虹鳟源性成分实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种利用线粒体基因检测动物制品中虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法。

背景技术

我国三文鱼养殖能力不足，而真正高品质的三文鱼数量有限、价钱高、需求大，大量依靠进口，因此才会出现众多商家和企业盯准三文鱼这块“肥肉”，和消费者玩起“偷换概念”的游戏。真正意义上的三文鱼（特指大西洋鲑，Salmon salar）是一种冷水鱼类，适宜生活在16至18摄氏度的水中，对水质的要求非常高，在养殖中稍有不慎就会导致死亡。由于成本原因，售价一直居高不下。大西洋鲑主要的物理替代物种为虹鳟（Oncorhynchusmykiss），鲑科大马哈鱼属（太平洋鲑属）的一种鱼类，英文名为rainbown trout。原产于北美洲北部和太平洋西岸，多数种群终身生活于低温淡水环境中。繁殖期的雄鱼上下颌变得弯曲，体侧从腮部至尾部的彩虹般桃红色纵带也越发艳丽，虹鳟的名字也由此而来。切片生食的虹鳟和大西洋鲑鱼物理性质十分相似，普通老百姓但从外表很难区分。

目前，中国三文鱼消费已进入快车道，到2018年我国三文鱼市场需求规模将接近90亿元，市场需求空前巨大，而我国目前现行标准均没有针对虹鳟的物种鉴定方法或试剂盒进行区分，这就导致了严重的技术断层。这一技术断层使得相关食品安全，市场监督监管部门在面对三文鱼相关产品物种鉴定需求时拿不出现行有效的检测技术依据。在面对突然的舆情、巨大的市场需求、价格差异，相关检测技术缺失必将产生严重的食品安全监管漏洞。如何利用技术手段对相关动物源性制品进行生物监测将是业界面临的一个重大挑战。因此迫切需要建立精确、快速、高灵敏的虹鳟特异性检测技术体系对三文鱼相关生物制品进行物种鉴定。

在我国海鲜市场，“掺假”问题一直是消费者投诉的焦点和社会关注的热点。一些不法商贩和企业因利益驱使将低成本原料掺入高价肉及肉制品中。这些行为不仅侵害消费者利益，还可能由于掺杂来源不明物种而导致严重生物安全问题，这些未经检验检疫来源不明的替代物种有可能引起严重疫病的传播，不利于维护社会安定和人民身体健康，如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象。为了打击肉类掺假的违法行为，维护消费者权益和生命安全，保障食品产业的健康发展，我们需要制定严格的法律法规来约束生产者和经营者的行为，同时我们需要制订准确、灵敏、简便的检测方法。因此，有必要建立一套特异性好、灵敏度高、操作便捷的动物制品中虹鳟源性成分荧光定量PCR检测鉴定方法。

发明内容

本发明首要目的在于提供一种虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技术所存在的难于对虹鳟成分进行检测、容易出现假阳性结果等的不足。本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒以及检测试剂盒的应用。本发明的第三个目的在于提供一种动物制品中虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法的引物对和探针。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，该方法包括以下步骤：

第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；

第二步，检测扩增产物的荧光信号；

第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有虹鳟源性成分；

其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增虹鳟源性成分的特异性引物对和虹鳟源性成分的特异性探针，所述扩增虹鳟源性成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述虹鳟源性成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：

反应体系为25μL：实时荧光PCR试剂(2×)12.5μL，引物各10μM，探针5μM，DNA模板5μL；

PCR反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s, 60℃ 1min；共45个循环。

作为本发明的第二个方面，一种虹鳟源性成分的检测试剂盒，该检测试剂盒含有以下试剂：

（a）扩增虹鳟源性成分的特异性引物对；

（b）虹鳟源性成分的特异性探针；

其中，所述扩增虹鳟源性成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述虹鳟源性成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述检测试剂盒还包括：

（c）标准参照物，用于定性检测样品中的虹鳟源性成分的含量。

作为本发明的第三个方面，一种所述的检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒用于定性检测食品或饲料中的虹鳟源性成分。

作为本发明的第四个方面，一种虹鳟源性成分的特异性引物对和探针，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明的有益效果是：

