导航：首页> 计算；推算；计数>一种DNA端粒长度和基因甲基化程度相关性的检测方法

一种DNA端粒长度和基因甲基化程度相关性的检测方法

文献发布时间：2023-06-19 11:22:42

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种DNA端粒长度和基因甲基化程度相关性的检测方法。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和（或）肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上发病率已高达9%～10%。慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。

我国的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》将COPD的肺功能诊断标准定义为:“吸入支气管舒张剂后第1秒钟用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)＜0.70”。值得注意的是该诊断标准中的“0.70”是无需区分性别、年龄、身高、体重、种族等变数的固定数值，然而肺功能的测量值恰恰与受试者的上述因素相关。越来越多的证据发现，以FEV1/FVC＜0.70作为COPD的诊断标准可能导致大量临床误诊。

发明内容

本发明首次发现，在慢性阻塞性肺疾病的患者中，DNA的端粒长度与APC基因的甲基化之间的相关关系，在排除年龄、性别、吸烟等之后，有明显相关关系。因此，可以通过检测DNA端粒长度和APC基因甲基化程度之间的相关性来辅助诊断慢性阻塞性肺疾病。

但现有的检测方法只针对单一的DNA端粒长度检测或APC基因甲基化程度检测，一份样品只能进行一次检测，检测需要的时间较长，无法同时对一份样品即进行DNA端粒长度检测也进行APC基因甲基化程度检测。

针对上述技术问题，发明提供了一种DNA端粒长度和APC基于甲基化程度相关性的检测方法。

本发明的技术方案为：

一种DNA端粒长度和APC基因甲基化程度相关性的检测方法，包括以下步骤：

白细胞DNA提取：

步骤1-1：使用200 μl新鲜、冷冻或加入抗凝剂的血液，加入20 μl Proteinase K溶液，混匀；

步骤1-2：加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

步骤1-3：加入200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

步骤1-4：将步骤1-3中所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

步骤1-5：向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD12,000rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

步骤1-6：向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW，12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作两遍；

步骤1-7：将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2 min，倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

步骤1-8：将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min， 12,000 rpm离心 2 min，将溶液收集到离心管中，得样本DNA；

端粒长度测量：

步骤2-1：选定36B4作为单克隆基因，合成端粒与36B4基因得引物。如下:

Telo u, 5’-GGTTTTT- GAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’;

Telo d, 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’;

36B4u, 5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’;

36B4d, 5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’；

步骤2-2：调配预混体系：其中包含5 ml SYBR Green PCR Master Mix、0.4 μl引物混合物、0.2μl 染料和3.4μl水；其中引物分TELO和36B4并将两种预混试剂分别加入两个96孔板中；

步骤2-3：标准曲线得制备：标准曲线DNA选用海拉DNA进行系列稀释产生五种浓度0.25ng / μl、0.74ng / μl、2.22ng / μl、6.67ng / μl和20 ng / μl后，将每种浓度3个孔加入96孔板中；

