一种生物标志物在制备帕金森病早期诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种生物标志物在制备帕金森病早期诊断试剂盒中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年神经系统变性疾病中第二大类常见的疾病，在我国65周岁及以上的人群中患病率高达1.7％，基本与发达国家持平，新增病例数约为每年10万人次，其危害性仅次于心脑血管疾病及肿瘤，严重危害老年人的健康生活。PD在临床上表现为运动性症状如静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍及非运动性症状如便秘、睡眠障碍、精神行为异常等，患上PD不仅降低了病人的生活质量，还给家庭带来了沉重的经济负担。目前PD的发病机制还不清楚，许多研究提示PD患者黑质DA能神经元变性可能与遗传因素、氧化应激、线粒体功能缺陷、细胞凋亡、免疫异常、环境因素等有关。在PD中，约10％的患者为家族型PD患者，具有明显的遗传特性，剩下的90％为散发性PD患者。现在许多研究认为，PD是在年龄老化的背景上，遗传因素和环境因素共同作用的结果，而对PD致病基因的研究是目前对PD发病机制研究的一大热点。

目前尚无有效的预防措施阻止PD的发生和进展，当患者出现临床症状时黑质多巴胺能神经元死亡至少在50％以上，纹状体DA含量减少在80％以上。研究发现，疾病发生的早期阶段即机体细胞甚至分子水平的改变往往远远早于临床症状的出现，临床病理分析结果也提示早在帕金森病临床症状出现20年前，患者脑部就开始出现小胶质细胞激活和多巴胺能神经元丢失。怎样才能实现在帕金森发生初期细胞甚至分子水平超早期诊断是我们亟待解决的关键问题，因此，如果能有一种或几种用于PD早期诊断的生物标志物，并采取有效的预防措施阻止多巴胺能神经元的变性死亡，无疑会给PD的诊断及治疗带来极大便利。如何发现PD早期诊断的生物标志物已成为PD研究领域的热点之一。迄今为止，己经发现与PD相关的致病基因有PINK-1，Parkin，DJ-I，LRRK2，SNCA等，但是这些致病基因都还需进一步研究。对于PD患者，提前制定最适合患者的有针对性的个性化治疗方案，从而最大限度提高患者的生存质量和改善左旋多巴类药物的治疗状况，因而从分子水平研究PD的发生发展从而发现更多的分子标志物，对于它的预防、控制和治疗具有重要意义。

帕金森病的诊断主要依靠病史、临床症状及体征。但是PD患者认知功能下降起病隐匿，病情呈进行性进展过程，大多数患者往往在发病的中后期才被确认患帕金森病，此时的治疗方法只能是进行药物干预，且药物干预只是以减轻PD的症状为主，不能抑制PD的发展。因此，传统的诊断方法，错过了疾病的最佳干预时期。目前，用于帕金森病早期诊断的有效标志物是影像学标志物，以18F-多巴作为示踪剂行多巴摄取功能PET显像可显示多巴胺递质合成减少。以125I-β-CIT、99mTc-TRODAT-1作为示踪剂行多巴胺转运体(DAT)功能显像可显示DAT数量减少，在疾病早期甚至亚临床期即可显示降低，可支持诊断。但此项检查费用较贵，尚未常规开展，且存在较大剂量的X线辐射。还有采用嗅觉试纸检测嗅觉减退情况，对帕金森病高危人群进行筛查，但仅仅是辅助诊断帕金森病，该方法特异性差。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物标志物在制备帕金森病早期诊断试剂盒中的应用，通过检测受试者血液中Nur77的表达，可以判断受试者是否患有帕金森病、或判断受试者是否存在患有帕金森病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明提供了一种生物标志物在制备帕金森病早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物是Nur77基因或其表达产物，所述Nur77基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。

