一种基于ddPCR技术定量检测鹌鹑源性成分的方法

技术领域

本发明涉及一种基于ddPCR技术定量检测鹌鹑源性成分的方法，属于分子生物学分析领域。

背景技术

鹌鹑，又名家鹌鹑、家雁，是我国常见的饲养禽类之一。鹌鹑肉味道鲜美、营养价值高，作为优质的全价蛋白质，脂肪率低，富含人体生长发育所必需的各种氨基酸，易被人体消化吸收。鹌鹑被誉为“动物人参”，李时珍的《本草纲目》中曾指出，鹌鹑肉和蛋有益中补气、补五脏、状筋骨、耐寒暑、消热结之功效，因此倍受消费者的欢迎。市场上利用剥皮后的小鸡、麻雀或乳鸽等冒充鹌鹑肉的现象时有发生，掺假事件屡禁不止。目前鉴别各类动物源性的标准方法通常都基于普通PCR技术或荧光PCR技术，仅能对样品中的目标动物源性成分作定性检测，无法精确定量，这种技术的局限性对市场的监管形成了一定的阻碍。因此食品中动物源性检测新技术的研究，动物源性成分定量检测新方法的开发，迫在眉睫。

微滴式数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）检测技术是新型的核酸定量检测技术。ddPCR原理在于进行PCR反应前将PCR反应体系微滴化，将其中混合的模板DNA分散在约两万个微滴中，绝大部分微滴中仅存在1个模板DNA分子，PCR扩增程序结束后读取荧光信号，统计出体系中的模板DNA分子数。该方法对靶DNA可以实现定量分析，对于DNA含量浓度低的样品，也能够实现其DNA拷贝数的绝对定量，具有高度灵敏性和准确性。目前针对ddPCR技术的应用研究主要集中在致病菌检测和转基因食品检测等领域，食品中动物源性定量鉴定才刚刚起步。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于ddPCR检测鹌鹑源性成分含量的方法，采用真空冷冻干燥法处理样品减小水分含量对鹌鹑源性成分定量的干扰，同时提高样品均匀性；使用特异性荧光探针及引物对，通过构建鹌鹑源性物质浓度与目标DNA拷贝数之间的线性关系，实现鹌鹑源性成分实际质量与目标DNA拷贝数间的一步转化，精简了定量过程，使鹌鹑源成分定量检测更加准确快速。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种基于ddPCR检测鹌鹑源性成分含量的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）将待测样本进行预处理并稀释至5~1000 μg/mg后，提取DNA；

（2）通过ddPCR检测步骤（1）中DNA的拷贝数；

（3）根据标准曲线，确定步骤（1）中待测样本中鹌鹑肉源性成分物质含量；

步骤（2）中所述ddPCR的反应体系中含有扩增鹌鹑源性的上游引物、下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：

探针：5’-AGCAGCCAACACAGCACCCA-3’；

上游引物：5’-ACAGCAACGTTCTTCAGCTC-3’；

下游引物：5’-CTGGGAGCGCTTGCTTTATT-3’；

所述探针的5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰；其中，FAM表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团。

在一种实施方式中，上述方法步骤（3）中所述的标准曲线的制备方法为：将鹌鹑肉样本预处理，称取鹌鹑肉样本的质量，提取鹌鹑肉样本中的DNA，ddPCR测定DNA的拷贝数，建立鹌鹑源性成分物质含量和DNA的拷贝数的线性关系，得到标准曲线。

在一种实施方式中，所述制备标准曲线的具体步骤为：取10 mg鹌鹑肉干粉加入裂解液（DNA提取试剂盒中所含）200 μL得到混合液，使用裂解液按比例稀释混合液，得到含量为1000、500、200、100、50、10、5、1 μg/mg的稀释液，各加入蛋白酶K 20 μL，60℃恒温消化2h后，提取DNA。

在一种实施方式中，所述标准曲线为Gn= 2.85C + 37.915，其中Gn为样品的DNA的拷贝数，C为鹌鹑源性成分物质含量。

在一种实施方式中，所述预处理为将鹌鹑肉样本或待测样本分割成约1 cm×1 cm×1 cm小块试样，使用真空冷冻干燥技术，在真空度0.090~0.100 mbar，温度-60~-55℃对样本干燥48~72 h；冻干后样本经组织研磨仪打磨成粉末状样品，确保样本的均匀性。

