一种生产肌醇的毕赤酵母工程菌及发酵方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产肌醇的毕赤酵母工程菌及发酵方法。

背景技术

肌醇（myo-inositol），又称为环己六醇，是葡萄糖的同分异构体。作为一种水溶性维生素，肌醇类属于B族，肌醇理论上存在有九种异构体，其中肌醇是最为常见的一种。肌醇不仅在动植物体内分布广泛，而且在动物自身的多种器官如心脏、肝脏等都可以合成肌醇。肌醇因其生物活性作用，已经广泛应用于医疗、食品、饲料工业等领域中。在医疗领域中，肌醇多被用作辅助药物，不仅能维持人体体内正常的新陈代谢活动，而且可用于治疗神经疾病、糖尿病、维生素缺乏症、肝硬化等多种代谢类或神经性的疾病，研究表明肌醇的衍生物D-手性-肌醇作用于肾脏中通过直接影响胰岛素的分泌，可用于进行糖尿病等疾病的治疗。同时，肌醇对预防和治疗某些与胰岛素抵抗相关的人类疾病，如多囊卵巢综合征、妊娠糖尿病、代谢综合征、肾病、白内障等糖尿病并发症或如抑郁症和强迫性多动症等神经性疾病具有潜在益处。在食品领域中，由于肌醇不仅对肝脏起到保护作用，是肝脏细胞生长所必需的营养素，而且对脂质代谢、骨骼形成和骨骼肌代谢具有积极作用，所以在食品领域中，肌醇常作为功能性饮料的辅助活性补充添加剂及营养强化剂添加到功能性食品中。早在上世纪80年代，研究就发现，加入一定量肌醇到婴儿食品中，对儿童早期的生长发育有着很大的促进作用。还有研究报道肌醇对脂肪降解有很大作用，具有一定的减肥功效。同时，肌醇也具有抗氧化、抗衰老等作用，所以也应用在一些保健食品上。在饲料工业领域中，在饲料中添加一定量肌醇，其主要起到一种营养促进剂的作用，可促进家畜的生长发育，还会起到一定的镇定作用，可以防止毛发脱落。对水生动物来说，肌醇对维持机体的正常代谢和生理功能尤为重要。研究表明，对于大多数水生动物而言，肌醇被认为是必不可少的营养素，其缺乏会导致饲料转化率降低，生长速度下降，鳍片侵蚀，皮肤变黑和脂肪肝疾病。因此，肌醇已被广泛地用作水产养殖饲料的添加剂。还有研究发现当在虾的饲料中加入适量肌醇，不仅促进了虾的生长，而且还会促进饲料中的蛋白质的利用率。研究发现鱼类的干饲料中的肌醇最适添加量为300～500 mg/kg。

肌醇因其生物活性作用和广阔的应用领域，已经被大量生产，广泛应用在多个行业中。目前肌醇的主要的生产方式有水解法、化学法、酶合成法、微生物发酵法等。其中水解法与化学合成法都有着污染严重的问题，而酶合成法生产中伴随着生产步骤繁琐，纯化过程复杂等问题。肌醇的体内微生物生物合成因其低生产成本和环境友好的生产工艺而被认为是常规肌醇六磷酸水解方法的最有希望的替代方法。目前经代谢工程技术改造后的大肠杆菌是生产肌醇的主要微生物宿主。到目前为止，大肠杆菌工程菌株的肌醇产量可达到100g/L以上。但是，使用大肠杆菌菌株进行商业肌醇生产的主要缺点是该菌株不是生物安全菌株，其产生的内毒素等有毒物质会造成严重的安全隐患。因此开发出一种成本低，污染低，产率高、安全性高的肌醇生产菌株有很好的应用前景。

发明内容

为解决现有微生物发酵法生产肌醇存在的问题，本发明的目的是提供一种生产肌醇的毕赤酵母工程菌。

本发明的再一目的是提供一种发酵生产肌醇的方法。

根据本发明的产肌醇的毕赤酵母工程菌，所述工程菌为突变型毕赤酵母菌株，

其中，所述突变型毕赤酵母菌株包括过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因，并且被敲除了肌醇转运蛋白基因和果糖-6-磷酸激酶2（Pfk2）基因，并利用甘油诱导启动子调控表达葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）基因、果糖-6-磷酸激酶1（Pfk1）基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Zwf）基因，

其中，所述过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因为毕赤酵母自身来源的肌醇-1-磷酸合酶基因（

所述肌醇转运蛋白基因为肌醇转运蛋白1基因

所述甘油诱导启动子为毕赤酵母甘油激酶基因的启动子P

所述受甘油诱导启动子调控表达的基因为毕赤酵母自身葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（

根据本发明的构建产肌醇的毕赤酵母工程菌的方法，包括以下步骤：

过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因；

敲除肌醇转运蛋白基因和果糖-6-磷酸激酶2基因；

将葡萄糖-6-磷酸异构酶基因、果糖-6-磷酸激酶1基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的启动子替换成甘油诱导启动子，

其中，所述过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因为毕赤酵母自身来源的肌醇-1-磷酸合酶基因（

所述肌醇转运蛋白基因为肌醇转运蛋白1基因（

所述甘油诱导启动子为毕赤酵母甘油激酶基因的启动子P

所述受甘油诱导启动子调控表达的基因为毕赤酵母自身葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（

根据本发明的构建产肌醇的毕赤酵母工程菌的方法，其中，所述方法包括步骤：将毕赤酵母自身来源的肌醇-1-磷酸合酶基因（

根据本发明的构建产肌醇的毕赤酵母工程菌的方法，其中，所述方法包括步骤：将酿酒酵母来源的肌醇-1-磷酸合酶基因（

本发明另一个目的是提供一种发酵生产肌醇的方法，包括如下步骤：使用摇瓶或发酵罐发酵上述的产肌醇的毕赤酵母工程菌株，获得肌醇。

根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，利用甘油培养基发酵进行菌体生长，24小时后再补充葡萄糖进行肌醇生产。

