Y041-5921在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物的新制药用途。

背景技术

肿瘤，特别是恶性肿瘤严重危害人们的生命健康。人们已经开发出多种抗肿瘤药物，然而现有的经典抗肿瘤药物，特别是化疗药物，具有严重的副作用。

在众多的肿瘤中，乳腺癌是女性发病率和死亡率最高的肿瘤。女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0％～20.8％，每年全世界有大约一百万的乳腺癌新增病例，其中超过170000的患者是三阴性乳腺癌。三阴乳腺癌侵袭性强、复发早、进展快、生存时间短等临床生物学行为，对内分泌治疗及针对HER-2、ER、PR的靶向治疗药物不敏感，且预后较其他类型差，是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。TNBC的发病机制及临床治疗已经成为国际上乳腺癌研究的新热点。

目前用于乳腺癌化疗的药物主要有阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、顺铂和5-氟尿嘧啶(5-FU)等，这些药物虽已广泛应用于乳腺癌的治疗，但由于其毒副作用及患者的耐药性限制了这些药物的治疗效果。近年来，随着分子靶向治疗药物的出现及其在临床的广泛应用，靶向治疗在肿瘤的综合治疗中发挥了日渐重要的作用。由于靶向治疗特异性强，效果显著，基本不损伤正常组织，因此肿瘤分子靶向治疗是肿瘤治疗中最具前景的治疗方案之一。然而，三阴性乳腺癌由于不表达雌激素受体、孕激素受体、人类表皮生长因子受体2，所以对大多数内分泌治疗及针对HER-2、ER、PR表达阳性的乳腺癌靶向治疗药物(如他莫昔芬、赫赛汀)不敏感，而目前也没有找到其他特别有效的靶点，故预后较其他类型乳腺癌差。因此，寻找TNBC新的靶点和靶向治疗药物成为乳腺癌研究亟待解决的问题。

Y041-5921是Chemdiv商业数据库(包含约190万化合物，具有较好的骨架多样性)中的一个化合物，其化学结构式为

发明内容

本发明的目的在于提供Y041-5921及其衍生物，特别是其盐的新制药用途。

本发明所采取的技术方案是：

化合物及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述化合物的结构通式如式Ⅰ所示：

式中，X为卤素。

在一些实例中，X＝F。

在一些实例中，所述盐为酸加成酸，所述酸选自由乙酸、2,2-二氯乙酸、已二酸、藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、α-酮戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸组成的组。

在一些实例中，所述肿瘤为具有高AXL激酶活性指征的肿瘤。

在一些实例中，所述肿瘤选自乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、肾癌、骨肉瘤，特别是具有高AXL激酶活性指征的乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、肾癌、骨肉瘤。

在一些实例中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在一些实例中，所述药物还包括至少一种对肿瘤具有治疗作用的分子。

在一些实例中，所述药物为口服剂或注射剂。

在一些实例中，所述对肿瘤具有治疗作用的分子选自阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、顺铂和5-氟尿嘧啶中的至少一种。

本发明的有益效果是：

发明人研究发现，Y041-5921可以有效抑制MDA-MB-231细胞的增殖，其IC

在一些实例中，Y041-5921可显著抑制HS-578T、4T1、HCC-1806、HCC-1937、MDA-MB-468细胞的活力(IC

在一些实例中，Y041-5921对正常细胞的毒性远远小于化疗药物对正常细胞的毒性。

在一些实例中，Y041-5921可显著抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成能力，即对细胞的增殖能发挥长期的抑制效果。

在一些实例中，Y041-5921可明显抑制MDA-MB-231细胞的磷酸化AXL表达水平及其下游AKT和MAPK信号通路。

在一些实例中，Y041-5921可显著抑制胶质瘤细胞U251、结肠癌细胞COLO、肺癌细胞PC-9、肾癌细胞CAKI-1、骨肉瘤细胞MG63的细胞活力(IC

初步的机理研究表明，Y041-5921可以与AXL激酶结合，模式研究表明Y041-5921竞争性的占据了AXL激酶的ATP结合位点。对Y041-5921和AXL结合其关键作用的残基有LEU542、GLY543、GLU544、GLY545、GLU546、PHE547、GLY548、VAL550、ALA565、MET598、LEU620、PRO621、PHE622、MET623、GLY626、ASP627、ALA565、ARG676、ASN677、MET679、ALA689和ASP690。Y041-5921与残基ASP627有氢键作用，此外Y041-5921还与AXL的P-loop区域的残基GLU546、PHE547形成氢键作用，这些都增强了二者结合的稳定性。