在一种实施方式中，所述ddPCR的反应体系中，总体系为20 μL，包括：ddPCR Supermix for Probes 10 μL，探针0.5 μL，上游引物、下游引物各1.8 μL，DNA 1 μL，ddH

在一种实施方式中，所述上游引物、下游引物和探针的初始浓度为10 μmol/L。

在一种实施方式中，所述ddPCR的反应体系为20 μL，包括：1 μL DNA提取液作为模板，加入终浓度为900 nmol/L的上游引物和下游引物，终浓度为250 nmol/L的探针及10 μLddPCR Super mix for Probes，ddH

在一种实施方式中，所述ddPCR的扩增程序为：95℃ 10 min，94℃ 30 s，60℃ 1min，40个循环，98℃ 10 min。

本发明还提供一种鹌鹑源性的检测试剂盒，该检测试剂盒含有以下试剂：扩增鹌鹑源性成分的上游引物、下游引物和探针。

在一种实施方式中，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所述：

探针：5’-AGCAGCCAACACAGCACCCA-3’；

上游引物：5’-ACAGCAACGTTCTTCAGCTC-3’；

下游引物：5’-CTGGGAGCGCTTGCTTTATT-3’。

在一种实施方式中，探针的5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰；其中，FAM表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒的反应体系如下：1 μL DNA提取液作为模板，加入上游引物、下游引物和探针及10 μL ddPCR Super mix for Probes，ddH

在一种实施方式中，所述检测试剂盒的反应体系如下：ddPCR Super mix forProbes 10 μL，浓度为10 μmol/L的探针0.5 μL、浓度为10 μmol/L上游引物、下游引物各1.8 μL，模板DNA 1 μL，ddH

在一种实施方式在，所述检测试剂盒在微滴式数字PCR上的的扩增程序为：95℃10 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，40个循环，98℃ 10 min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

利用本发明检测鹌鹑源性成分，经样品前处理，能够对复杂成分样品中的鹌鹑源性成分进行定量检测，具有良好重复性和稳定性，可以通过目标DNA拷贝数对照标准曲线，直接得到样品中鹌鹑源性成分的实际质量，无需内参或对照基因扩增，测定过程方便快捷。设计的ddPCR引物与探针具有较好的特异性和灵敏度，定量限和检出限分别为5 μg/mg和1μg/mg。

附图说明

图1 特异性检测结果。

图2 样品含量（μg/mg）与目标DNA拷贝数（copies/μL）间的线性关系。

图3 样品中鹌鹑源性成分ddPCR扩增结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：引物探针的设计

引物、探针由南京金斯瑞公司合成。

针对鹌鹑细胞核基因组中的单拷贝基因设计，具体的探针及引物序列如下：

探针：5’-AGCAGCCAACACAGCACCCA-3’，SEQ ID NO.1；

上游引物：5’-ACAGCAACGTTCTTCAGCTC-3’，SEQ ID NO.2；

下游引物：5’-CTGGGAGCGCTTGCTTTATT-3’，SEQ ID NO.3；

其中探针的5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰；其中，FAM表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团。

本发明采用荧光探针法，其检测原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。与现有技术中SYBR染料法相比，本发明荧光标记特异性探针的特异性更强，背景干扰更低。

实施例2：引物探针的特异性验证

（1）样品：鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉、羊肉、牛肉和猪肉样品来自于南京本地农贸市场。

（2）试剂及仪器：DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。Premix ExTaq（Takara，日本)；美国Bio-Rad和CFX96 Touch荧光PCR仪。

（3）特异性验证：分别提取鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、羊肉、牛肉和猪肉的DNA为模板，应用实施例1中的引物探针进行QPCR扩增，每个样品做三个重复，同时以ddH

扩增反应体系：Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，探针1 μL，模板1μL，ddH

反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。

结果如图1显示，含有鹌鹑DNA模板的反应体系中扩增曲线明显，且三条扩增曲线的重复性较好，含有其他样品DNA模板的反应体系以及空白对照组均无扩增曲线。说明本发明中设计的鹌鹑源性引物与探针具有特异性，较好的重现性，与其他常见肉类的DNA无交叉反应。

