一种含氮芥的三联吡啶配体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药中间体及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种含氮芥的三联吡啶配体及其制备方法和应用。

背景技术

自2,2':6',2-三联吡啶被首次合成以来，三联吡啶衍生物以及三联吡啶金属配合物的研究在光物理、光化学、超分子化学、药学、材料科学和超分子化学等领域发等方面具有重要的研究价值，并受到了广泛重视。目前三联吡啶及其金属配合物的研究，主要是以设计含各种不同取代基的衍生物为基础，使得其发展实用性较强。常见的合成方法有成环法和偶联法等。三联吡啶衍生物可以与很多过渡金属离子进行配位，如Zn(II)、Co(II)、Cu(II)、Ni(II)、Fe(II)、Ru(II)、Os(II)、Ir(III)等。合成的配合物也因三联吡啶配体上的取代基不同而产生不同的抗肿瘤活性。

氮芥类药物是最早用于肿瘤治疗的药物之一，并且目前仍是临床应用的一类重要的抗肿瘤药物。其抗肿瘤机理是通过在细胞内形成缺电子的乙撑亚胺离子，进而与DNA、RNA或酶类生物大分子的富电子中心反应，产生共价结合，导致这些生物大分子丧失活性，使细胞复制受阻，从而达到抗肿瘤的目的。氮芥类抗肿瘤药主要由两部分组成，即烷基化部分和载体部分：

这些药物的临床应用主要有：淋巴瘤、多发性骨髓瘤、上皮瘤、乳腺和前列腺等肿瘤。氮芥类化合物的结构修饰主要集中在载体部分，无论是游离的还是与各种载体相连，均无结构专一性，都具有抗肿瘤作用。因此，开发新型氮芥类药物，获得不同载体与活性的构效关系，为开发高效低毒的氮芥抗肿瘤药物提供重要的理论基础。

氮芥作为一类重要的抗肿瘤药物，而三联吡啶又是金属配合物最广泛应用的配体之一，但到目前为止，氮芥与三联吡啶的偶联物极少见有报道。主要因为两者的偶联需要多步反应进行，而且反应产物的分子结构会偏大。药物在体内的吸收、分布、代谢等方面也随之发生变化，会导致复杂的药效学情况。如何用最少的反应步骤合成结构简单、同时含氮芥和三联吡啶的衍生物是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种含氮芥的三联吡啶配体及其制备方法和应用。以N,N-二(2-羟乙基)-苯胺为原料，经过Vilsmeier-Haack反应制备含氮芥的芳香醛中间体，然后进一步与2-乙酰吡啶反应制备含氮芥的三联吡啶配体L1。方法简单易行，对设备要求低，目标化合物分离提纯容易。该化合物是目前结构最简单、含芳香氮芥的三联吡啶衍生物，一方面本身具有优异的抗肿瘤效果。另一方面，可作为各种金属配合物的配体，设计各种含氮芥的三联吡啶金属配合物，具有广泛的研究开发价值。

本发明的技术方案之一，一种含氮芥的三联吡啶配体(L1)，分子式为：C

为(Ⅰ)所示结构式的化合物；

本发明的技术方案之二，上述含氮芥的三联吡啶配体的制备方法，以4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛和2-乙酰吡啶为原料在碱性条件下常温反应制得。

进一步地，具体包括以下步骤：

将4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛、2-乙酰吡啶和碱性化合物置于乙醇中，常温下反应10min，加入氨水继续反应12h，减压浓缩、过滤、所得固体提纯得含氮芥的三联吡啶配体；

其中4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛、2-乙酰吡啶和碱性化合物的摩尔比为1:2:2；氨水的体积分数为25％；