进一步地，所述的试剂盒中包括检测Nur77基因mRNA表达的试剂，或检测Nur77蛋白水平的试剂。

进一步地，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测Nur77基因mRNA表达的水平的产品。

进一步地，所述RT-PCR检测Nur77基因mRNA表达的水平的产品：至少包括一对特异扩增Nur77基因的引物；

所述原位杂交检测Nur77基因mRNA表达的水平的产品：包括与Nur77基因核酸序列杂交的探针；

所述芯片检测Nur77基因mRNA表达的水平的产品是基因芯片，基因芯片包括与Nur77基因核酸序列杂交的探针。

进一步地，所述特异扩增Nur77基因的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述检测Nur77蛋白水平的试剂包括针对Nur77蛋白的抗体。

本发明还提供了调控上述述的生物标志物表达的试剂在制备治疗帕金森病药物中的应用。

进一步地，所述药物包括但不仅限于Nur77诱导剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明发现了Nur77基因在帕金森病患者血液中表达下调，通过检测受试者血液中Nur77的表达，可以判断受试者是否患有帕金森病、或判断受试者是否存在患有帕金森病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

2、本发明可在帕金森早期即可作出诊断，并根据上调Nur77基因表达的试剂，开发出用于治疗帕金森病的药物，在临床上具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中血清中Nur77表达水平的统计图；

图2为本发明实施例2中QPCR检测外周血中Nur77 mRNA表达水平的统计图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、Elisa法检测血清中Nur77的水平

l、样品收集

收集原发性PD患者13例，男6例，女7例，年龄50-85岁，病程6个月-20年。

正常组：选取年龄50-85岁的健康志愿者11例，男6例，女5例。

收集上述研究对象的血液样本，3000转/min离心10min，吸取血清，放-80℃备用。上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

帕金森病组排除标准：(1)继发性帕金森综合征、脑炎、脑血管疾病、颅脑外伤或手术者；(2)存在内分泌代谢性疾病、重度抑郁、药物中毒等其它原因导致认知功能障碍或痴呆者；(3)恶性肿瘤及其他严重疾病者；(4)文盲、色盲、语言障碍或其它原因无法沟通者；。

正常组排除标准：(1)帕金森病家族史；(2)脑血管疾病、癫痫、阿尔茨海默病等其他神经系统疾病史；(3)有既往精神病史，如重度抑郁者、精神发育迟滞、精神分裂症及躯体疾病所致精神障碍者；(4)文盲、色盲、语言障碍或其它原因无法沟通者。

2、试验步骤

试验前从冰箱中取出试剂盒(人孤儿核受体Nur77 ELISA试剂盒，Abebio，AE30393HU)和样品，平衡至室温，然后按下述步骤进行：

1)按照说明书的要求，准备所有试剂、标准品和样品，并设置对照孔，标准品孔和样本孔，每孔设置3个复空；

2)在酶标板上每孔加入100μl标准品和样品，用试剂盒自带的封板膜覆盖，37℃孵育2小时。注意要将样品加于孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

3)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，拍干，重复此过程3次。注意每次彻底去除液体对结果的重复性是必要的，且最后一次清洗后，要彻底去除孔内剩余的洗涤缓冲液，可把酶标板倒过来，用纸巾吸干。

4)加生物素化的一抗：每孔加入1×生物素化的抗Nur77的抗体100μl，用封板膜覆盖，37℃孵育1小时。注意1×生物素结合物可能出现浑浊，室温下轻轻晃动直至溶液均匀；

5)洗涤：重复步骤3；

6)加1×辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：每孔加入1×辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100μl，用粘合膜覆盖，37℃孵育1小时；

7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，拍干，重复此过程5次。注意每次彻底去除液体对结果的重复性是必要的，且最后一次清洗后，要彻底去除孔内剩余的洗涤缓冲液，可以把酶标板倒过来，用纸巾吸干；

8)显色：每孔加入底物100μl，轻轻震荡混匀，用粘合膜覆盖，37℃避光孵育20分钟；

9)终止：每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转为黄色；

9)测定：以空白孔调零，测定450nm和540nm(校正波长)处的吸光度(OD值)，450nm的吸光度减去540nm处的吸光度即为实际吸光度，注意测定应在加终止液后5分钟以内进行；

10)结果：将样品的OD值代入标准曲线(通过标准品测定吸光度后算出)，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度；