实施例3：鹌鹑源性ddPCR定量检测标曲设计及线性范围验证

（1）样品：鹌鹑肉样品来自于南京本地农贸市场。将鹌鹑肉样品分割成约1 cm×1cm×1 cm小块试样使用真空冷冻干燥技术，在真空度0.100 mbar以下，温度-60℃对样品进行干燥48~72 h，减少水分含量对样品中鹌鹑源性成分浓度的影响。冻干后样品经组织研磨仪打磨成粉末状样品，确保样品的均匀性，避免因样品不均匀对定量结果造成的误差。

（2）试剂及仪器：DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。ddPCR扩增预混液ddPCR Super mix for Probes（Bio-Rad，USA)；美国Bio-Rad的QX200微滴式数字PCR系统和CFX96 Touch荧光PCR仪。

（3）鹌鹑源性浓度梯度：10 mg鹌鹑肉干粉加入GA裂解液（DNA提取试剂盒中所含）200 μL得到混合液，使用裂解液按比例稀释混合液，得到鹌鹑肉含量为1000、500、200、100、50、10、5、1μg/mg的稀释液，各加入蛋白酶K 20 μL，60℃恒温消化2 h后，提取DNA。

（4）扩增反应体系及扩增程序：应用实施例1中的引物探针进行ddPCR扩增，扩增反应体系为：上、下游引物各1.8 μL（终浓度900 nmol/L），探针0.5 μL（终浓度250 nmol/L），ddPCR Super mix for Probes 10 μL，DNA模板1 μL，加ddH

使用微滴生成器生成微滴，再利用ddPCR仪进行扩增。

ddPCR反应条件为：95℃ 10 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，40个循环，98℃ 10 min后，4℃保存。

进行ddPCR反应，每个梯度做三次平行检测。ddPCR仪正常生成微滴，所有反应产生的微滴数均大于10000。

表1 线性范围

ddPCR产生的阳性液滴数目随着鹌鹑源性含量降低而降低（图3）。统计结果显示，鹌鹑源性浓度梯度在5~1000 μg/mg范围内，鹌鹑源性物质含量与目标DNA拷贝数间存在线性关系，以鹌鹑源性物质浓度为横坐标，各浓度点的目标DNA拷贝数的平均值为纵坐标，绘制标准曲线：Gn= 2.85C + 37.915，其中Gn为样品的目标DNA拷贝数，C为鹌鹑源性成分物质含量，相关系数（R

样品中鹌鹑源性含量较高时，相对标准偏差小，定量结果稳定；随着鹌鹑源性浓度降低，相对标准偏差变大，难以进行定量。

结合相关标准规定，当检出率≥95%时为最低检出限，当相对标准偏差RSD≤25%时为定量低限。该方法的定量低限和最低检出限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。

实施例4：人工混合系列样品检测

（1）样品：鹌鹑肉、鸡肉样品来自于南京本地农贸市场。

（2）试剂及仪器：DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。ddPCR扩增预混液ddPCR Super mix for Probes（Bio-Rad，USA)；美国Bio-Rad的QX200微滴式数字PCR系统和CFX96 Touch荧光PCR仪。

（3）人工混合样品系列：在鸡肉样品中分别加入不同量鹌鹑肉样品，制得鹌鹑肉比例为80%、50%、20%、10%、1%的混合样品，每份混合样品50 g，真空冻干后制成均匀粉末，各取10 mg混合样品提取DNA进行ddPCR检测，根据实施例3得到的标准曲线计算出混合样品中鹌鹑肉的含量。

（4）扩增反应体系及扩增程序：应用实施例1中的引物探针进行ddPCR扩增，扩增反应体系为：上、下游引物各1.8 μL（900 nmol/L），探针0.5 μL（250 nmol/L），ddPCR Supermix for Probes 10 μL，DNA模板1 μL，加ddH

使用微滴生成器生成微滴，再利用ddPCR仪进行扩增。

ddPCR反应条件为：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环，98 ℃ 10min后，4 ℃保存。

表2 鸡肉中鹌鹑肉占比

人工掺假混合系列样品测试结果对5份已知质量分数的混合样品检测结果显示，三次重复实验的RSD值均小于25%适合定量检测。本发明的ddPCR检测方法在鹌鹑源性成分在待测样品中含量高于1%的情况下具有较高准确性，检测结果与实际质量分数相比，回收率保持在82%~104.06%，能够满足混合样品中鹌鹑源性成分定量检测的需要。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京市食品药品监督检验院

<120> 一种基于ddPCR技术定量检测鹌鹑源性成分的方法

<130> BAA210356A

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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