根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，甘油培养基的配方为：20-50 g/L甘油，1.2 g/L KH

根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，在发酵24小时后以50 g/L的量补充葡萄糖，消耗完后再次补充相同量葡萄糖，直至发酵结束。

根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，所述发酵条件为温度28℃～30℃，pH控制在5.0-6.0。

本申请的技术方案的优点：

1. 本发明通过在毕赤酵母基因组上过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因，并敲除肌醇转运蛋白基因，提升毕赤酵母积累肌醇的能力。再通过敲除果糖-6-磷酸激酶2基因

2. 根据本申请的技术方案，在研究过程中旨在过表达的内源和外源肌醇合成关键酶基因为毕赤酵母自身来源的肌醇-1-磷酸合酶基因（

3. 根据本申请的技术方案，为了进一步降低糖酵解和磷酸戊糖途径的碳代谢流量，在上述突变型毕赤酵母中利用甘油诱导启动子调控表达葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（

附图说明

图1显示本发明的构建产肌醇的毕赤酵母工程菌的方法；

图2为本发明实施例1提供的毕赤酵母工程菌JQ02-1的发酵结果图；

图3为本发明实施例2提供的毕赤酵母工程菌JQ04的发酵结果图；

图4为本发明实施例3提供的毕赤酵母工程菌JQ05、JQ06、JQ07、JQ08的发酵结果图，其中，a：菌株JQ05；b：菌株JQ06；c：菌株JQ07；d：菌株JQ08；

图5为本发明实施例4提供的毕赤酵母菌JQ07、JQ08高密度发酵生产肌醇的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例1 构建过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因且敲除肌醇转运蛋白基因的毕赤酵母工程菌株

如图1所示，葡萄糖被转运进入细胞后生成葡萄糖-6-磷酸，之后葡萄糖-6-磷酸经过肌醇-1-磷酸合酶和肌醇单磷酸酶的催化生成肌醇，最后过量的肌醇会被外泌到细胞外。细胞外的肌醇可以通过两个肌醇转运蛋白（PpITR1和PpITR2）被吸收到细胞内，而胞内肌醇量过高会影响肌醇-1-磷酸合酶和肌醇单磷酸酶的表达及活性。因此，通过过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因且敲除肌醇转运蛋白基因可以有效提升毕赤酵母积累肌醇的能力。

利用

一、 构建

1. 肌醇-1-磷酸合酶基因（

用PCR扩增启动子P

2. 肌醇转运蛋白1基因

用PCR扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合酶基因

3. 肌醇转运蛋白2基因

用PCR扩增肌醇转运蛋白2基因

二、 构建JQ02-1工程菌株

将构建好的质粒pJQ01、pJQ02和pJQ02-1依次转化至毕赤酵母中，将毕赤酵母自身肌醇-1-磷酸合酶基因（

1. 毕赤酵母电转化感受态制备

毕赤酵母菌株接种到30 mL YPD培养基中，转速220 rpm，温度为30°C的摇床中培养48 h。吸取70 μL的种子液，接种至200 mL YPD培养基中，过夜培养至OD600达到1.0-1.5。将培养好的菌液在4°C，5,000 rpm条件下离心2 min，弃上清。加预冷的灭菌水至50 mL，轻摇混匀，悬浮细胞。在5,000 rpm条件下离心2 min，用100 mL预冷的灭菌水悬浮细胞。5,000rpm条件下离心2 mi，用50 mL预冷的1 mol/L无菌的山梨醇悬浮细胞，并重复一次。5,000rpm条件下离心2 min，加入适量（一般1～2 mL）预冷的无菌山梨醇悬浮细胞，最后将细胞分装至1.5 mL Eppendorf管中，放入液氮中速冻，-80°C保存并待用。

2. 电转化及突变株筛选

取构建好的质粒20 μL与80 μL感受态细胞混合，加入预冷的电击杯中，利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞，电转结束后，加入200μL的1 mol/L无菌的山梨醇，30℃复苏1 h，复苏结束后，将复苏菌液在5000～8000 rpm下离心2 min，根据复苏菌液浓度将部分上清吸出弃掉，将剩余菌液吸打混匀后加到含有zeocin抗性的平板上，用预先准备好的涂布棒进行涂布，30℃倒置培养。待菌落出现后，用无菌牙签挑取平板上的单克隆，使用检测引物PCR验证目的基因是否被替换或敲除，1%琼脂糖凝胶电泳验证结果。用无菌镊子夹取无菌牙签再次挑取平板上的确定基因被替换或敲除的单克隆，接种到YPD液体培养基中，每过24h补加一次甲醇（1%v/v），30℃，220 rpm恒温摇床培养48 h，将获得的菌液稀释涂布YPD固体培养基，30℃，倒置培养约48 h后观察。使用目的基因同源臂外侧检测引物PCR验证

三、 工程菌株JQ02-1的发酵实验

将上述工程菌株JQ02-1接种到50 mL BMGY培养基中，在30℃，220 rpm条件下培养48 h，作为“一级种子”；按10%接种量转接“一级种子”到含200 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，过夜培养，作为“二级种子”；将“二级种子”再次按10%接种量转接到含200 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，在30℃，220 rpm摇床中进行发酵，24 h后补充灭菌葡萄糖到发酵液中（终浓度为50 g/L）。其中所述BMGY发酵培养基成分为：20 g/L 甘油，1.2 g/L KH

