一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体属于一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

甲型流感病毒属于正粘病毒科，大多呈球形，直径80-120nm，有囊膜。病毒基因组为单股负链RNA，其基因组由8个单股负链RNA片段组成。其粒子表面有血凝素(Hemag-glutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)两种表面结构蛋白。根据HA和NA的抗原性差异，主要可分为16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。不同亚型甲型流感病毒的致病性和宿主嗜性等均有较大差异。低保真RNA聚合酶会引起病毒的高突变率和重组，造成病毒分子出现多样性，使每个病毒亚型可变异为多种不同的分支。

乙型流感是由乙(B)型流感病毒所导致的流行性感冒，导致患者出现畏寒、发热、全身酸痛、乏力、咽干喉痛、腹泻等症状，给患者带来了极大的危害。

呼吸道合胞体病毒(RSV)在全球属于引致呼吸道感染的常见起因，又是婴幼儿呼吸道感染最常见的病原,也是引致1岁以下婴儿肺部受感染的最普遍原因。能引致呼吸道疾病，例如气管、肺部及中耳的感染。

重症急性呼吸综合征(SARS)为一种由SARS冠状病毒(SARS-CoV)引起的急性呼吸道传染病，世界卫生组织(WHO)将其命名为重症急性呼吸综合征。本病为呼吸道传染性疾病，主要传播方式为近距离飞沫传播或接触患者呼吸道分泌物。

中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome，MERS，又称新沙士、2012年新型冠状病毒)是一种在2012年发现的新型病毒，被认为和造成SARS的病毒相似，最早出现在中东。患者可出现急性严重呼吸系统疾病，病征包括发烧、咳嗽、呼吸急促和困难，出现肺炎或肾脏衰竭等严重并发症。有些患者还有肠胃方面的症状，如腹泻和恶心呕吐。

埃博拉病毒(Ebola virus，又译作伊波拉病毒)，是对一群属于纤维病毒科埃博拉病毒属下数种病毒的统称，属于十分罕见的病毒。这种病毒能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，有很高的死亡率，在50％至90％之间，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量休克或多发性器官衰竭。1976年在苏丹南部和刚果(金)(旧称扎伊尔)的埃博拉河地区被发现，引起医学界的广泛关注和重视，“埃博拉”由此而得名。

2019年12月以来，武汉市持续开展流感及相关疾病监测，发现病毒性肺炎病例若干例，均诊断为病毒性肺炎/肺部感染。世界卫生组织正式将造成此次肺炎疫情的新型冠状病毒命名为“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”，并宣布该疫情是国际关注的突发公共卫生事件。中国国家卫健委将新型冠状病毒感染的肺炎纳入乙类传染病，按甲类管理。

VOC-202012/01(曾命名为VUI–202012/01)是变异新冠病毒，主要出现在伦敦以及英格兰东南部，最早于2020年9月份在患者身上被发现。该变异病毒据说比原始毒株传播力高出70％。根据权威机构的NGS测序发现，新型冠状病毒在该病毒的S基金(编码病毒纤突蛋白)发生了三个变异，第一个是69-70del，这是古普塔在他的英国剑桥患者身上发现的一种基因缺失，该患者体内的新冠病毒似乎因为这一个点位的缺失逃避了免疫系统。它导致刺突蛋白中两个氨基酸的缺失。在实验室实验中，古普塔发现工程改造后携带这种缺失刺突蛋白的病毒具有两倍的感染力。第二个是N501Y，这是弗雷德·哈钦森癌症研究中心的进化生物学家布鲁姆(Jesse Bloom)所发现的病毒突变，可以增加病毒蛋白与ACE2受体(这是新冠病毒进入人体细胞的“大门”)的结合程度。该突变也存在于501Y.V2中，这是南非研究人员在对三个沿海省份迅速暴发的疫情进行调查后发现的新冠病毒变体。夸祖鲁-纳塔尔大学(University of KwaZulu-Natal)的病毒学家Tulio de Oliveira说，他们发现这一谱系似乎传播得更快了，他的工作首先使英国科学家意识到了N501Y的重要性。第三个令人担忧的变异位点是P681H，它改变了必须剪切刺突蛋白才能进入人体细胞的位点。这也是新冠病毒和SARS病毒刺突细胞的不同的位点这一。柏林Charité大学医院的病毒学家ChristianDrosten说，这一位点上的突变和N501Y一样重要。

呼吸道传染病可由病毒、细菌、支原体、衣原体等多种病原体引起，可以通过空气、飞沫，或密切接触传播。其中病毒性呼吸系统传染病占70-80％。不同的呼吸道传染病临床表现大致相同，常伴发热、头痛、肌痛、乏力、流涕、咳嗽、咳痰等症状，严重者可发生并发症或死亡。呼吸道疾病由于其症状相似且种类繁多，临床上注册的产品大多是针对单一的病原体检测。本发明所涉及的病原，占目前病毒性呼吸系统传染病的90％左右。

