从茶籽粕中提取得到的降血糖肽

技术领域

本发明涉及一种从茶籽粕中提取得到降血糖肽的方法，属于农产品精深加工技术领域。

背景技术

近年来，我国糖尿病人群不断增加。药物治疗是控制糖尿病的主要手段。长期以来，α- 葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素以及一些双胍类的药物是我国最常见的降血糖药物。由于这类药物存在较大的副作用或需要体外注射等原因，在降血糖的过程中也增加了病人的痛苦。因此，尝试使用食疗的方式对糖尿病进行控制和治疗成为当前的研究热点。其中，具有降血糖作用的膳食性多肽，由于其来源广泛、种类繁多等原因，使其备受关注。

茶籽粕是茶油加工中的主要副产物，不仅价格低廉，而且富含蛋白质等成分，是膳食性多肽的理想来源之一。我们的研究表明，茶籽粕多肽的混合物虽然具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但并不清楚发挥主要作用的茶籽粕多肽的具体结构。这将制约茶籽粕来源的α-葡萄糖苷酶抑制肽的作用机理研究，进而影响其在降血糖药物开发中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从茶籽粕中提取得到降血糖肽的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种从茶籽粕中提取得到的降血糖肽，包括第一种降血糖肽、第二种降血糖肽和第三种降血糖肽；所述第一种降血糖肽由以下氨基酸残基组成：甘氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-赖氨酸；所述第二种降血糖肽由以下氨基酸残基组成：甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸；所述第三种降血糖肽由以下氨基酸残基组成：苏氨酸-脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明所涉及的原料低廉且来源广泛、制备的α-葡萄糖苷酶抑制肽活性高，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明茶籽粕降血糖肽的制备流程示意图。

图2为不同分子量多肽对α-葡萄糖苷酶抑制率示意图。

图3为不同制备阶段多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

图4为三种多肽与α-葡萄糖苷酶分子对接模型图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：从茶籽粕中提取得到的降血糖肽

一种从茶籽粕中提取得到降血糖肽的方法，包括下列步骤：

(1)制备茶籽粕粉末。茶籽粕用粉碎机以10000r/min速度进行粉碎，每粉碎2min，暂停1min，累计粉碎4min后，得到的粉末过60目筛后，筛下部分即为茶籽粕粉末。

(2)制备脱脂茶籽粉末。按1：5的比例将茶籽粕粉末与正己烷混合，混合液在磁力搅拌器上搅拌3h，抽滤除去正己烷后，得到的粉末室温干燥，即为脱脂茶籽粕粉末。

(3)制备茶籽粕蛋白。脱脂茶籽粕粉末与水按质量比1：10混合后调节pH到10；混合物在50℃磁力搅拌1.5h后于8000r/min下离心15min，得到的上清液用1mol/L的HCl调节 pH到4.2，1.5h后于8000r/min下离心15min，得到的沉淀用去离子水再悬浮，经冷冻干燥后得到茶籽粕蛋白。

(4)制备茶籽粕多肽粗样。配制质量分数为3％的茶籽粕蛋白溶液，使用碱性蛋白酶酶解，按照加碱性蛋白酶9000U/g，pH11；温度55℃；磁力搅拌3h进行酶解。反应结束后调pH到7.0并在沸水浴中加热12min进行灭酶；得到溶液10000r/min下离心15min，上清液即为茶籽粕多肽粗样。

(5)茶籽粕多肽的分级。得到的茶籽粕多肽粗样，在工作压力0.15Mpa，工作温度20℃条件下，依次通过10000Da、5000Da和3000Da的超滤膜后收集到4个样品，经冷冻干燥后即为>10KD、5-10KD、3-5KD和<3KD的多肽组分。

(6)茶籽粕多肽降血糖活性。通常使用α-葡萄糖苷酶的抑制活性，表示多肽的降血糖活性。测定>10KDa的多肽组分、5-10KDa的多肽组分、3-5KDa的多肽组分和<3KDa的多肽组分的抑制率：