实施例2 通过降低糖酵解代谢流提高肌醇产量

肌醇合成的前体是葡萄糖-6-磷酸，同时葡萄糖-6-磷酸也可进入糖酵解和磷酸戊糖途径进行代谢，因此降低糖酵解代谢流有助于提高葡萄糖-6-磷酸的供给。果糖-6-磷酸激酶基因

一、 构建

用PCR扩增果糖-6-磷酸激酶2基因

二、 构建JQ04工程菌株

利用实施例1中所示的电转化感受态制备及突变株筛选方法，将构建好的质粒pJQ04转化至工程菌株JQ02-1中，将工程菌株JQ02-1中的果糖-6-磷酸激酶2基因（

三、 工程菌株JQ04的发酵实验

将上述工程菌株JQ04接种到50 mL BMGY培养基中，在30℃，220 rpm条件下培养48h，作为“一级种子”；按10%接种量转接“一级种子”到含200 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，过夜培养，作为“二级种子”；将“二级种子”再次按10%接种量转接到含200 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，在30℃，220 rpm摇床中进行发酵，24 h后补充灭菌葡萄糖到发酵液中（终浓度为50 g/L）。其中所述BMGY发酵培养基成分为：20 g/L 甘油，1.2 g/L KH

实施例3 通过动态调控糖酵解和磷酸戊糖途径进一步提高肌醇产量

通过实施例2证明降低糖酵解代谢流有助于提高葡萄糖-6-磷酸的供给，进而提高肌醇产量。因此为了进一步提高葡萄糖-6-磷酸的供给，利用甘油诱导启动子调控表达糖酵解途径中编码葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的

一、 构建

1. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（

用PCR扩增甘油激酶基因的启动子P

2. 葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（

用PCR扩增甘油激酶基因的启动子P

3. 果糖-6-磷酸激酶1基因（

用PCR扩增甘油激酶基因的启动子P

二、 构建JQ05、JQ06、JQ07、JQ08工程菌株

利用实施例1中所示的电转化感受态制备及突变株筛选方法，将构建好的质粒pJQ05、pJQ06、pJQ08转化至工程菌株JQ04中，将工程菌株JQ04中的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（

三、 工程菌株JQ05、JQ06、JQ07、JQ08的发酵实验

将上述工程菌株JQ05、JQ06、JQ07、JQ08分别接种到50 mL BMGY培养基中，在30℃，220 rpm条件下培养48 h，作为“一级种子”；按10%接种量转接“一级种子”到含200 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，过夜培养，作为“二级种子”；将“二级种子”再次按10%接种量转接到含200 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，在30℃，220 rpm摇床中进行发酵，24 h后补充灭菌葡萄糖到发酵液中（终浓度为50 g/L）。其中所述BMGY发酵培养基成分为：20 g/L 甘油，1.2g/L KH

实施例4 利用甘油和葡萄糖进行高密度发酵

将摇瓶发酵实验中产肌醇较高的两个菌株（JQ07和JQ08）在10 L发酵罐中进行高密发酵实验。

首先将JQ07和JQ08菌株接种于50 mL BMGY培养基中，30℃，220 rpm摇床中培养48h，作为“一级种子”。 按10%接种量转接“一级种子”到含200 mL YPD培养基的1 L三角瓶中，30℃，220 rpm摇床中过夜培养，获得“二级种子”。将“二级种子”液全部接种到含有7 L发酵培养基的10 L发酵罐中，在pH设定为5.0，温度设定为30℃，转速800 rpm条件下进行发酵。发酵培养基成分为：50 g/L 甘油，1.2 g/L KH

表1本发明各实施例中采用的宿主列表

本发明实施例提供的上述生产肌醇的毕赤酵母菌通过以下方法提高肌醇的产量：

第一，通过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因、敲除了肌醇转运蛋白基因，提升毕赤酵母积累肌醇的能力；第二，通过敲除果糖-6-磷酸激酶2（Pfk2）基因降低糖酵解代谢流量，提升肌醇合成前体物葡萄糖-6-磷酸供给；第三，通过甘油诱导启动子调控表达葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）基因、果糖-6-磷酸激酶1（Pfk1）基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Zwf）基因，实现菌体生长及肌醇生产的优化，提高了毕赤酵母工程菌株肌醇的生产能力。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种生产肌醇的毕赤酵母工程菌及发酵方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 毕赤酵母(Pichia pastoris)

<400> 1

atgactattc aatacactcc taaagtccaa gtcaacactg acaaggcaag atacaccgag 60

aatgaactgc ttaccgacta cacctatgag aacactatag ttgaaaagca agctgacggt 120

acttacaacg tcactccaac ttccctggac tttgagttca aggttgactt gaagacacca 180

aagacgggtt tgttgctggt aggtcttggt ggtaacaatg gtaccacctt ggttggttcc 240

gtgttagcca acaaacacaa tatatccttt gagaccaaga cgggtattca gcagccaaac 300

tactatggtt ctgttacaca agcttctact gttaagttgg gaattgacag caatggtaga 360

gatgtctacg cccctttcaa ctctttgtta ccattggttc accccaatga ctttgtagtt 420

ggaggttggg atatcagtgg ccttgatttg gcctcctcta tgagaagatc tcaagtcttg 480

caaccagact tggtcagaaa gttggagcct tacatgaagg atattgttcc tctgccttct 540

gtctactacc cagatttcat tgctgctaac cagaacgaaa gagccgacaa ctgtttcaat 600

agagaaggca aagatggaga agtttctacc aagggtaaat ggtcccacgt tgagcgcatt 660

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ctgatcaagg ctatcaaaaa cgaccatgag gaagtctctg cttctacaat ttttgctgtt 840

