蟾酥甾二烯衍生物及其制备方法和应用、药物组合物

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及蟾酥甾二烯衍生物及其制备方法和应用、药物组合物。

背景技术

肿瘤是全球发病率和死亡率的主要原因，各国已经投入大量的人力、物力和财力来开发抗肿瘤药物。而蟾酥是我国一味名贵传统中药，其中，蟾酥甾二烯是其主要的活性成分，研究表明，蟾酥甾二烯具有显著地抗肿瘤活性，故其具有用于制备抗肿瘤药物的潜能，然而该类化合物靶向性差，毒性强，故安全性是这一类化合物所存在的最主要的问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种蟾酥甾二烯衍生物及其制备方法和应用、药物组合物。该类蟾酥甾二烯衍生物对FAP-α高表达的肿瘤细胞株具有抑制活性，而对正常细胞杀伤性弱，可用作靶向治疗恶性肿瘤的药物。

本发明提供了一种蟾酥甾二烯衍生物，具有式(I)所示结构：

其中，n为0-10的整数；

R

R

R

在其中一实施例中，n为1、2、3、4或5；和/或

R

R

在其中一实施例中，R

在其中一实施例中，R

在其中一实施例中，R

在其中一实施例中，R

在其中一实施例中，R

在其中一实施例中，所述蟾酥甾二烯衍生物选自A1～A9任一化合物：

上述蟾酥甾二烯衍生物的制备方法，包括以下步骤：

提供式(I-1)所示结构的化合物；

使式(I-1)所示结构的化合物和4-硝基氯甲酸苯酯发生酯化反应，制得式(I-2)所示结构化合物；

使式(I-2)所示结构化合物与

使式(I-3)所示结构化合物和式(I-4)所示结构化合物反应，制得式(I)所示结构的蟾酥甾二烯衍生物；

在其中一实施例中，使式(I-2)所示结构化合物与

将式(I-2)所示结构化合物、

其中，所述碱为三乙胺、吡啶、二异丙基乙基胺和4-(N,N-二甲基)氨基吡啶中的一种或多种；

所述溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃和乙腈中的一种或多种。

在其中一实施例中，使式(I-2)所示结构化合物与

在其中一实施例中，使式(I-3)所示结构化合物和式(I-4)所示结构化合物反应的步骤包括以下步骤：

将式(I-3)所示结构化合物和式(I-4)所示结构化合物、碱和溶剂混合，在温度为15℃-45℃的条件下进行反应；

其中，所述碱为三乙胺、吡啶、二异丙基乙基胺和4-(N,N-二甲基)氨基吡啶中的一种或多种；

所述溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃和乙腈中的一种或多种。

在其中一实施例中，使式(I-3)所示结构化合物和式(I-4)所示结构化合物反应的步骤中，碱为三乙胺，溶剂为二氯甲烷。

在其中一实施例中，使式(I-1)所示结构的化合物和4-硝基氯甲酸苯酯发生酯化反应的步骤包括以下步骤：

使式(I-1)所示结构的化合物、4-硝基氯甲酸苯酯、碱和溶剂混合，在温度为5℃-45℃的条件下进行反应；

其中，所述碱为三乙胺、吡啶、二异丙基乙基胺和4-(N,N-二甲基)氨基吡啶中的一种或多种；

所述溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃和乙腈中的一种或多种。

在其中一实施例中，式(I-1)所示结构的化合物和4-硝基氯甲酸苯酯发生酯化反应的步骤中，碱为吡啶，溶剂为二氯甲烷。

在其中一实施例中，式(I-1)所示结构的化合物和4-硝基氯甲酸苯酯发生酯化反应的步骤中，后处理的方法为：反应结束后，采用饱和碳酸钠或饱和碳酸钾溶液反复洗涤，然后再用饱和食盐水洗涤，干燥。

本发明还提供了上述蟾酥甾二烯衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

在其中一实施例中，所述抗肿瘤药物为治疗FAP-α高表达的恶性肿瘤的药物。

在其中一实施例中，所述恶性肿瘤为胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、直肠癌或血癌。

本发明还提供了一种药物组合物，包括上述蟾酥甾二烯衍生物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受载体、赋形剂、佐剂、辅料和/或稀释剂。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，包括施加治疗有效量的上述蟾酥甾二烯衍生物或其药学上可接受的盐，或上述药物组合物。