实验在96孔微孔板上进行，首先添加112μL磷酸缓冲液(pH6.8)。此外，添加20μL的0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，然后混合8μL的样品溶液。在37℃下孵育30分钟后，加入 20μL对硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(pNPG)(5mmol/L)引发反应，然后在37℃下孵育30分钟，然后，加入80μL0.02 mol/L Na

分别测定分级后的茶籽粕多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以抑制率表示：

抑制率计算方法如下：

其中，A代表对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、α-葡萄糖苷酶和所测多肽样品在磷酸盐缓冲液中的吸光度；A

(7)对α-葡萄糖苷酶具有最高抑制率的多肽组分进行细分级分离，将含有0.1％TFA的乙腈(0-40％，40分钟)用作洗脱液，流速设置为1mL/min，在220nm处检测洗脱峰。

经上述方法测定后，对α-葡萄糖苷酶具有最高抑制率的组分将用于α-葡萄糖苷酶抑制肽的进一步筛选。

(8)茶籽粕多肽中α-葡萄糖苷酶抑制肽的细分级分离。使用制备或半制备高效液相色谱法(HPLC)对步骤(5)中筛选的组分进行分离。根据样品特点，对HPLC分离进行优化，使样品中主要色谱峰后相互分开后，对HPLC的色谱峰进行分别连续收集，并依次编号。建立方法如下：将含有0.1％TFA的乙腈(0-40％，40分钟)用作洗脱液，流速设置为1mL/min，在220nm处检测洗脱峰。浓缩挥发有机溶剂后冷冻干燥后。使用步骤(6)中的方法，对每个冻干组分的抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行测定，筛选出抑制率最高的组分，用于鉴定具体结构的α-葡萄糖苷酶抑制肽。

(9)α-葡萄糖苷酶抑制肽结构鉴定。将步骤(8)中筛选的样品配制浓度不低于3mg/mL 的多肽溶液在12000r/min离心10min，取上清用10kDa超滤管过滤，取滤过液用C18柱进行除盐处理，除盐后的肽段溶液经离心浓缩仪(工作条件:转速2000r/min，浓缩时间2min)抽干后，冻存于-20℃等待上机检测。

质谱分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600液质联用系统进行。肽段样品通过自动进样器吸入后结合至C18捕获柱(5μm,5×0.3mm)，接着被洗脱至分析柱(75μm×150mm,3μm particle size,

进一步地，TripleTOF 5600产生的质谱数据通过ProteinPilot(V4.5)进行检索，采用的数据库检索算法是Paragon。检索使用的数据库是UniProt中Camellia的蛋白质组参考数据库。通过数据库检索比对，得到α-葡萄糖苷酶抑制肽的具体序列。

第一种降血糖肽由以下氨基酸残基组成：甘氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-谷氨酸-丝氨酸- 异亮氨酸-赖氨酸；第二种降血糖肽由以下氨基酸残基组成：甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸- 亮氨酸-天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸；第三种降血糖肽由以下氨基酸残基组成：苏氨酸- 脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸。

(8)α-葡萄糖苷酶抑制肽的作用机理。从PDB数据库中，搜寻得到α-葡萄糖苷酶的晶体结构，利用Auto-dock软件进行分子对接模拟。

步骤(2)、(3)和(4)中磁力搅拌的速度为200-400r/min；

步骤(3)、(5)和(6)中冷冻干燥的条件为：真空度50Pa，冷阱温度为-50℃，物料温度为-20℃。

实施例2：从茶籽粕中提取得到的降血糖肽

(1)制备茶籽粕粉末。茶籽粕用粉碎机以10000r/min速度进行粉碎，每粉碎2min，暂停1min，累计粉碎4min后，得到的粉末过60目筛后，得到茶籽粕粉末。

(2)制备脱脂茶籽粉末。按1：5的比例将茶籽粕粉末与正己烷混合，混合液在磁力搅拌器上搅拌3h(转速300r/min)，抽滤除去正己烷后，室温干燥得到脱脂茶籽粕粉末。