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gtctcaatcg catcttacaa ccatcttgga aacaatgacg gttacaattt gagtgcacca 1080

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aacgagattt tgtacaatga gaagaacgga aataccattg accattgcat tgtcatcaag 1200

tacatgaagg ccgttggtga cgacaaagtt gccatggatg aataccattc cgaactgatg 1260

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ccattgatca ttgatctggt tgtaatggct gaattccttt ccagagtttc ttacaagaag 1380

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gaggagagat tacagtag 1578

<210> 2

<211> 1602

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

atgacagaag ataatattgc tccaatcacc tccgttaaag tagttaccga caagtgcacg 60

tacaaggaca acgagctgct caccaagtac agctacgaaa atgctgtagt tacgaagaca 120

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tttgcagcag catctatctt ggaaggtgtc ccctatatta atggttcacc gcagaatact 900

tttgttcccg gcttggttca gctggctgag catgagggta cattcattgc gggagacgat 960

ctcaagtcgg gacaaaccaa gttgaagtct gttctggccc agttcttagt ggatgcaggt 1020

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ctggctacgc ccttgatcat cgatctttta gtcatgactg agttttgtac aagagtgtcc 1380

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ttaaccttct tgagttactg gttaaaagct ccattaacaa gaccaggatt tcacccggtg 1500

aatggcttaa acaagcaaag aaccgcctta gaaaattttt taagattgtt gattggattg 1560

ccttctcaaa acgaactaag attcgaagag agattgttgt aa 1602

<210> 3

<211> 804

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

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aaaaactatg aaaccccgga cgctgtagaa gcgagccaga aaggcagtaa cgatttcgtg 120

accaacgtag ataaagctgc cgaagcggtg attatcgaca cgattcgtaa atcttaccca 180

cagcacacca tcatcaccga agaaagcggt gaacttgaag gtactgatca ggatgttcaa 240

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gtatctatcg ctgttcgtat caaaggccgc accgaagttg ctgtggtata cgatcctatg 360

cgtaacgaac tgttcaccgc cactcgcggt cagggcgcac agctgaacgg ctaccgactg 420

cgcggcagca ccgctcgcga tctcgacggt actattctgg cgaccggctt cccgttcaaa 480

gcaaaacagt acgccactac ctacatcaac atcgtcggca aactgttcaa cgaatgtgca 540

gacttccgtc gtaccggttc tgcggcgctg gatctggctt acgtcgctgc gggtcgtgtt 600

gacggtttct ttgaaatcgg tctgcgcccg tgggacttcg ccgcaggcga gctgctggtt 660

cgtgaagcgg gcggcatcgt cagcgacttc accggtggtc ataactacat gctgaccggt 720

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ttaagcgacg ctctgaagcg ttaa 804

<210> 4

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcaaag aaagcggaaa ggttctacaa gtcaactatt cggactcgga aacctccaac 60

ggagaagacc agtacgtcca caagataaaa cctgtagagg atgaggacga cacgtcgatg 120

atgatgtctt tcgacaatca caagcccact attactatca ttatcttaac cgtgatggca 180

tcgttttctg gattcatgtt tggttttgac acaggttaca tctcgtcagc cctggtgtcc 240

attggtacgg atttggacaa taaggttctt acttatggag agaaggaact gatcacctct 300

gcaacctcgt tgggagcttt gttgtcagcc atatctgctg gtttgttggc cgatattatc 360

ggaagaaaac ccgtcatcat gggatcaaat ttgctgtttg tcgttggttc tgtcattcaa 420

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attatgacca acaagttaga gaaagccgcc aaagtcatcg gcaaaactca taacgaatct 780

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ggatcaaacc cattccagaa gacctggaat gccatcaagg aaattcacag ggttccttcc 900

aacttcagag ctttggttat tggatgtggt ttgcaaggta ttcaacaatt cacaggcttc 960

aattctttaa tgtacttttc agctactgtt ttcgaaacaa ttggattcaa aaattctacc 1020

gctgtttccc tgattgtcgc aggtacaaac ttcattttta catcaatcgc attttttgtc 1080

attgacagag tcggaagaag aagaatcctt ctgataggtg ttacaggaat gattctttct 1140

ttggttatgt gtgctgtcgc atttcatttc ctggacatcc acttcagtgg ccacaacgcc 1200

attgtcgaga ctaatggtat cagtggtact ggtgtagcta tcatcgtcgg tatgatccta 1260

tacgttgcaa gttacgctct tggtattgga aacgttcctt ggcaacaatc tgaattgttc 1320

cctcaatctg tcagaggtgt tggttctgct tactgtaccg ctgttaactg gtctggatct 1380

ctggtaattg cttccacttt cctaaccatg ctggagaata ttacaccaac tggaacgttt 1440

tctttctttg ccggattgtc tttcgtttcc ttaatctttg tgttcttttg ctaccctgag 1500

ttgtctggtc tgaaattgga agagacccaa gagatactga ctggtggatt caacatcaag 1560

gcatctttga agttggccaa gcaaaggaga aataagcaat tagaggaccc cgacaagatt 1620

gtgcataagg tggtagatca agtttaa 1647

<210> 5

<211> 1878

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtctaaca ctaaagaaac aggtttgttt gaaaccggtt caacatcatc agaaaacgaa 60