1、提供了一种来源于线粒体基因的可特异性鉴定虹鳟源性成分的引物对和探针，其特异性良好，对于虹鳟源性成分能够实现特异性扩增，而对于虹鳟以外的其它成分则不能特异性扩增；而且，所述引物对和探针具有良好的再现性、结果稳定可靠。

2、利用所述的引物和探针可快速、大批量地检测食品或饲料中是否存在虹鳟源性成分以及定性检测食品或饲料中的虹鳟源性成分的含量，并且所需样品量少，操作简单，灵敏度高。

3、荧光定量PCR只需微量的DNA模板即可检测。

4、本发明的虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，其适用范围广，特别适用于各类食品或饲料中的虹鳟源性成分的检测，因此可以推广应用，对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持，为食品的市场监督部门和检验检疫部门提供了技术支持。

附图说明

图1为实时荧光 PCR引物特异性试验的扩增曲线图。其中，阳性信号为虹鳟，扩增曲线是虹鳟肉DNA标准品。阴性对照、空白对照、提取对照和其它动物源性样品均无特异性扩增曲线。

图2为实时荧光PCR灵敏度试验的样本稀释方法示意图。

图3为实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。其中，扩增曲线从左到右分别是(W/W)：2 0ng/μL、2 ng/μL、0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、0.002 ng/μL、0.0002 ng/μL 的虹鳟核酸的样品及阴性对照的样品。

图4为实施例6虹鳟源性成分混合样本质量百分比检测5%、1%、0.1%的扩增曲线图。

图5为实施例7的实时荧光PCR的扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件或厂商提供的条件进行。

本发明的实验材料如下：

表

实施例1 引物对和探针的设计

1、本发明根据NCBI中虹鳟线粒体基因序列，设计了多组虹鳟特异性引物和探针，具体如下：

（1）第一组引物对和探针的设计

根据NCBI中虹鳟线粒体基因序列（Reference Sequence: XM_014734910.1），筛选特异性较好的靶基因序列片段进行引物探针设计。

针对虹鳟源性成分的目的片段长度为102bp。荧光PCR引物对和探针的序列如下：

O.mykiss-102bp-F：5’- AGTAATTATCGGCATACGAAACCAG -3’ ，（SEQ ID NO：1）。

O.mykiss-102bp-R：5’- GTTTCGATAATGATCAGTACTGGGATC -3’ ，（SEQ ID NO：2）。

O.mykiss-102bp-P：FAM- CTACGGCCGCCCTCGGCCATTTAT –TAMRA， （SEQ ID NO：3）。

其中，FAM表示荧光报告基团，TAMRA表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。

（2）第二组引物对和探针的设计

针对虹鳟序列如SEQ ID NO：4所示，设计荧光PCR引物对和探针。

ACGACCATTATTAACATAAAACCTCCAGCCATCTCTCAGTACCAAACCCCCCTTTTCGTTTGAGCCGTGCTAGTTACTGCTGTCCTTCTATTACTTTCCCTCCCCGTCCTGGCAGCAGGCATTACTATGTTACTTACAGACCGAAATCTAAACACCAC，（SEQ ID NO：4）