(3)制备茶籽粕蛋白。将脱脂茶籽粕粉末与水按1：10混合后调节pH到10.0；混合物在55℃磁力搅拌1.5h后于8000r/min下离心15min，得到的上清液用1mol/L HCl调节pH到4.5，该溶液搅拌1.5h后于8000r/min下离心15min，得到的沉淀经冷冻干燥后得到茶籽粕蛋白。

(4)制备茶籽粕多肽粗样。配制4％的茶籽粕蛋白溶液，使用碱性蛋白酶酶解，按照加碱性蛋白酶6000U/g，pH10.0；温度55℃，磁力搅拌2～4h进行酶解。反应结束后调pH到7.0并在沸水浴中加热15min进行灭酶；得到溶液8000r/min下离心10～20min，上清液即为降血糖肽粗样。

(5)茶籽粕多肽的分级。得到的茶籽粕降血糖多肽粗样，在工作压力0.12Mpa，工作温度25℃条件下，依次通过10000Da、5000Da和3000Da的超滤膜，收集到4个样品经冷冻干燥后，即为>10KD、5-10KD、3-5KD和<3KD的多肽组分。步骤3-5见示意图1。

(6)茶籽粕多肽降血糖活性。通常使用α-葡萄糖苷酶的抑制活性，表示多肽的降血糖活性。因此，按照以下方法，对分级后的茶籽粕多肽抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行测定，抑制活性以抑制率表示：

茶籽粕多肽抑制α-葡萄糖苷酶的活性，通过以下方法进行测定：在96微孔板上加入112μL 磷酸缓冲液(pH＝6.8)。此外，加入20μL 0.2u/mLα-葡萄糖苷酶溶液，然后混合8μL样品溶液。在37℃培养30min后，加入20μL对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，5mmol/L)进行起始反应，37℃培养30min，然后加入80μL 0.02mol/LNa

抑制率计算方法如下：

其中，A代表对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、α-葡萄糖苷酶和样品在磷酸盐缓冲液中的吸光度；A

根据本方法，本实施例中得到4个茶籽粕多肽，即>10KD、5-10KD、3-5KD和<3KD的多肽组分，其对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率分别为20.64％(6mg/mL)、33.55％(5mg/mL)、45.6％(5mg/mL)、59.16％(6mg/mL)，因此具有明显的降血糖潜力，可用于不同类别降血糖产品的开发。

(1)本发明充分考虑了水解度与水解时间的关系，最大限度的兼顾水解度与多肽生物活性。

(2)本发明操作简单，多肽得率高。

(3)超滤技术是一种以压力为推动力的膜分离技术，按照物质分子量大小将大分子与小分子分离开来，操作简便，成本低廉，同时不需要添加任何化学物质，不会因其分子变性失活。本发明采用的超滤技术，最大限度地保证了多肽的生物活性。

(4)目前，我国正在步入老龄化社会，同时，肥胖，久坐的上班族群体越来越大，糖尿病的高发病率不容忽视。生物产业发展蓬勃，茶籽粕降血糖肽的研究，为后续加工成一系列功能性食品，以及饮料或者胶囊型保健食品或药品具有重要意义与发展前景。

实施例3：从茶籽粕中提取得到的降血糖肽

一种从茶籽粕中提取得到降血糖肽的方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：将茶籽粕粉碎后得到茶籽粕粉末；

步骤2：将茶籽粕粉末与正己烷按照1：4的质量比混合，然后对混合液进行搅拌，接着抽滤除去正己烷，得到的粉末室温干燥后得到脱脂茶籽粕粉末；

步骤3：将脱脂茶籽粕粉末与水按1：7的质量比混合，然后后调节pH值到9.5，将混合物加热到45℃，然后搅拌1，接着以7000r/min离心10min，得到的上清液调节pH值到4.0，1h后以7000r/min离心14min，得到的沉淀用去离子水再悬浮，经冷冻干燥后得到茶籽粕蛋白；