aagcaatcca tttcagacaa tgaaatagca gaaagcttag atcagcaaaa tatcttgaca 120

cagtacagtg aagaagacgt tatgtctatg gggagaaact atgctatcaa acatggtttg 180

gaccccgatc tgtttgcaaa aggagctgcg attgctagaa atcccatagg ttacaacaga 240

atggagttcc tttctcagga agaaaaggag attttatatc aggaagagca ccaaaagtgg 300

aaacttccca agaagcttta ttatctgatc ataatggctt ccatgggtgc atgtgtccag 360

ggtatggatg agtctgtcat caatggtgca aatttgactt atcctgcagg tttgggaatt 420

ggtagcgaca gtgaaaggga ctcttggctg caaggtttag taaactcagc accgtacata 480

tgctgtggtc tcatatcgtg ttggatgact gatgcctgga acgctaggct ggggcgaaag 540

tggaccatct tttggacatg cttcatctca gctattacct gtttctggca aggattctgt 600

aatacatggt accatttgtt tatcgcccgt ttcatgctag ggttcggaat tggaccaaag 660

tctgcaacta ttcctgttta cgcagcagaa tgtgtccctc ataaaatcag gggagcactg 720

gtaatgatgt ggcaaatgtg gacagctttt gggatcatgc tgggctacgt gttctctctg 780

gcatttcata aagttcctga ccatggaatt ggaggaggtg gtttagcctg gaggttgatg 840

cttggttctg ccatgcttcc agcaatcgtg gtatgtctcc aggtttggtc ctgtccagaa 900

tctccaaggt ggctaatggg taaagaaaga catgccgaag cctacgaatc tttaaaagtt 960

ttaagaaacc atcctgttca agccgctaga gataccttct accaaaatgt tttattgatg 1020

gaagaaaact cttacacatc tatgggtttc tttggcaagt tgaaggaaat ggttgtcgtc 1080

agaaggaata gaaatggagc catgggcgct ggtattgtca tgtttatgca gcaattctgc 1140

ggaataaacg tcattgccta ctattcttcg tctattttcg ttgaatcagg attcactgaa 1200

acgtcggcgt tattggcctc ttggggattc ggtatgatca actggctttt tgcgcttcca 1260

gctgttttca ctattgatct tgctggtagg aggacgcttc ttctgattac ctttccatta 1320

atgtcaatga tgctgcttct ggcagggttc tctttctgga tccctgaaga aaatgaaaaa 1380

gcaagagttg gtgttgtttc tcttggtatt tatctattcg cagccatcta ctcttctgga 1440

gaaggtccgg ttcctttcac atactcagct gagtgtgccc cgttatatat ccgtgatgtt 1500

gtgatgtcat ttgctactgc aacttgttgg ttcttcaaca gtgtcttagc actcacttgg 1560

ccttctttga aaaatgcttt caaggtgcaa ggtgcatttg gtttctatgc tgcatggaat 1620

atagtaggat tctttctggt attgatgttc ctaccagaga caaagggttt gacgctagaa 1680

gaactagatg acgttttcga tgtgcctaca tggcagcatg cttcatatca gttgaaaaag 1740

atgtggatta acattcagag aaatatcatc aggaaggacg tcgaacctat gcccccgttg 1800

tacaaacatc acagaatggc tcttactaat gctcaatggg aagaaaaaca cgaagtggaa 1860

cttgttgaaa acgtctag 1878

<210> 6

<211> 2827

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgccagacg cttcactctt taacggaact tcgtttataa cgttatttgc gcccaacatc 60