所述碱性化合物为NaOH、KOH、Na

进一步地，所述提纯为利用体积比为1:1的甲醇/二氯甲烷溶液重结晶；或者用柱层析分离，洗脱液为体积比为1:50的甲醇/二氯甲烷溶液。

进一步地，还包括4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛的制备，包括以下步骤：

以POCl

进一步地，4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛的制备具体包括以下步骤：

冰水浴环境，搅拌条件下将POCl

其中，滴加步骤中，POCl

溶解有N,N-二(2-羟乙基)-苯胺的二甲基甲酰胺溶液中N,N-二(2-羟乙基)-苯胺和二甲基甲酰胺的摩尔比为1：1；

POCl

重结晶所用溶液为体积比为1:1的乙醇/二氯甲烷混合溶液或者乙醇。

本发明的技术方案之三，上述含氮芥的三联吡啶配体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，以所述含氮芥的三联吡啶配体为中间体，制备含有含氮芥的三联吡啶配体的金属配合物。

进一步地，所述含氮芥的三联吡啶配体用于制备抑制肿瘤细胞MDA-MB-231、A549、786-O或SIHA生长的药物。

本发明的技术方案之四，一种抗肿瘤药物，药物活性成分为(Ⅰ)所示结构式的化合物或者其在药学上可接受的盐；

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明涉及一种含氮芥的三联吡啶配体的设计、合成及其在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及一种4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2':6',2-三联吡啶在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明以N-苯基二乙醇胺为原料，先后与Vilsmerier试剂、乙酰吡啶反应，仅仅通过两步反应便设计并合成了一种目前结构最简单、含芳香氮芥的三联吡啶配体，可用于抗肿瘤药物的化合物(含氮芥的三联吡啶配体)。细胞毒性实验验证了该化合物具有抗肿瘤活性，对肿瘤细胞生长的抑制能力较强。细胞形态表明细胞变圆或肿胀，贴壁能力变差，突起回缩或消失，胞体折光性差。细胞划痕实验表明该药物削弱了细胞伤口愈合的能力。细胞迁移实验表明细胞迁移能力明显减弱。细胞克隆形成实验表明药物显著抑制细胞的生长。免疫印迹试验(Western blot)进一步表明了该化合物导致细胞周期阻滞。

本发明提供了一种新的、优势突出的药用化合物；制备本发明新化合物的操作步骤少，副反应少，原料易得，溶剂绿色环保和产物易于分离提纯。该药物本身具有良好的抗肿瘤活性。

本发明方法简单易行，对设备要求低，目标化合物分离提纯容易。该化合物结构上具有良好的对称性，是目前结构最简单、含芳香氮芥的三联吡啶衍生物。可作为各种金属离子的配体，设计各种含氮芥的金属配合物。体外抗肿瘤实验表明该化合物具有优异的的抗肿瘤效果，能有效抑制肿瘤细胞的生长、迁移、爬行和克隆等特点在抗肿瘤药物领域具有广泛的研究开发价值。

附图说明

图1为本发明实施例1步骤1制备产物的核磁氢谱图；

图2为本发明实施例1步骤1制备产物的质谱图；

图3为本发明实施例1步骤2制备产物的核磁氢谱图；

图4为本发明实施例1步骤2制备产物的核磁碳谱图；

图5为本发明实施例1步骤2制备产物的质谱图；

图6为本发明效果验证1中MDA-MB-231细胞毒性实验结果图；

图7为本发明效果验证1中SIHA细胞毒性实验结果图；

图8为本发明效果验证1中786-O细胞毒性实验结果图；

图9为本发明效果验证1中A549细胞毒性实验结果图；

图10为本发明效果验证2中A549细胞经化合物L1孵育后的倒置显微镜观察细胞形态图；

图11为本发明效果验证3中A549细胞经化合物L1孵育后的细胞划痕实验结果图；其中图A为倒置荧光显微镜下拍摄划痕区细胞的迁移情况图，B为对应数据图；

图12为本发明效果验证4中A549细胞经化合物L1孵育后的Transwell细胞迁移实验结果图；其中图A为倒置荧光显微镜下拍摄Transwell细胞迁移图，B为对应数据图；

图13为本发明效果验证5中A549细胞经化合物L1孵育后的克隆实验结果图；其中图A为拍照图，B为对应数据图；

图14为本发明效果验证6中A549细胞经化合物L1孵育后的泳道蛋白的表达图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

采取以下合成工艺路线来制备4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2':6',2-三联吡啶(化合物L1)：

步骤1.