上述蟾酥甾二烯衍生物创新性地利用蟾酥甾二烯的抗肿瘤活性和FAP-α蛋白酶激活前药相结合策略，提高化合物对肿瘤的靶向性，经FAP-α蛋白酶的剪切，释放出抗肿瘤活性分子，降低药物对正常组织的毒性。由此一来，就可以解决蟾酥甾二烯衍生物由于毒性问题，而带来的药物开发的瓶颈，尤其是对一些FAP-α蛋白酶高表达的肿瘤，如胰腺癌、肺癌、肠癌、乳腺癌的原发和转移瘤等，具有良好的应用前景。具体地：

技术人员在研究过程中发现，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associatedfibroblasts,CAFs)是一类含量丰富的肿瘤间质细胞，在肿瘤微环境中，CAFs能够激活并获得一种活化表型，从而失去原有形态，表达大量α-平滑肌肌动蛋白，获得I型胶原蛋白、弹力蛋白C和基质金属蛋白酶等更强的细胞外基质沉积能力。其中，成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast activation proteinα,FAP-α)是肿瘤相关成纤维细胞表面的重要的分子标志物。FAP-α在肿瘤间质的形成、再塑和维持上起重要作用，通过降解基质来促进肿瘤细胞的侵袭和转移。FAP-α能够选择性的高表达于多种上皮组织来源恶性肿瘤间质中，却几乎不表达于正常组织及良性上皮肿瘤间质中静息成纤维细胞，且罕见于肿瘤细胞中，因此，FAP-α能够作为抗肿瘤药物开发的重要靶标蛋白，而对正常细胞的影响较小。故可以采用FAP-α酶激活式前体药物，即通过将细胞毒性药物与特殊肽链形成暂时失活的前体药物，当该药物被输送至肿瘤组织时，FAP-α的肽链内切酶活性可使细胞毒性药物释放并杀伤靶细胞。这种基于肿瘤微环境的FAP-α蛋白酶的前药策略，可以降低细胞毒药物对正常组织的毒性，提高对肿瘤组织的选择性。由于抑制FAP-α酶活性及信号转导通路的双重功能的技术难度比较大。因此，相较于同时抑制FAP-α酶活性和信号转导功能，利用FAP-α特异性前体药物与FAP-α接触释放细胞毒性药物，从而杀伤瘤细胞更具有可行性和肿瘤治疗价值。

附图说明

图1为A2分别在10,20,30mg/kg/day的剂量下对人源PANC-1肿瘤的体内活性评价图；

图2为A2分别在10,20,30mg/kg/day的剂量下体重改变情况图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语定义

除非特别注明，本发明中所用的术语具有如下定义：

本发明中所述C

“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃基取代基。3-8元环烷基是指包括3至8个碳原子。在一实施例中，3-8元单环环烷基为环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等。

利用本发明所得的蟾酥甾二烯衍生物可给药于人，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(粉剂、软膏剂或滴剂)。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，上述组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于此。

下述制备例中，

制备实施例

实施例1：化合物A1的合成

在50mL圆底烧瓶中，将氯甲酸对硝基苯酯(1.206g，6mmol)溶于20mL无水二氯甲烷中，加入干燥吡啶(0.67mL)，搅拌下加入蟾毒灵(2mmol)，室温下搅拌6小时，反应结束后用饱和碳酸钠洗5-8次，再用饱和食盐水洗2两次，用硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁后，再加入10mL无水二氯甲烷和三乙胺(0.5mL)，再加入乙二胺(4mmol)室温搅拌1h。反应结束后用饱和碳酸钠洗5-8次，再用饱和食盐水洗2两次，用硫酸镁干燥。过滤后，加入三乙胺(0.5mL)，二肽活性酯(式(I-4)所示结构化合物，5mmol)，室温搅拌3h。反应结束后，反应液先用水洗2次，再用饱和食盐水洗2次，并用硫酸镁干燥。过滤除去硫酸镁后减压浓缩后，经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A1，产率46％。

实施例2：化合物A2的合成

应操作如A1的制备，原料用丙二胺代替乙二胺；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A2，产率50％。

实施例3：化合物A3的合成

应操作如A1的制备，原料用丁二胺代替乙二胺；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A3，产率44％。

实施例4：化合物A4的合成

应操作如A1的制备，原料用酯蟾毒配基代替蟾毒灵；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A4，产率54％。

