一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 11:34:14
技术领域
本发明涉及医学生物领域,尤其涉及一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用。
背景技术
EBV病毒是重要的致瘤病毒,引发一系列淋巴细胞恶性克隆,难医治且容易复发。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)治疗是目前治疗难治复发血液系统肿瘤的重要方法,针对B细胞急性白血病,淋巴瘤,获得了非常好的疗效数据。但是存在一些问题,比如因缺乏肿瘤特异性的靶抗原导致的脱靶效应以及严重的CRS(细胞因子释放综合征),因此靶点的选择是CAR-T细胞治疗重要的研究内容。
淋巴瘤末期患者的肿瘤免疫逃逸,主要表现为患者T细胞PD1分子的上调和淋巴瘤PDL1的上调,导致约30%的患者无法获得足够的数量和功能的自体T细胞,无法进行CAR-T细胞治疗。绝大多数的EBV淋巴瘤存在的PD1和PDL1的上调都是因为LMP1的调控导致的,因此敲除T细胞PD1纠正肿瘤免疫逃逸,是淋巴瘤末期患者进行CAR-T细胞治疗的关键。
发明内容
有鉴于此,本发明提出了可特异性敲除PD1,且不会产生严重的CRS的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的:本发明提供了一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用。
一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1,构建PD1基因sgRNA质粒pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR细胞质粒LMP1-CARPiggyBac Transposon,将pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR PiggyBac Transposon质粒与电转缓冲液混合,制得电转混合液,并用电转混合液转染PBMC细胞,得到转染后的PBMC细胞;
S2,将转染后的PBMC细胞转入T细胞培养基,用磁珠激活CD3阳性T细胞,并培养扩增转染后的PBMC细胞,获得敲除PD1的LMP1-CAR-T细胞。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒的PD1基因序列选自5'-GGN(19)GG、5'-GN(20)GG和5'-N(21)GG中的一种。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒的构建方法为:
S1,在PD1基因的sgRNA核苷酸链序列的5’加上CCGG,合成正向寡核苷酸,对应互补链序列的5’加上CACG,合成反向寡核苷酸;
S2,将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸成对变性、退火后,形成可连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸;
S3,将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述LMP1-CAR PiggyBac Transposon质粒的构建方法为:
S1,依次连接抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区,并合成基因序列片段;
S2,将基因序列片段插入到Piggybac转座子载体中,并用柱离心法提取质粒,得到能表达LMP1靶点CAR-T的质粒LMP1-CARPiggyBac Transposon。
在以上技术方案的基础上,优选的,步骤S1所述抗LMP1单链抗体的轻链前还包括信号肽,抗LMP1单链抗体的轻链和抗LMP1单链抗体的重链之间还包括轻重链间隔区。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述磁珠为偶联有CD3/CD28抗体的磁珠。
在以上技术方案的基础上,优选的,所述PBMC细胞制备方法如下:
S1,采集外周血,用PBS稀释抗凝血后加入装有淋巴细胞分离液的离心管中慢升慢降离心;
S2,吸取离心后的白膜层转入离心管,加入PBS,慢升慢降离心,弃上清,保留沉淀,重复加入PBS和离心步骤2次,即得PBMC细胞。
在以上技术方案的基础上,优选的,将pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒、pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒、LMP1-CAR PiggyBac Transposon质粒和Super PiggyBac Transposase质粒与T细胞核转染试剂盒中的电转缓冲液混合,获得包含该四种质粒的电转混合液,用该电转混合液悬起1-2×107个PBMC细胞进行电转。
在以上技术方案的基础上,优选的,步骤S2所述T细胞培养基为含10%FBS的RPMI-1640培养基。
更进一步优选的,还包括一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞在制备EVB淋巴瘤诊断试剂或治疗药物中的应用。
本发明的一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用相对于现有技术具有以下有益效果:
(1)本发明采用靶向LMP1的CAR-T细胞联合敲除PD1的联合治疗,对患者的T细胞进行PD1敲除,纠正免疫逃逸,恢复患者的免疫功能,增强CAR-T细胞攻击淋巴瘤的效应,在制备EVB淋巴瘤诊断试剂或治疗药物中的应用中具有重要的临床意义。
(2)本发明提供的PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞可以特异性的结合肿瘤细胞,专一性的靶向表达的EB病毒感染的霍奇金淋巴瘤细胞,促进T细胞在患者体内的扩增,对肿瘤细胞产生杀伤效果,不会发生针对B细胞或者T细胞的误伤。
(3)本发明提供的PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞,相对于LMP1-CAR-T细胞和T细胞具有很高的杀伤效果,在效靶比1:10时,PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞的杀伤效率可达81.5%。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例四的LMP1-CAR-T细胞PD1敲除效果分析图;
图2为本发明实施例五的PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞的TNF-α细胞因子检测图,不同大写字母表示处理间差异达到极显著水平(P<0.01);
图3为本发明实施例五的PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞的IL-2的细胞因子检测图,不同大写字母表示处理间差异达到极显著水平(P<0.01)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式,对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
实施例一 PBMC细胞制备
用抗凝管采集健康人(或患者)外周血。用PBS稀释抗凝血(1∶1)后将其缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(Ficoll)的50ml离心管中,以350g的离心力,慢升慢降离心30min;
离心结束后,小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层,转入一个新的50ml离心管中,加入PBS,以300g的离心力,慢升慢降离心15min,弃上清,保留离心管底部的细胞沉淀;再次加入PBS,以160g的离心力,慢升慢降离心15min,弃上清;最后加入PBS,以300g的离心力,慢升慢降离心10min,弃上清,即得到PBMC。
实施例二制备CAR-T细胞
1.质粒构建
1.1 pGL3-U6-hPD1sg质粒的构建
1.1.1 靶向PD1基因的sgRNA的设计:
因为没有使用体外转录,只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明,文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
(1)在PD1基因上选择5'-GGN(19)GG的序列,如果没有5'-GGN(19)GG的序列,5'-GN(20)GG或者5'-N(21)GG也可以。
(2)sgRNA在PD1基因上的靶向位点位于基因的外显子。
(3)sgRNA在PD1基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
(4)在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST,确定sgRNA的靶序列是否唯一。
1.1.2 靶向PD1基因的sgRNA的选择:
(1)不能离ATG起始子太近,防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式,不能保证基因完全失活;
(2)sgRNA在PD1基因上的靶向位点位于整个基因的前半段,尤其宜在基因的功能结构域中;
(3)选择相隔一定距离(10~30bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失,也有利于降低脱靶效应;
1.1.3 构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNA,在其5'加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5'端已经有1或者2个G,那么就对应的省略1或者2个G);根据选择的sgRNA,获得其对应DNA的互补链,并且在其5'加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸,将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverseoligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链,如下:
Forward oligo:5'-CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'
Forward oligo核苷酸序列表如SEQ ID NO.3所示;Reverse oligo核苷酸序列表如SEQ ID NO.4所示。
1.1.4 sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建
(1)线性化pGL3-U6-sgRNA质粒,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hPD1sg质粒。
(3)转化并涂Amp+平板。
(4)通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
(5)37℃摇床摇菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提pGL3-U6-hPD1sg质粒。
1.2 LMP1-CAR piggyBac transposon质粒的构建
1.2.1 依次连接信号肽、抗LMP1单链抗体的轻链、间隔区、抗LMP1单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区,并合成基因序列片段。所有序列都是人源化的,由金唯智生物公司合成基因片段。
信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
抗LMP1单链抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
间隔区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;
抗LMP1单链抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;
CD28跨膜区和胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;
41BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示;
CD3ζ胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
1.2.2 将上述合成的片段插入到商业的PiggyBac转座子载体中,得到能表达LMP1靶点的CAR的质粒LMP1-CAR PiggyBac Transposon。该连接步骤由金唯智生物公司完成。
1.3 LMP1-CAR PiggyBac Transposon质粒的提取
1.3.1 将合成的LMP1-CAR PiggyBac Transposon重组质粒的穿刺菌接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中,37℃、200rpm培养过夜。将过夜培养的菌液平均加入50ml离心管中,13000rpm(~16200×g)离心5分钟收集细菌,尽量吸弃全部上清。
1.3.2 向留有菌体沉淀的离心管中加入600μl Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)。
1.3.3 使用移液器或涡旋振荡器充分混匀,悬浮细菌沉淀;向离心管中加入600μlBuffer P2,温和地上下颠倒混匀8-10次,使菌体充分裂解,室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠;向离心管中加入600μl Buffer E3,立即上下颠倒混匀8-10次,此时出现白色絮状沉淀,室温放置5分钟。13000rpm离心5分钟,吸取上清,将上清加入过滤柱(Endo-Remover FM)中(已装入收集管),13000rpm离心1分钟过滤,将收集管中的滤液转移到离心管中。
1.3.4 向滤液中加入600μl异丙醇,上下颠倒混匀。
1.3.5 柱平衡:向已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DL)中加入200μlBuffer PS,13000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
1.3.6 将步骤1.3.4中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中。13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
1.3.7 向吸附柱中加入750μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇),13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液。
1.3.8 将吸附柱重新放回收集管中,13000rpm离心1分钟。
1.3.9 将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中,向吸附膜的中间部位加150μlEndo-Free Buffer EB,室温放置2-5分钟,13000rpm离心2分钟,于-20℃条件下保存质粒。
2.将PBMC用T细胞培养基(含10%FBS的RPMI1640培养基)稍加培养1-2个小时后进行电转。
3.将pGL3-U6-hPD1-sgRNA质粒、pST1374-NLS-flag-Cas9ZF质粒、LMP1-CARPiggyBac Transposon质粒和Super PiggyBac Transposase质粒各5μg与人T细胞核转染试剂盒(Lonza,VPA-1002)中的电转缓冲液混合,获得包含该四种质粒的大约110μL电转混合液。
pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
以包含原始质粒pGL3-U6-sgRNA、pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF、LMP1-CARPiggyBac Transposon和Super PiggyBac Transposase四个质粒的电转混合液作为对照,另留一部分细胞不进行电转。
4.参考人T细胞核转染试剂盒(Lonza,VPA-1002)的说明书,分别用所述两组电转混合液悬起1-2×107个PBMC细胞进行电转,电转结束后立刻将细胞转入预热的T细胞培养基;2个小时后再次更换一次培养基。