荧光PCR引物对和探针的序列如下：

O.mykiss-102TAMRA-F：ACCATTATTAACATAAAACCTCCAG，（SEQ ID NO：5）。

O.mykiss-102TAMRA-R：GTAATGCCTGCTGCCAGGA，（SEQ ID NO：6）。

O.mykiss-102TAMRA-P：FAM- AGTACCAAACCCCC-TAMRA，（SEQ ID NO：7）。

（3）第三组引物对和探针的设计

针对虹鳟序列如SEQ ID NO：8所示，设计荧光PCR引物对和探针。

ACCTTGAGGGGATCAACTCCACACCCCGACCCTGACACTCATCTGATCCACTGCCGTTCTAGCCCTTCTTACTCTTGGCTTA，（SEQ ID NO：8）。

荧光PCR引物对和探针的序列如下：

O.mykiss-82-F：ACCTTGAGGGGATCAACTCCA，（SEQ ID NO：9）。

O.mykiss-82-R：TAAGCCAAGAGTAAGAAGGGCTAGA，（SEQ ID NO：10）。

O.mykiss-82-P：CGACCCTGACACTCAT，（SEQ ID NO：11）。

（4）第四组引物对和探针的设计

针对虹鳟13820，序列如SEQ ID NO：12所示，设计荧光PCR引物对和探针。

TCCTATTAATTCGACTCCACCCTCTAATAGAAGATAACCAAACAGCCTTAACCGTATGCTTATGCCTAGGAGCCCTAACTACCCTCTTCACCGCTACCTG，（SEQ ID NO：12）。

荧光PCR引物对和探针的序列如下：

O.mykiss-100-F：TCCTATTAATTCGACTCCACCCTCTA，（SEQ ID NO：13）。

O.mykiss-100-R：CAGGTAGCGGTGAAGAGGGTA，（SEQ ID NO：14）。

O.mykiss-100-P：ACCAAACAGCCTTAACCGTA，（SEQ ID NO：15）。

（5）第五组引物对和探针的设计

针对虹鳟3870，序列如SEQ ID NO：16所示，设计荧光PCR引物对和探针。

CTCTTTCTCAGAGGTTCAAACCCTCTCCTTAGCTATGATTACCCTAATTACCCACGTTATTAATCCACTAGCATACATTGTACCCTTTCTGTTAGCAGTTGC，（SEQ ID NO：16）。

荧光PCR引物对和探针的序列如下：

O.mykiss-102MGB-F：CTCTTTCTCAGAGGTTCAAACCCT，（SEQ ID NO：17）。

O.mykiss-102MGB-R:

GCAACTGCTAACAGAAAGGGTACATGTACCCTTTCTGTTAGCAGTTGC，（SEQ ID NO：18）。

O.mykiss-102MGB-P：TCCTTAGCTATGATTACCCT，（SEQ ID NO：19）。

（6）第六组引物对和探针的设计

针对虹鳟4840，序列如SEQ ID NO：20所示，设计荧光PCR引物对和探针。

CATTTAGCACTTCCCATCGCACTAGCAGGCCTCCCCCCTCAGCTTTAGCCCGGAATTGTGCCTGAATGCTTAAGGACCACCTTGATAGC，（SEQ ID NO：20）。

荧光PCR引物对和探针的序列如下：

F：CATTTAGCACTTCCCATCGCAC，（SEQ ID NO：21）。

R：GCTATCAAGGTGGTCCTTAAGCATATGCTTAAGGACCACCTTGATAGC，（SEQ ID NO：22）。

P：CTCAGCTTTAGCCCGGAA，（SEQ ID NO：23）。

2、上述各组引物对和探针的实时荧光PCR的反应体系和反应程序

实时荧光PCR反应体系见表2。

实时荧光PCR反应程序为：95℃ 10min；95℃ 15s, 60℃ 1min；共45个循环。

表2 虹鳟源性成分实时荧光PCR反应体系

实施例2 测试样品的准备

动物肉类样品经撕碎、烘干后，使用冷冻研磨机(SPEX 6850)磨成粉末状。植物样品和用于实际验证的样品直接使用冷冻研磨机(SPEX 6850)磨成粉末状。以玉米粉为基质，加入鱼肉粉配制成含量分别为0.1%（W/W）、0.01%（W/W）、0.001%（W/W）、0.0001%（W/W）和0.00001%（W/W）的牛肉粉混合样品，用于灵敏度检测。

实施例3 DNA的抽提

使用动物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司；目录号：DP323)提取动物样品DNA，植物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司；目录号：DP305)提取植物样品DNA，动物源性植物饲料基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司；目录号：DP323)提取混合样品及实际验证样品DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。DNA 溶液置于-20℃保存备用。

实施例4 虹鳟源性成分引物对和探针的特异性检测

本实施例对实施例1中的6组引物探针的特异性进行了检测，第一组引物对和探针显示了最好的特异性，后续实验均使用这组引物探针进行。

第一组引物对和探针的特异性实验结果如图1所示。结果显示，第一组引物对和探针仅对虹鳟核酸扩增阳性，有明显S型扩增曲线，而对其它多个物种DNA样品均扩增阴性，无明显S型扩增曲线。即，除虹鳟核酸样品有显著扩增外其它物种均无扩增均有扩增。该实验说明，虹鳟源性成分检测引物和探针具备良好的种间特异性。