附图说明

图1是Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的增殖的影响结果图；

图2是Y041-5921对其他三阴性乳腺癌细胞系增殖的影响结果；

图3是Y041-5921以及代表性临床化疗药物对正常乳腺永生化上皮细胞MCF-10A的毒性结果对比；

图4是Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的克隆形成能力的影响结果；

图5是Y041-5921对三阴性乳腺癌细胞系HS-578T和MDA-MB-231的侵袭能力的影响结果；

图6是Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的AXL磷酸化水平及其下游信号通路关键蛋白表达的影响结；

图7是Y041-5921对其他肿瘤细胞系的增殖能力的影响结果；

图8是Y041-5921和AXL的结合模式图。

具体实施方式

化合物及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述化合物的结构通式如式Ⅰ所示：

式中，X为卤素。

在一些实例中，X＝F。

在一些实例中，所述盐为酸加成酸，所述酸选自由乙酸、2,2-二氯乙酸、已二酸、藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、α-酮戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸组成的组。化合物的盐在体内易转化为相应的分子，产生与化合物相同或相近的药效。

在一些实例中，所述肿瘤为具有高AXL激酶活性指征的肿瘤。高AXL激酶活性指肿瘤组织中AXL激酶活性显著高于正常组织水平，特别是癌旁正常组织水平。激酶活性可以通过其磷酸化水平来确定。

在一些实例中，所述肿瘤选自乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、肾癌、骨肉瘤，特别是具有高AXL激酶活性指征的乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、肾癌、骨肉瘤。

在一些实例中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在一些实例中，所述药物还包括至少一种对肿瘤具有治疗作用的分子。

在一些实例中，所述对肿瘤具有治疗作用的分子选自阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、顺铂和5-氟尿嘧啶中的至少一种。

通过将化合物与至少一种对肿瘤具有治疗作用的分子联用，有望获得更佳的治疗效果。

在一些实例中，所述药物为口服剂或注射剂。

下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。

实验方法：

化合物对各种细胞系增殖的影响

采用MTS法在细胞水平上观察化合物对多个细胞系增殖的影响，具体方法为：取对数生长期的细胞(如TNBC细胞系MDA-MB-231)接种于96孔板，每孔3×10

化合物对TNBC细胞系克隆形成能力的影响

取对数生长期的各组细胞，消化，将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每孔2000个细胞的梯度密度分别接种含2.0mL 37℃预温培养液的六孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养1周左右。定期使用倒置显微镜观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去原培养基，轻轻注入PBS液，小心漂洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量吉姆萨染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置于滤纸上，数码相机拍照，计数(大于50个细胞的细胞团为一个克隆)。

化合物对TNBC细胞系侵袭的影响

按不同浓度分别处理TNBC细胞株48小时，用胰酶消化收集肿瘤细胞，调整细胞密度。在Transwell小室的底部加入400μL完全培养基作为趋化因子，在Transwell上室的膜上铺以100μL的Matrigel溶液37℃放置30分钟或过夜，后于膜上铺400μL的无血清细胞悬液(含1×l0

化合物对TNBC细胞系AXL磷酸化水平及其下游信号通路关键蛋白表达的影响

采用免疫印迹分析化合物在TNBC细胞中对AXL磷酸化水平及其下游PI3K/Akt信号通路和MAPK-ERK1/2信号通路相关蛋白的改变。具体方法为以0μM、2.5μM、5μM、10μM浓度的Y041-5921处理MDA-MB-231细胞48小时后提取细胞蛋白，定量后进行SDS-PAGE电泳、转膜、相应一抗和二抗孵育，抗体结合由化学荧光系统检测，指标为P-AXL，P-Akt，P-Erk1/2及其总蛋白，β-actin作为内参。

实验结果

化合物对肿瘤细胞的抑制作用：

通过MTS实验考察化合物对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的影响。结果显示：Y041-5921可显著抑制MDA-MB-231细胞的活力(IC

Y041-5921对其他三阴性乳腺癌细胞系增殖的影响

通过MTS实验考察Y041-5921对其他三阴性乳腺癌细胞系增殖的影响。结果显示Y041-5921可显著抑制HS-578T、4T1、HCC-1806、HCC-1937、MDA-MB-468细胞的活力(IC

Y041-5921对正常乳腺永生化上皮细胞MCF-10A的毒性的影响

通过MTS实验考察Y041-5921对正常乳腺永生化上皮细胞MCF-10A的毒性的影响。结果显示Y041-5921对MCF-10A的IC

Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的克隆形成能力的影响

过平板克隆实验考察Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的克隆形成能力的影响，也可反映化合物对细胞长期增殖能力的影响。结果显示Y041-5921可显著抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成能力，即对细胞的增殖能发挥长期的抑制效果(图4)。