5.培养16-18小时后加入含100IU/ml的IL-2的T细胞培养基,用偶联有CD3/CD28抗体的磁珠(Thermo Fisher SCIENTIFIC,11141D)刺激激活CD3阳性T细胞。
6.每2至3天更换新的含100IU/ml的IL-2的T细胞培养基,同时观察细胞扩增状况。根据其增殖状况决定其刺激时长,但刺激时间不超过一周。
7.分离去除磁珠后,加入1μg/ml嘌呤霉素继续培养5-7天。收取少量细胞用于检测,其余细胞可继续使用快速扩增法进一步大量扩增,得到PD-1基因沉默的靶向LMP1的CAR-T细胞(即PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞)以及传统的靶向LMP1的CAR-T细胞(LMP1-CAR-T细胞)。
实施例三 利用流式细胞术检测CAR的表达
将105个扩增得到的CAR-T细胞重悬于100μl FACS缓冲液(含2mmol/l EDTA和0.5%BSA的PBS)中,与Goat anti-Hμman IgG Antibody,FITC conjμgate室温孵育30分钟,生理盐水清洗两次后,通过流式细胞仪检测FITC荧光信号,测量FITC阳性细胞比率,反映CAR-T细胞在总细胞中的比率,结果见表1。
表1 PD1敲除的LMP1-CAR-T细胞的传导效率
注:PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞表示PD1敲除的LMP1-CAR-T细胞。
表1结果所示:CAR-T细胞释放颗粒酶和穿孔素,从而杀伤肿瘤细胞,表1结果显示,PD1敲除的LMP1-CAR-T细胞(PD1-KO-LMP1-CAR-T)细胞释放的颗粒酶和穿孔素高于LMP1-CAR-T细胞,表现出较高的杀伤力。
实施例四 细胞基因组提取与PD1敲除效果分析
1.使用含蛋白酶K的细胞裂解液消化细胞(0.1-1×106),并用酚氯仿法提取CAR-T细胞基因组DNA。
2.用检测on-target引物hPDl test For和hPD1 test Rev PCR扩增目的片段。反应体系为:12μl 10×buffer,12μl dNTP(0.5mmol/l),500ng基因组DNA,0.6μl hPD1 testFor(0.5μmol/l),0.6μl hPD1 test Rev(0.5μmol/l),3U Super-Taq,补水至120μl体系。反应程序为:95℃5min;95℃30s,60℃30s,72℃1min,30cycles;72℃10min;4℃ forever。使用Axygen PCR产物回收试剂盒纯化回收。
3.使用T7EN1酶切割PCR退火产物,3%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切产物。
4.将PCR产物连接进pMD19-T载体(TAKARA,3271)中,连接方法参考pMD19-T载体的说明书,将连接产物转化至DH5α感受态细菌(TransGen,CD201)中,随机挑取20个以上的单菌落,使用通用引物M13-47进行测序,评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率,结果见图1。
图1结果所示:在PD1-KO-LMP1-CAR细胞中,PD1基因存在缺失和插入突变。进一步,PD1-KO-LMP1-CAR细胞在靶细胞刺激3天的情况下,表面检测不到PD1受体的大量上调,达到纠正肿瘤免疫逃逸的效果。
实施例五 细胞因子检测
将snk6,snt8和raji细胞以每孔1x 105种于96孔板中,将2x 105个PD-1敲除的LMP1-CAR-T细胞与靶细胞混合,以总体积200μl的培养液(RPMI 1640培养基+10%FBS)在37℃5%CO
图2和图3结果所示:PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌量与LMP1-CAR-T细胞、PD1-KO细胞和CAR-T细胞相比,就有统计学差异,表现出对EB病毒感染的霍奇金淋巴瘤细胞具有较强的杀伤力。
实施例六 颗粒酶和穿孔素的检测
将snk6,snt8和raji细胞以每孔1x 105种于96孔板中,将2x105个PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞与靶细胞混合,以总体积200μl的培养液(RPMI1640培养基+10%FBS)在37℃5%浓度CO
表2 颗粒酶和穿孔素的检测结果
同列数据后不同大写字母表示处理间差异达到极显著水平(P<0.01)。
CAR-T细胞释放颗粒酶和穿孔素,从而杀伤肿瘤细胞,表2结果显示,PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞释放的颗粒酶和穿孔素均显著高于LMP1-CAR-T细胞和CAR-T细胞,表现出对淋巴瘤细胞较高的杀伤力。
实施例七 PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞杀伤效果评估
1.取适量snk6,snt8和raji细胞作为靶细胞,在1×106/mL的细胞悬液(PBS,5%胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM,培养箱中孵育30min。
2.常温下,洗两遍后,将细胞重悬至1.5×105mL。按不同效靶比加入PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞、LMP1-CAR-T细胞和T细胞,200g离心30秒,37℃孵育2-3小时。孵育完成后取上清,测量其中钙黄绿素的荧光强度,并根据自发释放对照和最大释放对照,计算靶细胞裂解百分数,结果见表3。
表3 敲除PD-1的LMP1-CAR-T细胞的杀伤效率
同行数据后不同大写字母表示处理间差异达到极显著水平(P<0.01)。
表3结果所示:效靶比为1:1、1:2、1:5、1:10时,PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞的杀伤效率显著高于LMP1-CAR-T细胞和T细胞,结果证明PD1-KO-LMP1-CAR-T细胞对淋巴瘤细胞具有特异杀伤活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> 一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用
<130> 2021
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
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tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
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tatgccggat acatcgatgg cggagcatca caggaagaat tttacaagtt catcaaacca 2100
atcctcgaga agatggacgg tactgaagag ctgctggtga agctgaacag ggaggacctg 2160
ctgaggaagc agaggacctt tgataatggc tccattccac atcagataca cctgggagag 2220
ctgcatgcaa tcctccgcag gcaggaggat ttctatcctt tcctgaagga taaccgggag 2280
aagatagaga agatcctgac cttcaggatc ccttattacg tcggccctct ggctagaggc 2340
aactcccgct tcgcttggat gaccaggaaa tctgaggaga caattactcc ttggaacttc 2400
gaagaggtcg tggataaggg cgcaagcgcc cagtcattca tcgaacggat gaccaatttc 2460
gataagaacc tgcccaacga gaaggtcctg cccaaacatt cactcctgta cgagtatttc 2520
accgtctata acgagctgac taaagtgaag tacgtgaccg agggcatgag gaagcctgcc 2580