结论：本发明的检测方法具有良好的物种特异性。

实施例5 虹鳟源性成分引物对和探针的灵敏度检测

最低检测下限（Limit of Detection, LOD），在本方法中最低检测限（Limit ofDetection, LOD）被定义为可以进行稳定定性检出的最低浓度。每个浓度检测结果6个平行，能稳定检出（检出率大于95%）的最低浓度定义为最低检测下限，即LOD。

本实施例将含有虹鳟核酸的样品（20ng/μL）进行稀释得到浓度为2、0.2、0.02、0.002、0.0002ng/μL的样品进行检测。每个浓度进行6个平行重复。

具体样品稀释方法如图2所示。检测结果如图3和表3所示。

表3 最低检测下限（LOD）检测实验结果

注：Ct值大于35判定为阴性。阴性使用“－”，阳性使用“+”表示。

实验结果显示，在qPCR平台上，0.2ng/μL的6个平行样本在实验中均稳定检出，检出率为100%。根据最低定性检测下限的定义，初步判断本检测方法的LOD为0.2 ng/μL。

实施例6 混合样本质量百分比检测

虹鳟干燥肉粉与其他动物肉粉混合样品，其中虹鳟质量百分比分别为5%、1%、0.1%。每个梯度质量百分比的样品称取3份，每份100mg，提取核酸后进行纯化，50μL溶解体积时至少达到100ng/μL。提取的DNA进行qPCR检测。实验结果如表4和图4所示。

表4 混合样本质量百分比实验结果

注：Ct值大于35判定为阴性。阴性使用“－”，阳性使用“+”表示。

实验结果显示，在qPCR平台上，待检混合样本中虹鳟质量百分比大于等于1%、则3个平行均可以稳定检出，检出率为100%。则本检测方法的混合样本质量百分比最低检测下限为1% 。

实施例7 虹鳟源性成分引物探针的实际验证

采用上述的实时荧光PCR方法，对市场上、进出口贸易途径收集的10份动物制品样品进行检测。检测结果如表5和图5所示。

结果在3份肉质食品（三文鱼肉松等）样本中检出虹鳟源性成分。

在其他样本中未检出虹鳟源性成分。

表5 混合样本质量百分比实验结果

结论：样品的肉质来源与本发明方法的检测结果相符，证明本发明方法具备良好的适用性，可以完成对不同来源样本的检测。

结果显示，50ng样品测得值的平均值为53.7ng，0.5ng样品测得值的平均值为0.4ng。

本发明建立了利用线粒体基因检测动物制品中虹鳟源性成分的实时荧光PCR方法，针对虹鳟的线粒体基因设计引物对和探针，仅需结合实时荧光扩增曲线图，不超过两个小时就能准确检测到样品中是否存在虹鳟源性成份。

综上所述，本发明设计的虹鳟源性成份实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地区分是否含有虹鳟源性成分提供了一种很好的检测方法，在食品安全领域的检测把关上，具有良好的应用前景。而且，所述特异性引物对和探针可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，所述试剂盒除了所述特异性引物对和探针外，还可以包括标准参照物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 虹鳟源性成分实时荧光PCR检测方法

<130> 201103

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtaattatc ggcatacgaa accag 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtttcgataa tgatcagtac tgggatc 27

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<212> DNA

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ctacggccgc cctcggccat ttat 24

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<212> DNA

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acgaccatta ttaacataaa acctccagcc atctctcagt accaaacccc ccttttcgtt 60

tgagccgtgc tagttactgc tgtccttcta ttactttccc tccccgtcct ggcagcaggc 120

attactatgt tacttacaga ccgaaatcta aacaccac 158

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accattatta acataaaacc tccag 25

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gtaatgcctg ctgccagga 19

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agtaccaaac cccc 14

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accttgaggg gatcaactcc acaccccgac cctgacactc atctgatcca ctgccgttct 60

agcccttctt actcttggct ta 82

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accttgaggg gatcaactcc a 21

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cgaccctgac actcat 16

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tcctattaat tcgactccac cctctaatag aagataacca aacagcctta accgtatgct 60

tatgcctagg agccctaact accctcttca ccgctacctg 100

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tcctattaat tcgactccac cctcta 26

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catttagcac ttcccatcgc actagcaggc ctcccccctc agctttagcc cggaattgtg 60

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catttagcac ttcccatcgc ac 22

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gctatcaagg tggtccttaa gcatatgctt aaggaccacc ttgatagc 48

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