tccttattcc aggcctccat tgatttctac acagatcgct tggggtttgc tattaaggag 120

acctcaaatc agaagttagt ttggttacag cttgaagaag attcaaataa tgtttcaatt 180

caattgcttc tagatccaga acatgctgct tccgtgtctc agattgatca gaatattcgc 240

aatttgacca gatcgttata ccggaaagac tggagatcaa ttcagtctaa tattgcgttc 300

aagagctctt cactaagtaa gctcgtcaag ttgctgaagg atggaggcca tcctgtacag 360

caaagtccta atgagatttc accttttgaa gtttacacgt tagatcccct aggctcattg 420

ataggtttca gcggattcaa gaatccattt gctgtcaacg aacgttcttt gcttccaaag 480

gtttccgaag agaaagctta ccgtactgaa gatgactcag aaaagctttt cactcccatc 540

cgtaaaacca tcggagttat gacatccgga ggtgactctc cagggatgaa ccctttcgtt 600

agagcggtgg ttcgggcagg aatctacaag ggttgcaaag tattttgtat tcacgaagga 660

tatgagggac ttgtacgtgg gggtgaaaaa tacatcaagg agacgcaatg gcacgacgtt 720

cgtggatggc ttgtagaagg cggaaccaat ataggaactg ctaggtgcaa agaattcaga 780

gaacgctctg gccgacttaa agcttgcaag aatatgattg atatgggtat tgatgcgcta 840

atcgtttgtg ggggtgatgg ttcgctaaca ggtgcggacc gatttcgttc agaatggcca 900

agtttgattg aagagttatt gcaaactgaa cgaatctccc agcaacagtt tgaaacttat 960

caaaatttga atatatgcgg agccgtcggc tctatcgaca atgatatgtc atcaacagat 1020

gccacgatcg gagccttctc ctctttggat agaatctgcc gggctattga ctacattgat 1080

gctaccgcca attctcattc tcgagccttc atcgttgaag tcatgggccg ccattgtggt 1140

tggttaggtc ttttggctgg tctagcgaca agtgcagact acatcttgat cccagagaaa 1200

cctgcatctt caagagagtg gcaagatcaa atgtgtgaca tagtcagcaa acatagggca 1260

aggggaaaac gaaagaccat tgttattgtt gctgaaggtg ctatcagcaa tgatttgagt 1320

ccaatttcct gcgatcaagt caaggacgtt ctggtcaata gattagggct tgataccaga 1380

gttaccactc ttggtcacgt acaaaggggc ggtactgcgg ttgcttttga cagaatatac 1440

gctactttgc aaggggtcga agccgttaat gctgttttgg aatgcaatgc ggacacgccg 1500

tcacccatga ttgctattaa ggaagatcaa attacgagag ttcctcttgt tgacgctgtg 1560

gagcttacac agcaagttgc aaagtccatc gaatctcgta actttaagag ggctatttca 1620

ttgcgagatt ctgagtttgt cgaacacatg aagaacttta tctcaactaa ctccgcggat 1680

catgttcctc cttctttacc tctagaaaag cgaaagaaag ttgcaatcat aaacgttgga 1740

gctccagcgg gaggaatgaa cagtgcggtt tacagtatgg ccacctattg catgtccaga 1800

gggcatgttc catatgctat ccacaacggg ttcagtggtt tggctcgtca tgaatctgtt 1860

agatctataa actggttgga cattgaaggt tggggttctc taggtggctc agagatagga 1920

accaacagaa ctcttccaaa tgatgccgat attgggatga ttgcctactt ctttgaaaag 1980

tatggttttg atggcctgat tcttgttggt ggatttgaag cttttatctc acttcatcaa 2040

ttggaaaggg cccgaatcaa ttatccgtct ctaagaatac ccttggttct tattcctgct 2100

accatttcta acaatgtgcc tggaaccgaa tattccttgg gttcagatac gtgtcttaac 2160

tcttttatgg aatactgtga tgtaatcaag caatctgcag ctgcaactag aaacagagtg 2220

tttgttgttg aggtccaggg tggaaattca ggatacattg caacccatgc gcaactcgct 2280

tgtggtgctc agatttctta cgtccctgag gaaggtattt cgctggctca gcttgaaatg 2340

gatatcaatt ctttgaaaga gtcctttgcc aatgaccaag gaaagacaaa attcaggcag 2400

actgattttg aagtcggaga atgcatcgaa ggtactcact acggaagtaa tctccactat 2460

catagatgat gaagctagtg gcagatttga ctcaaaaaca gctattccgg ggcatgttca 2520

gcagggtggt attccttctc cgatggatcg tgtgagggcc tctagatttg caattcgtgc 2580

tgtctctttt attgagaagc actctgataa atgtcaagct ttcaaaaatt cgattagttt 2640

ccgacaaaca gatgagatca cttccacggc tgttgtcctt ggtattcaca agtcccaact 2700

gagattcact ccaattcgac aattatacga ttttgagtct gatgtaccaa ggcgtatgag 2760

aaaaaatatt ttttggagta acgtacgaga aatcagtgat atgttaagtg gaagaacctc 2820

gttatag 2827

<210> 7

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acttgagatg catggacgga atcaaacacg gaaaaatcta ggtcatccta cagcaaacac 60

ctgcaaggcc gggaaagaat tgctcggtat tttctatttt gggagatttg ttggcacgga 120

agaatcggta actttactaa tccaatactc cgctcctgac tgtttcaagt cggaccccaa 180

ctttcaagtg acccaattta gcagcctgca ttctcttgat tttatggggg aaactaacaa 240

tagtgttgcc ttgattttaa gtggcattgt tctttgaaat cgaaattggg gataacgtca 300

taccgaaagg taaacaactt cggggaattg ccctggttaa acatttatta agcgagataa 360

ataggggata gcgagatagg gggcggagaa gaagaagggt gttaaattgc tgaaatctct 420

caatctggaa gaaacggaat aaattaactc cttcctgaga taataagatc cgactctgct 480

atgaccccac acggtactga cctcggcata ccccattgga tctggtgcga agcaacaggt 540

cctgaaacct ttatcacgtg tagtagattg accttccagc aaaaaaaggc attatatatt 600

ttgttgttga aggggtgagg ggaggtgcag gtggttcttt tattcgtctt gtagttaatt 660

ttcccggggt tgcggagcgt caaaagtttg cccgatctga tagcttgcaa gatgccaccg 720

cttatccaac gcacttcaga gagcttgccg tagaaagaac gttttcctcg tagtattcca 780

gcacttcatg gtgaagtcgc tatttcaccg aagggggggt attaaggttg cgcaccccct 840

ccccacaccc cagaatcgtt tattggctgg gttcaatggc gtttgagtta gcacattttt 900

tccttaaaca ccctccaaac acggataaaa atgcatgtgc atcctgaaac tggtagagat 960

gcgtactccg tgctccgata ataacagtgg tgttggggtt gctgttagct cacgcactcc 1020

gttttttttt caaccagcaa aattcgatgg ggagaaactt ggggtacttt gccgactcct 1080

ccaccatact ggtatataaa taatactcgc ccacttttcg tttgctgctt ttatatttca 1140

aggactgaaa aagactcttc ttctactttt tcacactata ccacagatat atctactata 1200

<210> 8

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaccgata cgaaagccgt agaatttgtg ggccacacag ccattgtagt ctttggagct 60

