生的刚毛藻清除率达到90％以上；养殖环境得到有效改善(表1)，浮游植物数量逐渐恢复，池底沉积物中硫化物含量下降；池塘内养殖毛蚶及对虾未见影响。

表1复合植物提取物施用前后养殖环境的变化