步骤4：将茶籽粕蛋白分散于水中制得质量分数为2％的茶籽粕蛋白溶液，然后向所述茶籽粕蛋白溶液中添加碱性蛋白酶，在温度为50℃、pH值为9.0的条件下进行酶解，酶解结束后将反应体系的pH值调到7.0，并在沸水浴中加热10min进行灭酶；灭酶后的溶液以7000r/min 离心10min，得到的上清液即为茶籽粕多肽粗样；

步骤5：将茶籽粕多肽粗样，在工作压力0.1Mpa，工作温度0℃条件下，依次通过10KDa、 5KDa和3KDa的超滤膜后收集到4个样品，经冷冻干燥后即得到>10KDa的多肽组分、5-10KDa的多肽组分、3-5KDa的多肽组分和<3KDa的多肽组分；

步骤6：分别测定>10KDa的多肽组分、5-10KDa的多肽组分、3-5KDa的多肽组分和<3KDa 的多肽组分抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行测定；

步骤7：对最高抑制率的多肽组分进行细分级分离；细分级分离分离方法包括：使用制备高效液相色谱法或半制备高效液相色谱法对步骤6筛选得到的最高抑制率的多肽组分进行分离，将含有0.1％TFA的乙腈用作洗脱液，流速设置为1L/min，在220nm处检测洗脱峰；然后浓缩挥发有机溶剂后冷冻干燥，对每个冻干组分的抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行测定，筛选出抑制率最高的多肽组分；

步骤8：将步骤7筛选的抑制率最高的多肽组分配制成浓度大于或等于3mg/mL的多肽溶液，然后以10000r/min离心8min，取上清用10kDa超滤管过滤，取过滤液用C18柱进行除盐处理，除盐后的肽段溶液经离心浓缩仪抽干；肽段样品通过自动进样器吸入后结合至C18捕获柱，接着被洗脱至分析柱进行分离；利用两个流动相建立30分钟的分析梯度；液相的流速设置为300nL/min；质谱IDA模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描，以及随后跟着的40个MS/MS扫描；MS/MS采集的条件设置为母离子信号大于120cps，电荷数为 +2～+5；离子重复采集的排除时间设置为18s；两个流动相中流动相A:H

优选的实施方式为：步骤1中茶籽粕的含油量为3％，蛋白含量为29％；

优选的实施方式为：步骤2和步骤3中搅拌的速度为200r/min。

优选的实施方式为：步骤3、步骤5和步骤7的冷冻干燥的条件为：真空度50Pa，冷阱温度为-50℃，物料温度为-20℃。

实施例4：从茶籽粕中提取得到的降血糖肽

(1)制备茶籽粕粉末。茶籽粕用粉碎机以10000r/min速度进行粉碎，每粉碎2min，暂停1min，累计粉碎4min后，得到的粉末过60目筛后，得到茶籽粕粉末。

(2)制备脱脂茶籽粉末。按1：5的比例将茶籽粕粉末与正己烷混合，混合液在磁力搅拌器上搅拌3h(转速300r/min)，抽滤除去正己烷后，室温干燥得到脱脂茶籽粕粉末。

(3)制备茶籽粕蛋白。将脱脂茶籽粕粉末与水按1：10混合后调节pH到10.0；混合物在55℃磁力搅拌1.5h后于8000r/min下离心15min，得到的上清液用1mol/L HCl调节pH到4.5，该溶液搅拌1.5h后于8000r/min下离心15min，得到的沉淀经冷冻干燥后得到茶籽粕蛋白。

(4)制备茶籽粕多肽粗样。配制4％的茶籽粕蛋白溶液，使用碱性蛋白酶酶解，按照加碱性蛋白酶6000U/g，pH10.0；温度55℃，磁力搅拌2～4h进行酶解。反应结束后调pH到7.0并在沸水浴中加热15min进行灭酶；得到溶液8000r/min下离心10～20min，上清液即为茶籽粕多肽粗样。