tcaggggacc tggctaagaa gaagactttc cctgccctct tcggacttta ccgtgaggga 120

tacctgtcca acaaggtgaa gattattggc tatgctagat caaagctgga tgacaaggag 180

ttcaaggata gaattgtggg ctatttcaag acaaagaaca agggcgacga ggacaaagtt 240

caagaattct taaagttgtg ctcatatatt tcagctcctt atgacaaacc agatgggtat 300

gaaaagttga atgaaactat taacgaattc gaaaaggaaa acaacgtcga acagtctcac 360

aggttgttct acttagcttt gcccccttct gttttcatac ctgttgctac ggaggtcaag 420

aagtatgttc atccaggttc taaagggatt gctcggatta tcgtggaaaa acctttcggg 480

cacgacttgc agtcagcaga agagcttttg aatgctttga agccgatctg gaaagaagag 540

gaattgttta gaatcgacca ctatctaggt aaggagatgg ttaagaattt gttggccttc 600

cgttttggaa acgcattcat caatgcttct tgggacaaca gacatatcag ctgtatccaa 660

atctcgttca aggagccttt tggaacagaa ggtcgtggtg gctattttga ctcaattggt 720

ataataagag acgtcattca gaaccacttg cttcaagtgt taaccctctt aaccatggag 780

agacccgtct ctaatgaccc tgaggctgtt agagatgaaa aggttcgcat tctgaagtca 840

atttctgagc tagatttgaa cgacgttttg gtgggtcaat acggcaaatc tgaggatgga 900

aagaagccag cttatgtgga tgatgaaact gttaagccag gttctaaatg tgtcacattt 960

gcagccattg gcttgcacat caacacagaa aggtgggaag gtgtcccaat cattttaaga 1020

gctggtaagg ctttgaacga aggtaaagtt gagattagag tgcaatacaa acagtctact 1080

ggatttctca atgatattca gcgaaatgaa ttggtcatcc gtgtgcagcc taacgaagcc 1140

atgtacatga aactgaactc caaagtccca ggtgtttccc aaaagactac tgtcactgag 1200

ctagacctca cttacaaaga ccgttacgaa aacttttaca ttccagaggc atatgaatca 1260

cttatcagag atgctatgaa gggagatcac tctaattttg tcagagatga cgagttgata 1320

caaagttgga agattttcac tcctttactg tatcacttgg agggccctga tgcaccggct 1380

ccagaaatct atccctacgg atccagaggt ccagcttcat tgaccaaatt cttgcaagat 1440

catgattact tctttgaatc acgcgacaat taccaatggc cagtgacaag acccgatgtg 1500

ctgcacaaga tgtaa 1515

<210> 9

<211> 2970

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgccagaac catctataag tgcactttcc ttcacttcgt ttgtcactaa tgatgacaaa 60

ctgtttgaag agactttcaa tttttacacg aagttgggct tccacgcaac acgctcatat 120

gttaaagaca accggtcaga ctttgaattg acggggattt ccacggattc aatcaaggaa 180

atctggctgg aaagtttccc actatctgaa gtggtcgaaa cgtcagctgg tagagagttg 240

agaaaaccac tgcaagaatc tgtgggctac caatctgaag ctcttctggg atattctccc 300

taccagagtg acggtgttgt tataaaatta aggttatcaa atcatgacct tcagaaaaac 360

aaagacttgc ccggtgaagt tacgtttttc accgctagta tcgacaaatt aagagctaaa 420

ctcattgaaa ttggtgctga gataattccc tcagaaatag accttgttga attttcaacc 480

aaggatccta tgggcgacgt cattagcttt tcttcttatc cctctttgag ttccaagaag 540

attacctctc cagacttttt cctccaccct aagaaggaag tacgctccca agaatcaata 600

gttgagcagg ttaaatctga agaaggtaag aagaagattg ccatcataac ttcaggtgga 660

gacgcaccgg gaatgaatgc tgcagtaagg gctgtgacaa gagccggtat tttctatggc 720

tgtaaagttt acgcttgtta tgaaggttac actggactgg ttaagggtgg tgatatgtta 780

aaggaactgc agtggcaaga tgtccgtggt ttactttcca ttggtggtac cataattggt 840

actgcaagaa gtaaggaatt cagagaacga tggggccgtc ttcaagcttg ctacaatatg 900

gtcagcaatg gtattgatgc gttagttgtt tgtggaggtg acggatctct tacaggtgcc 960

gatctatttc gaaatgaatg gcctgaactg ataaaggaac ttttgggtga gggcaaaatt 1020

acaaaagaac aatatgaaac acacagaaac ttgacaatcg taggtctcgt tggttctatc 1080

gataacgata tgtgcggaac tgattccaca attggtgctt attcctcatt ggagagaatc 1140

atagagctgg tagactacat cgatgctact gccgcctccc attcacgagc cttcgtggtg 1200

gaagtcatgg gtagacattg tggatggtta ggtttaatgt ccggaattgc tactggagct 1260

gattacattt tcatccctga aagacctcca agtgaaacaa actggaagga cgacttgaag 1320

aaagtctgtt tgagacatag agagaaagga cgcaggaaga ccaccgttat tgttgctgaa 1380

ggtgctattg atgaccaact gaaccctatc acttctgaag aggtgaaaga tgtactagtg 1440

gagattggtt tggacactcg tattacccgt ctaggacatg tccaaagagg tggagctccg 1500

tgtgcttttg atagattctt ggccactgtt caaggtgttg atgctgttag ggctgtttta 1560

gaaagcaccc cagcaattcc ttctcctgtc atcagcattt tggagaacaa aattgttcgc 1620

cagccgttgg tggaatctgt tgctcaaaca aagactgtca gtgatgctat cgaggccaag 1680

gatttcgata aagctttgaa attaagagac caagagtttg ccacatcata tgagagcttc 1740

ctgtccgttt ccaagtatga cgatggatca tatctagtac cagagagctc aagattaaat 1800

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ttaattcgcc acggcgctgt acgagagctc aactggattg atgttgagga ctggcacaac 1980