ttcctgtccg gagagcagaa gaaggctatc gttgatctgc tcttcaagac taatagaaag 2640
gtgaaagtga agcagctcaa ggaggattac tttaagaaga tcgaatgctt tgactcagtg 2700
gaaatctctg gcgtggagga ccgctttaat gccagcctgg gcacttacca tgatctgctg 2760
aagataatca aagacaaaga tttcctcgat aatgaggaga acgaggacat cctggaagat 2820
atcgtgctga ccctgactct gttcgaggat agagagatga tcgaagagcg cctgaagacc 2880
tatgcccatc tgtttgacga taaagtcatg aaacagctca agcggcggcg ctacactggg 2940
tggggtagac tctccaggaa actcataaac ggcatccgcg acaaacagag cggaaagacc 3000
atcctggatt tcctgaaatc cgacggattc gctaacagga acttcatgca actgattcac 3060
gatgactctc tgacatttaa agaggacatc cagaaggcac aggtgagcgg tcaaggcgac 3120
agcctgcacg agcacatcgc caacctcgct ggatcacccg ccataaagaa gggaatactg 3180
cagacagtca aggtcgtgga cgaactcgtc aaagtgatgg gtcggcacaa gccagagaat 3240
atcgttatcg aaatggcaag ggagaaccaa accacccaga agggccagaa gaactctcgg 3300
gaacggatga aaagaatcga agagggaatt aaggagctgg gatctcagat actgaaggag 3360
caccctgtgg agaatacaca gctccagaac gagaaactct acctgtacta cctccagaac 3420
gggcgggaca tgtacgttga ccaggaactc gacatcaacc ggctgtccga ttatgacgtg 3480
gaccatattg ttccacagtc cttcctcaaa gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc 3540
agatccgata agaatcgcgg taagtctgac aatgttccat cagaagaggt ggtcaagaag 3600
atgaagaatt actggcggca gctcctcaac gccaaactga tcacccagcg gaagtttgac 3660
aatctgacta aggcagaaag aggaggtctg agcgaactcg acaaggccgg ctttattaag 3720
aggcaactgg tcgaaacacg ccagattacc aaacacgtgg cacaaatcct cgactctagg 3780
atgaacacta agtacgatga gaacgataag ctgatcaggg aagtgaaagt gataactctg 3840
aagagcaagc tggtgtctga cttccggaag gactttcaat tctacaaagt tcgcgaaata 3900
aacaattacc atcatgctca cgatgcctat ctcaatgctg tcgttggcac cgccctgatc 3960
aagaaatacc ctaaactgga gtctgagttc gtgtacggtg actataaagt ctacgatgtg 4020
aggaagatga tagcaaagtc tgagcaagag attggcaaag ccaccgccaa gtacttcttc 4080
tactctaata tcatgaattt ctttaagact gagataaccc tggctaacgg cgaaatccgg 4140
aagcgcccac tgatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtgtggga taaaggcagg 4200
gacttcgcaa ctgtgcggaa ggtgctgtcc atgccacaag tcaatatcgt gaagaagacc 4260
gaagtgcaga ccggcggatt ctcaaaggag agcatcctgc caaagcggaa ctctgacaag 4320
ctgatcgcca ggaagaaaga ttgggaccca aagaagtatg gaggtttcga ttcccctaca 4380
gtggcttatt ccgttctggt cgtggcaaaa gtggagaaag gcaagtccaa gaaactcaag 4440
tctgttaagg agctgctcgg aattactatt atggagagat ccagcttcga gaagaatcca 4500
atcgatttcc tggaagctaa gggctataaa gaagtgaaga aagatctcat catcaaactg 4560
cccaagtact ctctctttga gctggagaat ggtaggaagc ggatgctggc ctccgccgga 4620
gagctgcaga aaggaaacga gctggctctg ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg 4680
gcctcccact acgagaaact caaaggtagc cctgaagaca atgagcagaa gcaactcttt 4740
gttgagcaac ataaacacta cctggacgaa atcattgaac agattagcga gttcagcaag 4800
cgggttattc tggccgatgc aaacctcgat aaagtgctga gcgcatataa taagcacagg 4860
gacaagccaa ttcgcgaaca agcagagaat attatccacc tctttactct gactaatctg 4920
ggcgctcctg ctgccttcaa gtatttcgat acaactattg acaggaagcg gtacacctct 4980
accaaagaag ttctcgatgc caccctgata caccagtcaa ttaccggact gtacgagact 5040
cgcatcgacc tgtctcagct cggcggcgac cctaagaaaa agaggaaggt gtaggggccc 5100
ttcgaaggta agcctatccc taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat 5160
catcaccatc accattgagt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 5220
cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 5280
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 5340
attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 5400
catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct 5460
agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 5520
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 5580
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg catcccttta 5640
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 5700
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 5760
