一种基于混合抗体的胶体金法快速诊断新型冠状病毒抗原的检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种试剂盒，具体来说是一种基于混合抗体的采用胶体金法快速诊断新型冠状病毒抗原的检测试剂盒。

背景技术

2019新型冠状病毒(COVID-19)，因2019年发生病毒性肺炎病例而被发现，2020年1月12日被世界卫生组织命名。和中东呼吸综合征病毒(MERS)以及严重急性呼吸综合征病毒(SARS)都属于β冠状病毒，属于人畜共患病原体，可引起动物与人之间的感染，也可引起人与人之间的感染。COVID-19含有棘突(S)蛋白、膜(M)蛋白、和核衣壳(N)蛋白等标志性蛋白。为了防止病毒的扩散和获得有效的治疗，针对病毒快速准确的诊断就显得尤为重要。

目前针对新型冠状病毒的检测方法主要有核酸检测、抗体检测和抗原检测。核酸检测，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，是确诊新冠肺炎的“金标准”，但对样本的处理和运输需要实施一整套非常严格的流程，对检测设备、场地及操作人员都有极高的要求，且检测用时长，因此具有一定的局限性；抗体检测，虽然具有方便快捷、检测用时短，可以弥补核酸检测出现假阴性而造成漏诊的缺点。但又常常由于个别患者血液中含有类风湿因子、自身抗体或肿瘤细胞等因素而易出现假阳性，以及由于人在感染新冠病毒后需要两周左右才能产生抗体，故此检测方法存在一定的漏检窗口期；抗原检测，具有诊断快速、准确、对设备和人员要求低，因此可应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等基层的早期初步筛查。但由于新型冠状病毒主要侵犯肺泡等下呼吸道，所以往往从鼻咽、口咽等上呼吸道的取样中所含病毒数量较少，而目前市场上存在的抗原检测试剂盒通常采用单一抗原特异性抗体作为检测试剂，因此容易出现对样本中的抗原（病毒蛋白）敏感性不够而造成漏检，从而出现假阴性。

因此，亟需一种更加方便快捷、准确有效的诊断新型冠状病毒抗原检测试剂盒用于早期的筛查诊断。

发明内容

针对现有技术中出现的种种问题，本发明提供了一种基于混合抗体的胶体金法快速诊断新型冠状病毒抗原的检测试剂盒，从而成功地解决了现有技术检测新型冠状病毒时间长、准确度不高的技术问题。

本发明提供的这种准确灵敏基于混合抗体快速诊断新型冠状病毒抗原的检测试剂盒，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上，所述的样品垫的一端和所述的结合垫的一端紧密连接，所述的结合垫的另外一端和所述的包被膜的一端紧密连接，所述的包被膜的另外一端和所述的吸收垫的一端紧密连接；

所述的结合垫上负载有1.2-1.8μg/cm

所述的包被膜设有检测线（T线）和质控线（C线），检测线负载有2.0-2.5μg/cm

所述的质控线负载有1.2-1.8μg/cm

进一步的，所述的包被膜为硝酸纤维素膜。

进一步的，所述的抗新型冠状病毒N蛋白抗体I为兔单克隆抗体，所述的抗新型冠状病毒S蛋白抗体I为人鼠嵌合单克隆抗体I；所述的抗新型冠状病毒N蛋白抗体II为鼠单克隆抗体，所述的抗新型冠状病毒S蛋白抗体II为人鼠嵌合单克隆抗体II；所述的重组IgG Fc蛋白I为重组兔IgG Fc蛋白，所述的重组IgG Fc蛋白II为重组人IgG Fc蛋白。

本发明的工作原理是：当适量的待测样本加入到试剂盒的样本孔（样品垫）中，该样本将在层析作用下沿着试剂盒向前移动，如果样本中含有新型冠状病毒，则该新型冠状病毒的N蛋白和/或S蛋白首先与胶体金标记的混合捕获抗体中的抗新型冠状病毒N蛋白抗体I和/或抗新型冠状病毒S蛋白抗体I结合形成免疫复合物。样本继续向前移动到达检测线位置，则该免疫复合物会被检测线（T线）上预先包被的混合检测抗体中的抗新型冠状病毒N蛋白抗体II和/或抗新型冠状病毒S蛋白抗体II捕获，从而在检测线（T线）处形成免疫夹心复合物并出现一条肉眼可见的红色线条，表示新型冠状病毒抗原阳性；冗余的胶体金抗原结合物继续流向质控线（C线），被质控线（C线）上预先包被的混合重组蛋白捕获，固定在C线上并出现一条肉眼可见的红色线条，表示本次检测结果有效；如果质控线（C线）上未出现红色线条，则表示本次检测结果无效，此样本需用另一检测试剂盒重新进行检测。