(5)茶籽粕多肽中α-葡萄糖苷酶抑制肽的粗分级分离。得到的茶籽粕多肽粗样，在工作压力0.12Mpa，工作温度25℃条件下，依次通过10000Da、5000Da和3000Da的超滤膜后收集到4个样品，经冷冻干燥后即为>10KD、5-10KD、3-5KD和<3KD的多肽组分。分别测定分级后的茶籽粕多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以抑制率表示：

其中，A代表对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、α-葡萄糖苷酶和样品在磷酸盐缓冲液中的吸光度；A

根据本方法，本实施例中得到4个茶籽粕多肽，即>10KD、5-10KD、3-5KD和<3KD的多肽组分，其对α-葡萄糖苷酶的最大抑制率分别为20.64％(6mg/mL)、33.55％(5mg/mL)、45.6％(5mg/mL)、59.16％(6mg/mL)。因此，选取<3KD的多肽组分做进一步的分离。

(6)茶籽粕多肽中α-葡萄糖苷酶抑制肽的细分级分离。使用制备或半制备高效液相色谱法(HPLC)对步骤(5)中筛选的<3KD的组分进行分离。根据样品特点，对HPLC分离进行优化，使样品中主要色谱峰后相互分开后，对HPLC的色谱峰进行分别连续收集，并依次编号，浓缩挥发有机溶剂后冷冻干燥后。使用步骤(5)中的方法，对每个冻干组分的抑制α- 葡萄糖苷酶的活性进行测定，筛选出抑制率最高的组分，用于鉴定具体结构的α-葡萄糖苷酶抑制肽。

其中，样品的HPLC分离条件如下：按超纯水、TFA、乙腈体积比来配置流动相，流动相配置为A：H2O含0.1％的三氟乙酸，B乙腈含0.1％的三氟乙酸。流动相A,B均通过0.22μm滤膜过滤，Hypersil ODS C18(10×250mm,10μm)分离，流速1mL/min，在40min内流动相B上升到40％，在220nm波长下检测并收集。分离结果如图3的(a，b)所示，比较不同组分α-葡萄糖苷酶抑制率，组分D的α-葡萄与糖苷酶抑制率最好，当浓度为1mg/mL时，抑制率为45.18％±2.34％，最接近阿卡波糖在该浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制率64.46％±2.45％。收集活性最好的组分D进一步分离纯化。

重复以上步骤，使用HPLC对组分D进行再分离，其他条件与上述HPLC条件一致，进改变了流动相变化的速度，具体是：在40min内流动相B上升到40％。分离后共收集到7个组分，依次命名为D1-D7(图3的c)；冷冻干燥后，对其抑制α-葡萄糖苷酶的活性进行测定，发现组分D7的α-葡萄与糖苷酶抑制率最好(图3的d)。当浓度为0.1mg/mL时，抑制率为 52.72％±1.44％。D7组分因此用于α-葡萄与糖苷酶抑制肽的鉴定。

(7)取D7的多肽样本配制浓度不低于3mg/mL的多肽溶液在12000r/min离心10min，取上清用10kDa超滤管过滤，取滤过液用C18柱进行除盐处理，除盐后的肽段溶液经离心浓缩仪抽干后，冻存于-20℃等待上机检测。

质谱分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600液质联用系统进行。肽段样品通过自动进样器吸入后结合至C18捕获柱(5μm,5×0.3mm)，接着被洗脱至分析柱(75μm×150mm,3μm particle size,

进一步地，TripleTOF 5600产生的质谱数据通过ProteinPilot(V4.5)进行检索，采用的数据库检索算法是Paragon。检索使用的数据库是UniProt中Camellia的蛋白质组参考数据库。得到具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶籽粕多肽a(GHSLESIK),b(GLTSLDRYK)以及c (SPGYYDGR)。

(8)α-葡萄糖苷酶抑制肽的作用机理。从PDB数据库中，搜寻得到α-葡萄糖苷酶的晶体结构，利用Auto-dock软件进行分子对接模拟。对接结果如图2所示，结果表明三种多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制作用主要通过多肽与糖苷酶之间的氢键和盐桥等实现，Asp 542是α- 葡萄糖苷酶的关键靶氨基酸。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。