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 5820
tcttttgatt tataagggat tttggggatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 5880
taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt 5940
ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 6000
aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 6060
tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 6120
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 6180
gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 6240
tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgttgaca 6300
attaatcatc ggcatagtat atcggcatag tataatacga caaggtgagg aactaaacca 6360
tggccaagcc tttgtctcaa gaagaatcca ccctcattga aagagcaacg gctacaatca 6420
acagcatccc catctctgaa gactacagcg tcgccagcgc agctctctct agcgacggcc 6480
gcatcttcac tggtgtcaat gtatatcatt ttactggggg accttgtgca gaactcgtgg 6540
tgctgggcac tgctgctgct gcggcagctg gcaacctgac ttgtatcgtc gcgatcggaa 6600
atgagaacag gggcatcttg agcccctgcg gacggtgtcg acaggtgctt ctcgatctgc 6660
atcctgggat caaagcgata gtgaaggaca gtgatggaca gccgacggca gttgggattc 6720
gtgaattgct gccctctggt tatgtgtggg agggctaagc acttcgtggc cgaggagcag 6780
gactgacacg tgctacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc 6840
ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 6900
ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 6960
atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 7020
ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa 7080
tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 7140
cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 7200
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 7260
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 7320
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 7380
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 7440
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 7500
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 7560
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 7620
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 7680
caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 7740
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 7800
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 7860
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 7920
actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 7980
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 8040
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 8100
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 8160
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 8220
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 8280
gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 8340
atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 8400
ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 8460
cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 8520
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 8580
cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 8640
tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 8700
agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 8760
gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 8820
gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 8880
ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 8940
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 9000
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 9060
gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 9120
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 9180
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 9240
gtc 9243
<210> 2
<211> 4952
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60
cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 120