具体的，所述的抗新型冠状病毒N蛋白抗体I和抗新型冠状病毒N蛋白抗体II为一对可以同时结合新型冠状病毒N蛋白的配对抗体，分别购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号分别为40143-R004 （Anti-Coronavirus Nucleocapsid Antibody, 40143-R004 |Sino Biological https://cn.sinobiological.com/antibodies/cov-nucleocapsid-40143-r004）和40143-MM08（Anti-Coronavirus Nucleocapsid Antibody, 40143-MM08 |Sino Biological https://cn.sinobiological.com/antibodies/cov-nucleocapsid-40143-mm08）；所述的抗新型冠状病毒S蛋白抗体I和抗新型冠状病毒S蛋白抗体II为一对可以同时结合新型冠状病毒S蛋白的受体结合结构域（RBD）的特异性配对抗体，分别购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号分别为40150-D003（Anti-Coronavirus spikeAntibody, 40150-D003 | Sino Biological https://cn.sinobiological.com/antibodies/cov-spike-40150-d003）和40150-D001（Anti-Coronavirus spikeNeutralizing Antibody ChimeraMAb , 40150-D001 | Sino Biological https://cn.sinobiological.com/antibodies/cov-spike-40150-d001）；所述的质控线上的重组IgG Fc蛋白I和重组IgG Fc蛋白II分别购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号分别为11047-TNAH（Recombinant Rabbit IgG Protein, HEK293 Cells, 11047-TNAH | SinoBiological https://cn.sinobiological.com/recombinant-proteins/rabbit-igg-11047-tnah）和10702-HNAH（Recombinant Human IgG1 Protein, HEK293 Cells, 10702-HNAH | Sino Biological https://cn.sinobiological.com/recombinant-proteins/human-igg1-10702-hnah）。

本发明由发明人通过大量的条件摸索和筛选，最终确定了制备所述的胶体金标记混合抗体、检测线混合抗体和质控线混合蛋白所需的最佳的原料组合及其混合配比比例，利用胶体金抗体夹心法原理，检测结果快速准确，特异性强，灵敏度高，显著提高新型冠状肺炎的检出率，有效降低了漏检率。本发明填补了免疫学高效检测新型冠状病毒的空白，其快速性及简易操作性尤其适用于海关机场等交通枢纽、酒店医院及其他人群聚集地，从而及早预防疫情扩散。

附图说明

图1显示了本发明试剂盒的具体操作流程。

图2显示了本发明检测试剂盒检测时的判读显色标准。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，未标注具体采购公司的均为市售产品。

实施例1

本发明提供了一种准确灵敏基于混合抗体快速诊断新型冠状病毒抗原的检测试剂盒，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上，所述的样品垫的一端和所述的结合垫的一端紧密连接，所述的结合垫的另外一端和所述的包被膜的一端紧密连接，所述的包被膜的另外一端和所述的吸收垫的一端紧密连接；

所述的结合垫上负载有1.2-1.8μg/cm

所述的包被膜设有检测线（T线）和质控线（C线），检测线负载有2.0-2.5μg/cm

所述的质控线负载有1.2-1.8μg/cm

进一步的，所述的包被膜为硝酸纤维素膜。

进一步的，所述的抗新型冠状病毒N蛋白抗体I为兔单克隆抗体，所述的抗新型冠状病毒S蛋白抗体I为人鼠嵌合单克隆抗体I；所述的抗新型冠状病毒N蛋白抗体II为鼠单克隆抗体，所述的抗新型冠状病毒S蛋白抗体II为人鼠嵌合单克隆抗体II；所述的重组IgG Fc蛋白I为重组兔IgG Fc蛋白，所述的重组IgG Fc蛋白II为重组人IgG Fc蛋白。