目前，虽然有许多检测呼吸道病原体的方法，但检测的病原体较单一，且耗时长。

多重PCR(multiplex Polymerase chain reaction，mPCR)，是由普通PCR延伸而来的一项PCR技术，在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个目的核酸片段的PCR反应。因其可在单一PCR体系中，同时扩增多个目的片段，多重PCR不仅保留了普通PCR特异性强、灵敏度高的优点，而且具有节约时间、节省人力物力等优点，在临床检测上具有很高的应用价值。

多重不对称扩增的基本原理是在同一通道中加入不对称的上下游引物，从而导致产生大量的单链模板。单链模板与过量的探针结合形成局部双链，逐渐升温至达到相应探针半数解链温度(melting temperature,Tm)值时，局部双链会打开导致荧光信号被淬灭，在荧光定量PCR仪进行熔解曲线分析时就会在该Tm值时形成特异的熔解峰。因而根据在同一荧光通道内设置不同Tm值的探针会形成不同温度的特异性熔解峰。本次研发的不对称扩增体系就是基于此原理进行多重扩增的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒及其检测方法，克服了现有技术的不足，实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测口咽拭子和鼻咽拭子以及临床组织液中相关病原微生物的检测。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，包括分别针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征、埃博拉病毒以及新型冠状病毒及其变异株的七组特异性引物和野生型封闭探针；

针对甲型流感病毒，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ IDNo.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；野生型封闭探针1的序列如SEQ ID No.3；

针对乙型流感病毒，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ IDNo.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；野生型封闭探针2的序列如SEQ ID No.6；

针对呼吸道合胞体病毒，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ IDNo.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；野生型封闭探针3的序列如SEQ ID No.9；

针对重症急性呼吸综合征，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQID No.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；野生型封闭探针4的序列如SEQ ID No.12；

针对中东呼吸综合征，特异性引物对包括引物9和引物10，引物9的序列如SEQ IDNo.13，引物10的序列如SEQ ID No.14；野生型封闭探针5的序列如SEQ ID No.15；

针对埃博拉病毒，特异性引物对包括引物11和引物12，引物11的序列如SEQ IDNo.16，引物12的序列如SEQ ID No.17；野生型封闭探针6的序列如SEQ ID No.18；

针对新型冠状病毒，特异性引物对包括引物13和引物14，引物13的序列如SEQ IDNo.19，引物14的序列如SEQ ID No.20；野生型封闭探针7的序列如SEQ ID No.21。

进一步，所述野生型封闭探针进行标记的荧光基团包括但不限于：FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种；其淬灭荧光基团的标记包括但不限于：TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。

进一步，所述野生型封闭探针的修饰包括硫代修饰、脱氧脲嘧啶、脱氧次黄嘌呤、2-甲氧基修饰中的一种或多种，其中野生型封闭探针中Linker序列为与原序列不匹配的2-6个任意碱基序列。

本发明还保护了一种同步检测多项呼吸道病原体的检测方法，利用上述的同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，具体包括以下步骤:

步骤一、核酸样本的提取：采集样本并提取DNA，将提取的DNA转移至冰箱保存备用；

步骤二、荧光定量PCR反应：

(1)配制20μL PCR扩增体系，包括：mix 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、野生型封闭探针0.2μL、水7μL和模板2.0μL；

(2)将上述配置的PCR扩增体系与步骤一提取得到的DNA匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃5min预变性；然后依次在95℃10S,60℃30S,进行40个循环；熔解曲线程序为：95℃for 1min,40℃for 30s then with a 1％ramp to 95℃；

步骤三、PCR结果分析：根据步骤二中获得的扩增曲线对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征、埃博拉病毒以及新型冠状病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中是否含有待检测的病原感染。

进一步，步骤二所述PCR扩增体系中还包括热稳定且具备或者不具备5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。

进一步，步骤二所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型封闭探针的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型封闭探针的实时扩增荧光信号能被正常检测。

本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：

1、本发明通过应用荧光定量PCR技术可以快速、准确且更加灵敏地对多项呼吸道病原体进行检测，检测敏感性高(检出下限均可以达到1拷贝)、特异性好，具有高通量、低成本等特点。

2、荧光定量PCR反应程序一步完成，不需进行产物纯化测序等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。

3、本发明采用不对称+熔解曲线分析的方法，突破了传统检测体系一个通道只能检测一个靶标的局限；本发明中的一个荧光通道可以检测至少三个靶标。

4、本发明采用P681H位点突变为靶标用于检测新型冠状病毒变异株，首次利用相同的技术运用于新型冠状病毒病原诊断和新型冠状病毒变异株的突变检测两方面。

附图说明

图1为为本发明检测体系第一通道-FAM通道熔解曲线图谱：新型冠状病毒通用型(在62℃左右重复出现特异性的熔解峰)、新型冠状病毒变异株(在68℃左右重复出现特异性的熔解峰)以及甲型流感病毒的荧光(在72℃左右重复出现特异性的熔解峰)。

