一种凝集素的灭活方法及应用

技术领域

本发明涉及凝集素处理领域，特别涉及一种凝集素的灭活方法及其应用。

背景技术

凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。常用的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A(Conconvalina，ConA)、麦胚素(Wheat germ agglutinin，WGA)、花生凝集素(Peanut agglutinin，PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin，SBA)等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，它们之所以被收入本书，是由于凝集素具有的某些“亲合”特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。因此，Ponder(1983)提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种凝集素的灭活方法及其应用，

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种凝集素的灭活方法，具体为：采用121℃进行15min处理以灭活凝集素。

进一步的，所述凝集素为辣木凝集素。

进一步的，所述方法中凝集素的分子量包括但不限于55kd，35kd， 26kd，14kd，10kd。

进一步的，所述方法灭活效率达到90％以上。

进一步的，所述方法灭活后的凝集素不再具有凝血活性，不能继续增加肠道通透性；一定程度上削弱了辣木叶过敏效应，使用高温高压对辣木凝集素进行灭活对过敏预防具有一定的正向作用。

基于上述方法应用，具体为：

通过灭活辣木凝集素的方式减少过敏风险的加工工艺，通过高温与酸、碱、盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶以及高温，微波、辐射处理联合的方式灭活凝集素的方式；

进一步的，所述应用用于辣木食品加工工艺中控制过敏原；对于有目的预防和消除过敏提供技术支持。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

通过本发明实验可以确定121℃15min处理可以最大程度的对辣木凝集素进行灭活，其次使用蛋白酶对凝集素进行处理可消除一部分凝集素活性，但是当其余的辣木蛋白组分存在时，效果不明显。

与其他灭活方法比较具有如下优势，1、简单易行；2、透析后活性不恢复；3、在有其他蛋白成分存在时效果优于酶解；

通过以上实验可以确定最佳的灭活方式为121℃15分钟。可灭活凝集素90％以上。

经过灭活后的凝集素不再具有凝血活性，不能继续增加肠道通透性。一定程度上削弱了辣木叶过敏效应，使用高温高压对辣木凝集素进行灭活对过敏预防具有一定的正向作用。

通过灭活辣木凝集素的方式减少过敏风险的加工工艺，通过高温与酸、碱、盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶以及高温，微波、辐射处理联合的方式灭活凝集素的方式；

可用于辣木食品加工工艺中控制过敏原。对于有目的预防和消除过敏提供技术支持。

附图说明

图1辣木叶粗蛋白在强阴离子交换柱的分离图；

图2电泳鉴定分离效果图；

图3辣木粗蛋白提取34kd、16kd、10kd的凝集素纯化方法图；

图4辣木粗蛋白精制34、16kd、10kd凝集素的鉴定图；

图5辣木凝集素可以促进70KD葡聚糖-FITC荧光素入血；

图6辣木过敏小鼠肠道形态学变化，有明显的水肿，且绒毛变短，说明辣木凝集素作用下辣木叶更容易过敏；

图7辣木过敏小鼠肠道肥大细胞分布变化，说明辣木凝集素作用下辣木叶更容易引发肥大细胞脱粒从而引发过敏；

图8不同理化处理对辣木凝集素血凝活性的影响；

图9透析后化学处理的灭活方式失效，但高温灭活效力未发生变化；

图10高温灭活后的凝集素不再具有增加肠道通透性的特征；

图11血清中细胞因子变化，可见经过灭活后的辣木叶失去了绝大多数过敏活性，证明灭活凝集素的方式可避免辣木过敏；

图12血清中过敏特征抗体变化，可见经过灭活后的辣木叶失去了绝大多数过敏活性，证明灭活凝集素的方式可避免辣木过敏；

图13模型小鼠变化，可见经过灭活后的辣木叶失去了绝大多数过敏活性，证明灭活凝集素的方式可避免辣木过敏。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

如图1所示，

一种凝集素的灭活方法及其应用

本专利公开的凝集素是指通过纯化以及蛋白分析可知凝集素包括但不限于以下分子量：55kd，35kd，26kd，14kd，10kd。见图1-4；

通过血凝成分可知以上组分均有凝集红血球的活性；见表1；

通过研究我们得知凝集素具有促进哺乳动物(小鼠)肠道通透性的活性，通过与4kd葡聚糖-FITC的比较，在与辣木凝集素共同灌胃的条件下，辣木凝集素可增加70kd葡聚糖-FITC进入血液的速度和浓度。由此可知，凝集素具有增加肠道通透性的活性，见图5；