步骤2-4：将步骤1-8中的样本DNA个孔加入96孔板；

步骤2-5：用绝对定量PCR的方式，在荧光定量PCR仪上运行；

步骤2-6：将最终的TELO拷贝数除以36B4的拷贝数得到相应样本的相对端粒长度，再使用矫正样本矫正后得到最终相对端粒长度；

APC基因甲基化测量：

步骤3-1：合成DNA甲基化的引物其中分为甲基化（M）和非甲基化（U）如下：

RUNX3-F(M) ： CGAGGTTTCGTTGGTTCGA

RUNX3-R(M) ：GCCGCGACCCAAACAA

RUNX3-F(U) ：TGAGGTTTCGTTGGTTTGA

RUNX3-R(U) ：GCCACAACCCAAACAA

APC-F(M) ：GAACCAAAACGCTCCCCAT

APC-R(M) ：TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT

APC-F(U) ：GAACCAAAACACTCCCCAT

APC-R(U) ：TTATATGTTGGTTATGTGTGTTTATAT

PCDH20-F(M) ：GAAGAGTTAGTGATTATTGGTTGAAG

PCDH20-R(M) ：CAAATTCCTATAACTAATACTACTCCT

PCDH20-F(U) ：TTAGCAATTTGTATGAATCAAGA

PCDH20-R(U) ：TGTGAATATAAATTGTTGAATATT；

步骤:3-2：使用感受态细胞制取相应基因的全基因序列质粒；

步骤3-3：将质粒10倍稀释为5个梯度；

步骤3-4：配置预混体系：其中包含10 ml SYBR Green PCR Master Mix、4 μl引物混合物、和4μl水；

步骤3-5：将2μl样本DNA和18μl体系分别加入96孔板中并混匀。每个样本DNA和质粒DNA占据2-3个重复孔；

步骤3-6：根据质粒的浓度梯度得到相应基因的拷贝数，再使用甲基化（M）除以甲基化（M）和非甲基化（U）之和得到DNA的甲基化程度；

DNA端粒长度和APC基因甲基化相关性分析：

步骤4-1：对DNA端粒长度和APC基因甲基化程度进行相关性分析。

本发明的检测方法可以快速高效的检测样品中DNA端粒长度和APC基因甲基化程度之间的相关性，一份样品即可进行分析，无需多次取样，可以高效快速的进行检测。可有效提高检测效率和检测准确度，可以促进慢性阻塞性肺疾病的相关研究。

附图说明

图1为本发明DNA端粒长度和APC基因甲基化程度相关性分析结构表；

图2为本发明DNA端粒长度和APC基因甲基化程度相关性分析散点图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册或按照制造厂商所建议的条件。

实施例：验证DNA端粒长度和APC基因甲基化程度相关性在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中的差异。

临床研究对象：

1、临床研究对象：

选取研究样本，样本来源为昆明理工大学第一附属医院。样本整体信息如下：

所有研究对象均签署了知情同意书。

白细胞DNA提取方法：

1、使用200 μl新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。

2、加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

3、加入200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

5、向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD12,000rpm (~13,400×g)离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6、向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作两遍。

7、将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

8、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min， 12,000 rpm (~13,400×g)离心 2 min，将溶液收集到离心管中。

端粒长度测量方法：

1、选定36B4作为单克隆基因。

2、合成端粒与36B4基因得引物。如下:

Telo u, 5’-GGTTTTT- GAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’;

Telo d, 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’;

36B4u, 5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’;

36B4d, 5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。

3、调配预混体系：其中包含5 ml SYBR Green PCR Master Mix（通用型SYBR快速定量；KaPa，东京，日本）、0.4 μl引物混合物、0.2μl 染料（通用型SYBR快速定量；KaPa，东京，日本）和3.4μl水。其中引物分TELO和36B4并将两种预混试剂分别加入两个96孔板中。

4、标准曲线得制备：标准曲线DNA选用海拉DNA进行系列稀释产生五种浓度（0.25、0.74、2.22、6.67和20 ng / μl）后，将每种浓度3个孔加入96孔板中。

5、每个样本三个孔加入96孔板。

6、用绝对定量PCR的方式，在Applied Biosystem 7500（赛默飞世尔科技，上海，中国）上运行。

7、将最终的TELO拷贝数除以36B4的拷贝数得到相应样本的相对端粒长度，再使用矫正样本矫正后得到最终相对端粒长度。

甲基化程度测量方法：

1、合成DNA甲基化的引物其中分为甲基化（M）和非甲基化（U）如下：

RUNX3-F(M) ： CGAGGTTTCGTTGGTTCGA

RUNX3-R(M) ：GCCGCGACCCAAACAA

RUNX3-F(U) ：TGAGGTTTCGTTGGTTTGA

RUNX3-R(U) ：GCCACAACCCAAACAA

APC-F(M) ：GAACCAAAACGCTCCCCAT

APC-R(M) ：TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT

APC-F(U) ：GAACCAAAACACTCCCCAT

APC-R(U) ：TTATATGTTGGTTATGTGTGTTTATAT

PCDH20-F(M) ：GAAGAGTTAGTGATTATTGGTTGAAG

PCDH20-R(M) ：CAAATTCCTATAACTAATACTACTCCT

PCDH20-F(U) ：TTAGCAATTTGTATGAATCAAGA

PCDH20-R(U) ：TGTGAATATAAATTGTTGAATATT

2、使用感受态细胞制取相应基因的全基因序列质粒。

3、将质粒10倍稀释为5个梯度。

4、配置预混体系：其中包含10 ml SYBR Green PCR Master Mix（通用型SYBR快速定量；KaPa，东京，日本）、4 μl引物混合物、和4μl水。

5、将2μl样本DNA和18μl体系分别加入96孔板中并混匀。每个样本DNA和质粒DNA占据2-3个重复孔。

6、根据质粒的浓度梯度得到相应基因的拷贝数，再使用甲基化（M）除以甲基化（M）和非甲基化（U）之和得到DNA的甲基化程度。