acaggtgggt cggagattgg taccaacaga agtcttccta gtgatgatat gggcactgtg 2040

gcgtactact tccagcaata caagtttgat ggtcttatta ttatcggtgg atttgaagct 2100

ttcacagctc tgtaccagct ggacgcagct cgtgctcagt atcctatctt caatattcca 2160

atgtgttgtc ttccagctac tgtttctaat aacgttcctg gtaccgagta ttccttaggg 2220

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agctacgctg gtctgatcac aggagctttg gctgtttata ctcctgaaaa cccaatcaac 2400

cttcaaacag tgcaggaaga cattgaattg ttgactcgaa catacgagga agacgatggt 2460

aagaacagat cgggtaaaat ctttattcat aatgaaaagg cttcaaaggt ttacaccacg 2520

gatctgattg ctgctatcat aggtgaagct ggaaagggta ggtttgagag ccgtactgcc 2580

gtgcctggtc atgtacaaca gggtaaatct ccctcatcta ttgaccgggt taatgcctgc 2640

agactggcta tcaaatgttg taacttcatc gaggacgcca atttccaggt gaaacacaat 2700

gccaatttga gcgccgacga acgtcatttg agattctttt acgatgacgg agttaagaca 2760

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<210> 10

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgccgtctc tattgcaaga ggacaatgct actttcaagc tcgcatccga actaccagct 60

ttcgaagagc taaaagagct ttataagtca aagggaaaga acttttctgc caaacaggct 120

ttccaaaagg atccagccag atcttccaag ttcagccaca ctttcaagaa cttcgacggg 180

actgaggtgt ttttcgactt ttccaagaac ttgatcgatg atgagattct cgccaaactg 240

ttcgacttgg ccagacaggc aaacgtcgag aaactccgaa acgagatgtt tgccggagaa 300

catattaatg tcacagagga cagggctgtt ttccacgtcg ctctgagaaa cagagctaac 360

cgcccaatgt acgttgacgg caagaacgtc gccccagaag ttgatagtgt tttgcaacat 420

atgaaggagt tctctacgca ggttcgcgat ggtacctgga agggatacac tggtaagcag 480

atcactgatg tggtcaacat tggtatcgga ggctctgact tgggtccagt catggtgaca 540

gaggcattga agccttacgc ccaggaagga ctgcatgttc acttcgtatc caacgtggac 600

ggtacccata ttgctgagac tctaaaatac ttggatcctg agtctactct tttcttgatt 660

gcatccaaga ctttcacaac cgctgaaacc atccgtaacg ccaatactgc taaggactgg 720

ttcctttcga aaactggtaa caaaagtgag gcaattgcca agcattttgc tgctttatcc 780

acaaatgccg aggaggtcgc aaagttcggt atcgacacta agaatatgtt cggttttgaa 840

aactgggttg gtggacgtta ctctgtgtgg tctgctatcg gtctttcagt tgccatctac 900

attggttttg acaactttga ggacttcttg aagggtgccg aagccgtgga cagacatttc 960

ctggaaactc ctctggagca aaacatccca gttattggtg gactactctc cgtttggtat 1020

actaacttct ttggaagtca gacacatttg gtcactccat ttgaccaata tatgcacaga 1080

ttccctgcct acttacaaca attgtccatg gaatccaacg gtaaatctgt taccaagggc 1140

aatgttttcg ccaactacag caccggccct gtcgtctttg gtgagccaac aacaaatgct 1200

caacattcat tcttccaatt ggtgcatcaa ggtactcatt tgatccctgc cgatttcatt 1260

ttggctgcaa aatcccacaa ccctgttgca aacaacgctc accaaatctt gttggcatct 1320

aacttcttgg ctcaagccga gtctttattg ctaggaaaga ctgaagagga agtagctgct 1380

gctggtgcta ctggtggtct aattccacac aaagtatttt caggtaacag accaactaca 1440

tctattctga cacagaaaat cactcccgca accttaggtt ctttgatcgc ttattatgag 1500

cacgtcacat tcaccgaagg agctatatgg aacatcaact catttgatca atggggtgtt 1560

gagctaggaa aggttctagc caaggctgtc cagaaagatc tgcaggatga cagtgccaac 1620

gttgaagaaa gccacgactc atccactgct caattgatca agaagttcaa agcttgggct 1680

taa 1683

<210> 11

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttttgtaga aatgtcttgg tgtcctcgtc caatcaggta gccatctctg aaatatctgg 60

ctccgttgca actccgaacg acctgctggc aacgtaaaat tctccggggt aaaacttaaa 120

tgtggagtaa tggaaccaga aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc 180

gtccctagga aattttactc tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct 240

cttcccagca ttacgttgcg ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg 300

atggaaaagt cccggccgtc gctggcaata atagcgggcg gacgcatgtc atgagattat 360

tggaaaccac cagaatcgaa tataaaaggc gaacaccttt cccaattttg gtttctcctg 420

acccaaagac tttaaattta atttatttgt ccctatttca atcaattgaa caactat 477

<210> 12

<211> 416

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttctttac ctggatataa ataaaaaaaa ggaaacacaa tctctgtttc aagaaattag 60

ggattttagt ctgcttatat acttcgcgct accccgcgac ccgagcaact actagcctta 120

caaacgcttt gcactcagaa aacaagtgcg acattttgct ttttttcaaa ctgtgacgtt 180

agcgacaacc ctggtttgaa ctcgttttcg accaataaga tcatcgcaac cgatcagccc 240

ggtctcaatt gtacgtgtac aactcagcat ggccgcaaat aaggaacggt accttttgtg 300

gccaaatgag tggcgttgct gctaacaagg tgagccatca actggtatat atagacgagt 360

tccctcctac ctgctttttc tccttttttt tattgctcaa ctactatcga taaaac 416