同时我们观察到辣木凝集素的作用可能在促进辣木过敏的进程中发挥重要作用见图6-8；

辣木凝集素特征在于1，来源于辣木，不限种源2分子量范围3 能凝集红血球4能增加肠壁通透性，从而增加高分子量(70kd)大分子入血，见图5；

通过测试比较了酸碱盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶以及高温，微波、辐射处理，辣木凝集素凝血活性的变化情况；图8；凝集素对上述处理都敏感，但在通过透析手段清除干扰后，除高温处理样品其余样品都有不同程度的凝血活性恢复。不同酶对其消化后仅有菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对其活性有影响。

凝集素灭活方法特征在于1、温度2、时间，3、血凝活性消失：见图8-9；4、增加肠道通透性的特性消失：见图10；5、一定程度上减少辣木过敏风险：见图11-13。

通过以上实验可以确定121℃15min处理可以最大程度的对辣木凝集素进行灭活，其次使用蛋白酶对凝集素进行处理可消除一部分凝集素活性，但是当其余的辣木蛋白组分存在时，效果不明显。

与其他灭活方法比较特征在于，1简单易行2透析后活性不恢复 3在有其他蛋白成分存在时效果优于酶解；

通过以上实验可以确定最佳的灭活方式为121℃15分钟。可灭活凝集素90％以上。

经过灭活后的凝集素不再具有凝血活性，不能继续增加肠道通透性。一定程度上削弱了辣木叶过敏效应，使用高温高压对辣木凝集素进行灭活对过敏预防具有一定的正向作用。

通过灭活辣木凝集素的方式减少过敏风险的加工工艺，通过高温与酸、碱、盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶以及高温，微波、辐射处理联合的方式灭活凝集素的方式；

可用于辣木食品加工工艺中控制过敏原。对于有目的预防和消除过敏提供技术支持；

表1不同分子量凝集素的血球凝集活性

采用5种不同离子强度(20％、40％、60％、80％、100％)mol/LNaCI 20mmol/LTri-HCI的缓冲液分别洗脱共存的杂蛋白及目标蛋白。初纯化辣木蛋白样品在强阴离子交换柱产生的洗脱曲线分成五个峰(Ⅰ～Ⅴ)结果如图1所示。其中，在洗脱管数为3-6的单一峰经凝血活性检测，含较高活力的凝血活性。较强的凝乳活力测试结果证明Ⅰ组分存在目标蛋白。将Ⅰ峰的组分进一步分级，在50K Millipore离心管上进行超滤。SDS-PAGE可得，两种蛋白分子量差别较大，可以通过 5K的Millipore超滤离心管进行分离纯化，4℃离心(1300×g，15min)，便可将分子量分别为18kDa和35kDa的蛋白分开。通过SDS-PAGE 凝胶电泳检测纯化程度。

图5辣木凝集素可以促进70KD葡聚糖-FITC荧光素入血，说明辣木凝集素可以增加肠道通透性，可以增加过敏风险(小鼠用生理盐水稀释的10mg/ml FITC-dextran进行灌胃，每只鼠灌0.35ml，设置组别：空白(生理盐水)、FITC-4、FITC-70、FITC-70+MO(80mg/ml)，分别在2、4、8h后眼球取血1ml左右，沉淀后4℃4500rpm离心10min, 取上清约200ul，荧光分光光度计测荧光强度。

图6辣木过敏小鼠肠道形态学变化，有明显的水肿，且绒毛变短，说明辣木凝集素作用下辣木叶更容易过敏；

图7辣木过敏小鼠肠道肥大细胞分布变化，说明辣木凝集素作用下辣木叶更容易引发肥大细胞脱粒从而引发过敏；

图8不同理化处理对辣木凝集素血凝活性的影响；

图9透析后化学处理的灭活方式失效，但高温灭活效力未发生变化；

用HCl(1mM)、NaOH(1mM)、胃蛋白酶(1mM)、胰蛋白酶 (1mM)、菠萝蛋白酶(1mM)、木瓜蛋白酶以及高温，微波、辐射处理，辣木凝集素，发现这些物质对辣木凝集的凝血效果均有一定的抑制作用。

将上述物质进行透析后测凝血效果，发现除高温处理样品其余样品都有不同程度的凝血活性恢复。不同酶对其消化后仅有菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对其活性有影响。

通过以上实验可以确定121℃15min处理可以最大程度的对辣木凝集素进行灭活，其次使用蛋白酶对凝集素进行处理可消除一部分凝集素活性，但是当其余的辣木蛋白组分存在时，效果不明显。

图10高温灭活后的凝集素不再具有增加肠道通透性的特征。

图11血清中细胞因子变化，可见经过灭活后的辣木叶失去了绝大多数过敏活性，证明灭活凝集素的方式可避免辣木过敏。

图12血清中过敏特征抗体变化，可见经过灭活后的辣木叶失去了绝大多数过敏活性，证明灭活凝集素的方式可避免辣木过敏。

图13模型小鼠变化，可见经过灭活后的辣木叶失去了绝大多数过敏活性，证明灭活凝集素的方式可避免辣木过敏。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。