本发明的工作原理是：当适量的待测样本加入到试剂盒的样本孔（样品垫）中，该样本将在层析作用下沿着试剂盒向前移动，如果样本中含有新型冠状病毒，则该新型冠状病毒的N蛋白和/或S蛋白首先与胶体金标记的混合捕获抗体中的抗新型冠状病毒N蛋白抗体I和/或抗新型冠状病毒S蛋白抗体I结合形成免疫复合物。样本继续向前移动到达检测线位置，则该免疫复合物会被检测线（T线）上预先包被的混合检测抗体中的抗新型冠状病毒N蛋白抗体II和/或抗新型冠状病毒S蛋白抗体II捕获，从而在检测线（T线）处形成免疫夹心复合物并出现一条肉眼可见的红色线条，表示新型冠状病毒抗原阳性；冗余的胶体金抗原结合物继续流向质控线（C线），被质控线（C线）上预先包被的混合重组蛋白捕获，固定在C线上并出现一条肉眼可见的红色线条，表示本次检测结果有效；如果质控线（C线）上未出现红色线条，则表示本次检测结果无效，此样本需用另一检测试剂盒重新进行检测。

实施例2

1、待测样本的采集

样本收集后应尽快采用样本抽提液进行处理，若不能立即检测，样本应密封储存，放置于2～8°C储存。

2、鼻拭子的采集方法

将10滴样品提取裂解液(约0.3 ml)加入提取管中，置于管架上。将拭子完全插入鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集黏膜表皮。将拭子插入提取缓冲液中，并掰断拭子，盖紧滴头。

3、咽拭子的采集方法

将10滴样品提取裂解液(约0.3 ml)加入提取管中，置于管架上。将拭子完全插入咽后部，扁桃体和其他发炎区域, 摩擦鼻甲数次，采集黏膜表皮。将拭子插入提取缓冲液中，并掰断拭子，盖紧滴头。

样本处理上的注意点：1）采集的祥本应尽早按下述调制方法进行样品处理；2）因去除细胞成分会降低灵放度，所以在进行本测试前，不要离心分离；3）所有的样本都是有传染危险的。请在处理时小心注意；4）收集的样本若长时间储存可加入0.1%丙内酯1ul，在常温保持4小时进行灭活处理。

适用样本保存液：1）此产品不适用于含有胍盐（VTM/UTM）配置的病毒保存液检测；此产品不适用于含有β巯基乙醇配置的病毒保存液检测；此产品适用于含有普通的病毒保存液检测。

4、本发明试剂盒的具体操作方法如图1所示；

步骤1：如果样本冷藏或者冷冻储存，需将待测样本及所需试剂从储存条件下取出，平衡至室温（15～30 ℃）。融化后，在测试前将样本充分混匀。

步骤2：准备检测时，从撕口处打开铝箔袋。将本试剂盒取出，平放于水平桌面上。

步骤3：在检测试剂盒上标注样本号。

步骤4：加入10滴缓冲液(约0.3 ml)到提取管中。

步骤5：将无菌拭子样本放入缓冲液中。旋转拭子约10秒钟，同时将拭子头部靠提样管内壁按压，以释放拭子中的抗原。

步骤6：掰断拭子，按照生物危害废物处理规程丢弃无菌拭子杆部。

步骤7：将瓶盖旋紧至提样管上，用力摇动提样管，使样本与缓冲液充分混合。

步骤8：加入3滴溶液(约80ul)到样品孔中，然后开始计时。在10~20分钟判读结果。不要在20分钟后判读结果。

注意事项：请勿在20分钟以后判读结果。观察并记录结果后，请将检测卡丢弃，以免混淆结果判断。若需长久保存，请将结果拍照。

图2为本发明检测试剂盒检测时的判读显色标准。

阳性（Positive）: 如果质控线C和检测线T都出现1条荧光线，说明检测到新型冠状病毒，结果为新型冠状病毒阳性。

阴性（Negative）: 如果仅出现质控线C出现荧光线，检测线T不出现荧光线，说明没有检测到新型冠状病毒或新型冠状病毒浓度在产品检测限以下，结果为阴性。

无效（Invalid）: 如果质控线C未能观察到荧光线，则无论检测线T是否有检测线显示，均为无效，应重新进行检测。

注意: 根据病毒浓度不同，所产生的线条的荧光强度也会存在深浅区别，只要对应区域出现条带，无论深浅，都可判断为阳性。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，这些变化、修改、替换和变型也应视为本发明的权利保护范围。