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 180
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 240
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 300
tgtggaaagg acgaaacacc ggtgagaccg agagagggtc tcagttttag agctagaaat 360
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 420
ttttttaaag aattctcgac ctcgagacaa atggcagtat tcatccacaa ttttaaaaga 480
aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac 540
atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac 600
agggacagca gagatccact ttggccgcgg ctcgaggggg ttggggttgc gccttttcca 660
aggcagccct gggtttgcgc agggacgcgg ctgctctggg cgtggttccg ggaaacgcag 720
cggcgccgac cctgggactc gcacattctt cacgtccgtt cgcagcgtca cccggatctt 780
cgccgctacc cttgtgggcc ccccggcgac gcttcctgct ccgcccctaa gtcgggaagg 840
ttccttgcgg ttcgcggcgt gccggacgtg acaaacggaa gccgcacgtc tcactagtac 900
cctcgcagac ggacagcgcc agggagcaat ggcagcgcgc cgaccgcgat gggctgtggc 960
caatagcggc tgctcagcag ggcgcgccga gagcagcggc cgggaagggg cggtgcggga 1020
ggcggggtgt ggggcggtag tgtgggccct gttcctgccc gcgcggtgtt ccgcattctg 1080
caagcctccg gagcgcacgt cggcagtcgg ctccctcgtt gaccgaatca ccgacctctc 1140
tccccagggg gatccaccgg agcttaccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc 1200
cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc 1260
cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga 1320
actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc 1380
cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 1440
cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 1500
cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc 1560
gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc 1620
cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga aacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta 1680
cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg 1740
gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgacg cccgccccac gacccgcagc gcccgaccga 1800
aaggagcgca cgaccccatg catcggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt 1860
agatcttagc cactttctag agtcggggcg gccggccgct tcgagcagac atgataagat 1920
acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 1980
aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 2040
acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa 2100
gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtaaaa tcgataagga tccgtcgacc gatgcccttg 2160
agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca 2220
cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctcttccgc 2280
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2340
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2400
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2460
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2520
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2580
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2640
gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2700
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2760
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2820
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2880
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2940
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 3000
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 3060
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 3120
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 3180
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3240
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3300
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgggaccc 3360
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3420
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3480
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 3540