4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛的合成：

向圆底烧瓶中加入干燥的DMF 102.2mmol(7.46g),于冰水浴中边搅拌边缓慢滴加POCl

步骤2.

4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2':6',2-三联吡啶(化合物L1)合成

将10mmol的4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛(1.23g)、20mmol的2-乙酰吡啶(1.21g)和20mmol的NaOH(0.80g)加入到80ml乙醇中，室温下反应10min，接着加入15mL 25％的氨水，反应12小时。通过减压浓缩将溶剂浓缩到原来的1/3，过滤，滤饼用水/乙醇(v:v＝1:1)洗两次，烘干，然后用甲醇/二氯甲烷(v:v＝1:1)重结晶，得浅黄色固体，产率42％。

图3为制备产物的核磁氢谱图，图4为制备产物的核磁碳谱图，图5为制备产物的核磁质谱图；图3-5得出以下信息：

效果验证1

用于测定细胞活性的一种高灵敏度比色检测法。待肿瘤细胞(MDA-MB-231、A549、786-O和SIHA)处于对数生长期时，在96孔培养皿中种入约2×10

MDA-MB-231细胞毒性实验结果见表1和图6；

SIHA细胞毒性实验结果见表2和图7；

786-O细胞毒性实验结果见表3和图8；

A549细胞毒性实验结果见表4和图9。

表1 MDA-MB-231细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

表2 SIHA细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

表3 786-O细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

表4 A549细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

从表1-4以及图6-9中可以看出，随着化合物L1浓度的增加，其对MDA-MB-231、SIHA、786-O和A549肿瘤细胞的增殖的抑制能力不断增加。其中，对MDA-MB-231、786-O和A549三种细胞的半抑制浓度(IC

效果验证2细胞形态

待肿瘤细胞(A549)处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×10

由图10可见，经过化合物L1孵育后，细胞变圆或肿胀，贴壁能力变差，突起回缩或消失，胞体折光性差。并且随着浓度增加，效果越明显。

效果验证3细胞划痕实验

模拟体外细胞伤口愈合的实验模型，用于检测贴壁生长肿瘤细胞(A549)的迁移及对划痕区修复能力。待肿瘤细胞处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×10

从图中可以看出，经过8h的爬行，A549细胞空白组表现出较强的迁移能力，而加药组则明显抑制细胞的迁移和爬行，并随着浓度增加，抑制能力增加，表明化合物L1能有效抑制细胞的迁移。

表5A549细胞划痕实验结果(Wound width/％)

效果验证4Transwell细胞迁移

检测体外细胞迁移运动的实验模型。待肿瘤细胞(A549)处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×10

表6不同浓度下的A549细胞的迁移细胞数

从图中可以看出，随着化合物L1浓度的增加，转移到transwell板上室下表面的细胞逐渐减少，浓度为10μM时，迁移细胞数不到对照组的1/10，这表明化合物L1可通过降低肿瘤细胞的转移能力来发挥抗肿瘤作用。

效果验证5克隆形成实验

将处于对数生长期细胞传代之后种于六孔板中。待细胞贴壁后加入5μM的苯丁酸氮芥(CLB)或L1药物孵育48h，并设置空白实验。弃去培养基，用PBS洗去多余的培养基，用胰酶消化细胞，将各组细胞以800个/孔种于6孔板中，加入培养基孵育10-14天。弃去培养基，用PBS洗2次洗去多余的培养基，用甲醇室温固定30分钟，PBS洗去多余甲醇，再用结晶紫染液(1mM)染色10分钟，PBS洗去多余染液，拍照，结果见图13A，对应的数据见表7和图13B。

表7不同药物处理组的A549细胞克隆形成数

从图中可以看出，当浓度为5μM时，苯丁酸氮芥(CLB)处理的细胞克隆数为102±6.5，而化合物L1处理的细胞克隆数已为零。说明化合物L1对A549细胞具有较强的抗增殖作用。

效果验证6 Western blot

又称蛋白质印迹法，通过半定量的方法检测细胞内蛋白含量的变化。待肿瘤细胞(A549)处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。