Y041-5921对三阴性乳腺癌细胞系HS-578T和MDA-MB-231的侵袭能力的影响

通过Transwell小室(加基质胶)实验考察Y041-5921对三阴性乳腺癌细胞系HS-578T和MDA-MB-231的侵袭能力的影响。结果显示Y041-5921可显著抑制HS-578T和MDA-MB-231细胞的侵袭能力(图5)。

Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的AXL磷酸化水平及其下游信号通路关键蛋白表达的影响

通过免疫印迹实验(WB)考察Y041-5921对代表性三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的AXL磷酸化水平及其下游信号通路关键蛋白表达的影响。结果显示Y041-5921可明显抑制MDA-MB-231细胞的磷酸化AXL表达水平及其下游AKT和MAPK信号通路，即Y041-5921抑制了AXL的激酶活性(图6)。

Y041-5921对其他肿瘤细胞系增殖的影响

通过MTS实验考察Y041-5921对其他肿瘤细胞系增殖的影响。结果显示Y041-5921可显著抑制胶质瘤细胞U251、结肠癌细胞COLO、肺癌细胞PC-9、肾癌细胞CAKI-1、骨肉瘤细胞MG63的细胞活力(IC

初步的作用机制研究：

发明人通过自有计算机筛选算法对Y041-5921可能的抗肿瘤机制进行了相应的研究。计算结果表明，Y041-5921可以高效结合并抑制AXL激酶活性。

Y041-5921和AXL的结合模式分析

如图8所示，从Y041-5921和AXL模式来看，Y041-5921竞争性的占据了ATP结合位点。对Y041-5921和AXL结合其关键作用的残基有LEU542、GLY543、GLU544、ALA565、MET598、LEU620、PRO621、PHE622、MET623、LYS624、GLY626、ASP627、SER630、MET679、ALA689和ASP690。Y041-5921与残基MET598有氢键作用，这是高效激酶抑制剂的最关键作用。此外Y041-5921还与AXL的P-loop区域的残基GLY543形成氢键作用。Y041-5921与残基ASP627形成的氢键作用使得其暴露在溶剂部分的结构更加稳定。

展望：

蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据重要地位，调节着细胞的生长、分化、死亡等一系列理化过程。编码酪氨酸激酶的基因发生过度扩增或突变，可导致酪氨酸激酶活性的持续增高进而诱发肿瘤，是以酪氨酸激酶为靶点的肿瘤靶向治疗的理论基础，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发逐步成为国际抗肿瘤药物研究的热点。目前为止，已有多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂上市，并取得了令人鼓舞的治疗效果。1998年，美国FDA正式批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌。2001年，Novartis公司研发的针对酪氨酸激酶Bcr-Abl的抑制剂Gleevec因对慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenousleukemia,CML)具有很好疗效而提前上市。2002年，AstraZeneca公司研发的IressaTM(ZD1839)被美国FDA批准用于治疗经标准含铂类方案和紫杉萜化疗后继续恶化的终未期非小细胞肺癌患者。Herceptin、Gleevec及Iressa的成功应用进一步证实了以特定靶点尤其是以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的研发是最有可能获得突破性进展的抗肿瘤药物研究领域，具有十分广阔的前景。因此，酪氨酸激酶抑制剂也极有可能成为治疗TNBC的有效药物。

AXL(Anexelekt)，是受体酪氨酸激酶家族中的一员，它与配体生长停滞特异性基因6(Growth arrest specific gene 6，Gas 6)结合后发生同源二聚化，引起酪氨酸自磷酸化(Y779、Y821、Y866，Y702等)和下游靶点的磷酸化，激活下游信号转导通路(主要包括PI3K-AKT、MAPK、NFκB等信号)，在细胞增殖、抗凋亡及肿瘤细胞的EMT和侵袭转移等方面都有重要的作用。近年来发现AXL在肺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、食管癌、肾癌、骨肉瘤、胃癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中都过度表达或者异位表达，提示AXL可能参与多种肿瘤的发生发展。在乳腺癌里，AXL常高表达于高侵袭性的乳腺癌细胞系(如MDA-MB-231、Hs578T、BT549、MDA-MB-435s、MDA-MB-157、MDA-MB-436等，大多数为TNBC细胞系)，而不表达或者低表达于低侵袭力的乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D等Luminal亚型细胞系)。AXL的表达与乳腺癌细胞的运动性和侵袭性相关，是乳腺癌治疗的潜在靶点。对AXL表达及活性的干预都将有可能成为治疗TNBC的潜在策略。

可以预见，如下结构式的多环化合物及其盐

式中，X为卤素，特别是Y041-5921(X＝F)及其盐有望通过高效结合并抑制AXL激酶活性，对多种肿瘤，特别是高AXL激酶活性(高于健康人平均水平，或肿瘤组织中的AXL激酶活性高于癌旁正常组织)的肿瘤，具有优于传统化疗药物的效果，具有优异的药物开发潜力。