实施例5：化合物A5的合成

应操作如A1的制备，原料用酯蟾毒配基代替蟾毒灵，用丙二胺代替乙二胺；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A5，产率55％。

实施例6：化合物A6的合成

应操作如A1的制备，原料用酯蟾毒配基代替蟾毒灵，用丁二胺代替乙二胺；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A6，产率50％。

实施例7：化合物A7的合成

应操作如A1的制备，原料用华蟾毒精代替蟾毒灵；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A7，产率48％。

实施例8：化合物A8的合成

应操作如A1的制备，原料用华蟾毒精代替蟾毒灵，用丙二胺代替乙二胺；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A8，产率50％。

实施例9：化合物A9的合成

应操作如A1的制备，原料用华蟾毒精代替蟾毒灵，用丁二胺代替乙二胺；经柱层析(80:1～20:1,二氯甲烷/甲醇)梯度洗脱，得到目标化合物A9，产率44％。

试验实施例1：体外抗肿瘤活性实验

(1)试验材料

PANC-1人胰腺癌细胞株；SW1990人胰腺癌细胞株；MDA-MB-231人乳腺癌细胞株。其中PANC-1和SW1990为FAP-α高表达的肿瘤细胞株，而MDA-MB-231为FAP-α低表达的肿瘤细胞株。

阳性对照为蟾毒灵(Bufalin,BF)(按常规方法配制)；纯度由HPLC-UV检测98％以上，结构由NMR确证。待测化合物和阳性对照物以生理盐水稀释，浓度梯度为300nM、100nM、30nM、10nM、3.0nM、1.0nM、0.3nM、0.1nM。

(2)试验方法

SRB还原法：

根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以100μL/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24h再加待测化合物或阳性对照物10μL/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO

抑制率％＝[(阴性对照吸光值–空白吸光值)–(样品吸光值–空白吸光值)]/(阴性对照吸光值–空白吸光值)×100％

药物作用浓度：300nM、100nM、30nM、10nM、3.0nM、1.0nM、0.3nM、0.1nM。用GraphPadPrism 4拟合出IC

表1、蟾酥甾二烯衍生物对几种人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性

通过对蟾酥甾二烯衍生物对三种人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性研究发现，经过修饰的蟾酥甾二烯衍生物对FAP-α高表达的肿瘤细胞株(PANC-1和SW1990)表现出了较强的抑制活性，而对FAP-α低表达的肿瘤细胞株(MDA-MB-231)则表现出了较弱的抑制活性。这个结果一方面表明我们设计的前药化合物能被FAP-α顺利剪切，释放出活性分子，另一方面表明我们的前药分子对肿瘤株具有良好的选择性。在体外测试中，发现化合物A2对PANC-1具有极其的抑制活性，因此，我们选择了A2对PANC-1进行了动物体内的活性评价。

试验实施例1：对人胰腺癌PANC-1细胞裸鼠移植瘤的疗效评价

(1)实验目的

评估化合物A2对移植于裸鼠的人胰腺癌PANC-1肿瘤生长的体内药效。

(2)材料方法

溶剂对照：4％DMSO&2％Tween-80&5％PEG-400生理盐水溶液

1)DMSO：SIGMA-ALDRICH CHEMIE GMBH公司。2)Tween-80:SIGMA-ALDRICH CHEMIEGMBH公司。3)PEG-400：南京威尔化工有限公司。4)生理盐水：上海长征富民药业华中有限公司。

受试化合物：A2。

阳性对照：Gemcitabine

配制方法：化合物用DMSO溶解后配制成储存原液，DMSO终浓度为4％，配制成注射液。

配制方法：DMSO终浓度为5％，配制成注射液。

(3)实验方法与结果

肿瘤生长至大约160mm

如图1所示，对照样品gemcitabine(75mg/kg i.p.BIW)组的瘤重与溶剂对照组比较，存在极显著差异(P<0.01)，其瘤重抑瘤率为63.08％；受试样品A2(30mg/kg,i.p.,QD)组的瘤重与溶剂对照组比较，也存在极显著差异(P<0.01)，其瘤重抑瘤率为68.86％。实验结果表明，A2在30mg/kg/day剂量下有明显抑制人胰腺癌PANC-1的生长。

图2所示，试验结束时，溶剂对照组、对照样品gemcitabine(75mg/kg i.p.BIW)组、受试样品A2(10,20,30mg/kg,i.p.,QD)组动物的平均体重分别降低8.72％，1.70％，7.32％和7.00％。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。