图2为本发明检测体系第二通道-Vic熔解曲线图谱：乙型流感病毒(在65℃左右重复出现特异性的熔解峰)以及呼吸道合胞体病毒(在72℃左右重复出现特异性的熔解峰)。

图3为本发明检测体系第三通道-ROX熔解曲线图谱：重症急性呼吸综合征(在59℃左右重复出现特异性的熔解峰)、中东呼吸综合征(在65℃左右重复出现特异性的熔解峰)以及埃博拉病毒(在72℃左右重复出现特异性的熔解峰)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅限于这些实例，在为脱离本发明宗旨的前提下，所为任何改进均落在本发明的保护范围之内。

实施例1

本发明所述的一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，包括分别针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征、埃博拉病毒以及新型冠状病毒及其变异株的七组特异性引物和野生型封闭探针；具体的基因序列如表1所示。

表1基因序列表

其中，野生型封闭探针Wt-Blocker的报告荧光基团的标记包含但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种；其淬灭荧光基团的标记包含但不限于TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。野生型封闭探针Wt-Blocker的修饰包括硫代修饰、脱氧脲嘧啶、脱氧次黄嘌呤、2-甲氧基修饰中的一种到多种，Linker序列为与原序列不匹配的2-6个任意碱基序列。其他部分为荧光定量PCR分析试剂盒的常规试剂。

1.DNA提取

1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：

(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。

1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；

1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；

1.4分别移取900μL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；

1.5小心移取300μL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；

1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；

1.7 13,000rpm室温离心20秒；

1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；

1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；

1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击Eppendorf管底部，使白色沉淀重悬；

1.11移取300μL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；

1.12打开Eppendorf管，移取100μL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管盖，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；

1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；

1.14移取300μL异丙醇入Eppendorf管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；

1.15 13,000rpm室温离心1min；

1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；

1.17移取300μL 75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；

1.18 13,000rpm室温离心1min；

1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；

1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；

1.21目测沉淀大小，加入50～100μL DNA Rehydration Solution至沉淀；

1.22过夜熔解后用NanoDrop紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于等于20ng/μL且OD260/OD280为1.9±0.2视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution熔解DNA；

1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；

1.24保存核酸标本至4℃冰箱；

2.荧光定量PCR反应

2.1在试剂准备区配制20μL PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表2：

表2各组分添加量

2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加2.0μL至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；

2.3设置程序后在将PCR管放入适配器，并安装到扩增仪内；

2.4点击“start”开始仪器运行。

3.结果判读：分别看对应的FAM、Vic和ROX通道是否出现特异性的熔解峰。本研究中，FAM通道熔解曲线图谱：新型冠状病毒通用型在62℃左右出现特异性的熔解峰、新型冠状病毒变异株在68℃左右出现特异性的熔解峰、甲型流感病毒在72℃左右重复出现特异性的熔解峰；第二通道-Vic熔解曲线图谱：乙型流感病毒在65℃左右出现特异性的熔解峰、呼吸道合胞体病毒在72℃左右出现特异性的熔解峰；第三通道-ROX：重症急性呼吸综合征病毒在59℃左右出现特异性的熔解峰、中东呼吸综合征病毒在65℃左右出现特异性的熔解峰、埃博拉病毒在72℃左右出现特异性的熔解峰。

4.一代测序结果分析

在“experiment”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“gene scaning”，点击“Calculate”键，对所有检测标本进行基因型分析。

对样本检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征SARS-CoV、中东呼吸综合征MERS-CoV、埃博拉病毒Ebola以及新型冠状病毒SARS-CoV2型及其变异株的检测结果。

采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征SARS-CoV、中东呼吸综合征MERS-CoV、埃博拉病毒Ebola以及新型冠状病毒SARS-CoV2型及其变异株进行检测和判读。

甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征SARS-CoV、中东呼吸综合征MERS-CoV、埃博拉病毒Ebola以及新型冠状病毒SARS-CoV2型及其变异株阴性或者阳性。临床医生可根据阴阳性结果结合临床症状和其他检查进行确诊。

筛选引物的对比例

表3引物对比结果

实验对比例

将12例样本的荧光定量PCR检测与一代测序进行对比实验。

12例样本荧光定量PCR检测1.5小时+结果分析0.5小时，合计2小时。而一代测序检测8小时+结果分析1h，合计9小时。且荧光定量PCR检测为闭管操作，不需进行产物纯化测序等二次处理，因而也不存在扩增产物污染的风险。

12例样本荧光定量PCR与一代测序检测结果的对比，如下表4：

表4荧光定量PCR与一代测序结果对比

检出下限案例

将待检测的扩增子区域整合到同一个假病毒内，由上海复百澳生物科技有限公司完成合成、表达和组装并且进行病毒定量。将病毒依次10倍倍比稀释至10000、1000、10、1拷贝/μL，对上述稀释比的病毒进行荧光定量PCR反应。

结果：所列八项病原检测下限均为1拷贝。

因此，本发明的主要创新点在于：

本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征SARS-CoV、中东呼吸综合征MERS-CoV、埃博拉病毒Ebola以及新型冠状病毒SARS-CoV2型及其变异株，能够满足临床检验实际工作中相关病原检测的要求。

以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。