11)根据样品的实际浓度和临界值进行比较，辅助诊断PD。

3、统计学方法

结果数据以平均值±标准差表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

如图1所示，PD组Nur77表达水平(441.76pg/ml)显著低于正常对照组(777.54pg/ml，P<0.001)。

实施例2

一、QPCR验证Nur77基因的差异表达

l、研究对象：

收集原发性PD患者50例，男27例，女23例，年龄50-85岁，病程6个月-20年。

正常组：选取60例年龄在50-85岁的健康志愿者，男女各30例。

PD组排除标准和正常组排除标准与实施例1相同。

二、操作步骤

1、RNA样品的制备

使用北京全式金生物技术有限公司的全血总RNA提取试剂盒提取RNA，试剂盒货号ER401-01，具体步骤如下：

(1)向新鲜抗凝血液加入2.5倍体积的红细胞裂解缓冲液RCL2，颠倒混匀后，冰上孵育10分钟，期间颠倒混匀数次溶液呈半透明。

(2)4℃，400×g离心10分钟，弃上清。注意如果所得细胞沉淀有明显红色，再加入500μl RCL2重悬细胞；4℃，400×g离心10分钟，弃上清。

(3)根据所提取的血液量加入600μl结合缓冲液BB7，涡旋，使细胞沉淀彻底分散。

(4)向裂解液中加入1/2BB7体积的无水乙醇，此时可能出现絮状沉淀，充分混匀后，将溶液和沉淀全部加入离心柱中；12,000×g室温离心1分钟，弃流出液。

(5)加入500μl清除缓冲液CB7，12,000×g室温离心30秒，弃流出液。

(6)去除基因组DNA，向离心柱中央加入80μl的DNaseI工作液，室温放置15分钟，重复步骤5一次。(DNaseI工作液配制：取70μl Reaction Buffer放入RNase-free的管中，再加入30U的DNase I混匀)

(7)加入500μl洗涤缓冲液WB7(使用前加入无水乙醇)，12,000×g室温离心30秒，弃流出液。

(8)重复步骤6一次。

(9)12,000×g室温离心2分钟，彻底去除残留的乙醇。

(10)加100μl RNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1分钟。

(11)室温12,000×g离心2分钟，洗脱RNA。

(12)NanoDrop2000分光光度计检测RNA样品浓度，并分析OD260/OD280值是否符合QPCR的样品要求。

(13)盖好盛有RNA的离心管，置于-80℃保存。

2、逆转录：使用康为世纪公司的反转录试剂盒进行操作，试剂盒货号CW0741M。具体步骤如下：

(1)将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、SuperRT Buffer、SuperRT和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。

(2)根据以下表1的反应体系进行转录，总体积为20μl。

(3)涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

(4)42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

(5)逆转录产物可直接用于荧光定量PCR反应或于-20℃长期保存。

3、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中Nur77基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程有限公司合成。具体引物序列如下：

Nur77基因：

正向引物为SEQ ID N0.2：5’-TCATGGACGGCTACACAGGAGAG-3’；

反向引物为SEQ ID NO.3：5’-CTGAGGACGAGGATGTGGAGGAG-3’。

GAPDH基因：

正向引物为SEQ ID N0.4：5’-CTCCGGGTGATGCTTTTCCTA-3’；

反向引物为SEQ ID NO.5：5’-AGTTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。

(2)按下表配制PCR反应体系：

其中，UltraSYBR Mixture购自康为世纪公司，货号CW0957M。

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃l5s，60℃1min)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过分析扩增曲线和融解曲线以△△Ct法进行相对定量。

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据以平均值±标准差表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

如图2所示，与正常人血液相比，Nur77基因在帕金森患者血液中的表达下调，差异具有统计学意义(P<0.001)。

需要说明的是Nur77编码区核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南科技大学第一附属医院

<>

<120> 一种生物标志物在制备帕金森病早期诊断试剂盒中的应用

<>

<160> 5

<>

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<>

<210> 1

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工合成

<>

<400> 1

atgacaagtg cacagtataa aatcaagatt ctaattgaag gcctccacca tggacagagg 60<>

ccaggccctg cccctcccag gcagcctggc tccttctgct gggccctgaa ggcagacggg 120<>

ataatgtggt tggccaaggc ctgttggtcc atccagagtg agatgccctg tatccaagcc 180<>

caatatggga caccagcacc gagtccggga ccccgtgacc acctggcaag cgaccccctg 240<>

acccctgagt tcatcaagcc caccatggac ctggccagcc ccgaggcagc ccccgctgcc 300<>

cccactgccc tgcccagctt cagcaccttc atggacggct acacaggaga gtttgacacc 360<>

ttcctctacc agctgccagg aacagtccag ccatgctcct cagcctcctc ctcggcctcc 420<>

tccacatcct cgtcctcagc cacctcccct gcctctgcct ccttcaagtt cgaggacttc 480<>

caggtgtacg gctgctaccc cggccccctg agcggcccag tggatgaggc cctgtcctcc 540<>

agtggctctg actactatgg cagcccctgc tcggccccgt cgccctccac gcccagcttc 600<>

cagccgcccc agctctctcc ctgggatggc tccttcggcc acttctcgcc cagccagact 660<>

tacgaaggcc tgcgggcatg gacagagcag ctgcccaaag cctctgggcc cccacagcct 720<>

ccagccttct tttccttcag tcctcccacc ggccccagcc ccagcctggc ccagagcccc 780<>

ctgaagttgt tcccctcaca ggccacccac cagctggggg agggagagag ctattccatg 840<>

cctacggcct tcccaggttt ggcacccact tctccacacc ttgagggctc ggggatactg 900<>

gatacacccg tgacctcaac caaggcccgg agcggggccc caggtggaag tgaaggccgc 960<>

tgtgctgtgt gtggggacaa cgcttcatgc cagcattatg gtgtccgcac atgtgagggc 1020<>

tgcaagggct tcttcaagcg cacagtgcag aaaaacgcca agtacatctg cctggctaac 1080<>

aaggactgcc ctgtggacaa gaggcggcga aaccgctgcc agttctgccg cttccagaag 1140<>

tgcctggcgg tgggcatggt gaaggaagtt gtccgaacag acagcctgaa ggggcggcgg 1200<>

ggccggctac cttcaaaacc caagcagccc ccagatgcct cccctgccaa tctcctcact 1260<>

tccctggtcc gtgcacacct ggactcaggg cccagcactg ccaaactgga ctactccaag 1320<>

ttccaggagc tggtgctgcc ccactttggg aaggaagatg ctggggatgt acagcagttc 1380<>

tacgacctgc tctccggttc tctggaggtc atccgcaagt gggcggagaa gatccctggc 1440<>

tttgctgagc tgtcaccggc tgaccaggac ctgttgctgg agtcggcctt cctggagctc 1500<>

ttcatcctcc gcctggcgta caggtctaag ccaggcgagg gcaagctcat cttctgctca 1560<>

ggcctggtgc tacaccggct gcagtgtgcc cgtggcttcg gggactggat tgacagtatc 1620<>

ctggccttct caaggtccct gcacagcttg cttgtcgatg tccctgcctt cgcctgcctc 1680<>

tctgcccttg tcctcatcac cgaccggcat gggctgcagg agccgcggcg ggtggaggag 1740<>

ctgcagaacc gcatcgccag ctgcctgaag gagcacgtgg cagctgtggc gggcgagccc 1800<>

cagccagcca gctgcctgtc acgtctgttg ggcaaactgc ccgagctgcg gaccctgtgc 1860<>

acccagggcc tgcagcgcat cttctacctc aagctggagg acttggtgcc ccctccaccc 1920<>

atcattgaca agatcttcat ggacacgctg cccttctga 1959<>

<>

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<>

<400> 2

tcatggacgg ctacacagga gag 23<>

<>

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<>

<400> 3

ctgaggacga ggatgtggag gag 23<>

<>

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<>

<400> 4

ctccgggtga tgcttttcct a 21<>

<>

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<>

<400> 5

agttgaggtc aatgaagggg tc 22<>

<>

<>

<>