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3600
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3660
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3720
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3780
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 3840
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3900
aaaactctca aggatcttac agctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3960
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 4020
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 4080
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 4140
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 4200
acctgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 4260
gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 4320
cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 4380
atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag 4440
tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 4500
tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga 4560
tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 4620
atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tcccattcgc cattcaggct 4680
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agcccaagct 4740
accatgataa gtaagtaata ttaaggtacg ggaggtactt ggagcggccg caataaaata 4800
tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg aatcgatagt actaacatac 4860
gctctccatc aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca 4920
agtgcaggtg ccagaacatt tctctatcga ta 4952
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggcgtgac ttccacatga gcg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccgctca tgtggaagtc acg 23
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 信号肽序列(Signal peptide sequence)
<400> 5
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 抗LMP1单链抗体的轻链(Light chain against LMP1 single chainantibody)
<400> 6
gaactgcaga tgacacaaag cccctcctcc ctctccgcca gcgtgggaga cagagtcgct 60
atcacatgta gagctagcca gtccatctcc tcccatctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcaaggccc ccaaactgct gatttatgcc gccagcagcc tccaatccgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gctccggcag cggaacagac tttacactca ccatcagctc tctgcagccc 240
gaagacttcg ccacctacta ctgtcagcag tcctactcca caccttacac attcggccaa 300
ggcaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 轻重链间(Linker sequence)
<400> 7
ggtggcggtg gctctggtgg cggtggctcc ggtggcggtg gctca 45
<210> 8
<211> 360
<212> DNA
<213> 抗LMP1单链抗体的重链(Heavy chain of anti-LMP1 single chainantibody)
<400> 8
gaagtccaac tggtcgagag cggaggagga ctcgtccaac ccggcggctc tctgaggctg 60
agctgcgctg cttccggctt cacattctcc tcctactgga tgagctgggt gagacaagct 120
cccggcaagg gactcgaatg ggtggccaat atcaagcaag acggcagcga gaagtactac 180
gtggactccg tgaagggaag attcacaatc tccagagaca acgccaagaa ctctctgtat 240
ctgagaatga actctctgag agccgaagac acagccgtgt attactgcgc tagggcttgg 300
ggctactcca gctactactt cgattactgg ggacaaggca ccctcgtcac agtcagcccc 360
<210> 9
<211> 204
<212> DNA
<213> CD8α铰链区(CD8α hinge area)
<400> 9
ttttgggtcc tcgtggtggt gggaggagtg ctggcttgct attctctgct cgtgaccgtc 60
gcctttatca tcttttgggt gaggtccaaa aggagcagag gcggacacag cgattatatg 120
aacatgacac ctagaagacc cggacctacc agaaaacact accaacccta tgctcctcct 180
agagactttg ccgcctacag atcc 204
<210> 10
<211> 123
<212> DNA
<213> CD28跨膜区和胞内区(CD28 transmembrane and intracellular regions)
<400> 10
agatccaaga gatctagact gctgcattcc gactacatga atatgacccc cagaaggccc 60
ggccctacaa ggaagcacta ccagccttac gcccctccta gggatttcgc cgcttataga 120
agc 123
<210> 11
<211> 126
<212> DNA
<213> 41BB胞内区(41BB intracellular region)
<400> 11
aagagaggaa gaaagaaact gctctacatt ttcaagcagc cctttatgag acccgtccaa 60
accacacaag aggaggatgg ctgcagctgt agatttcccg aggaagaaga gggaggctgc 120
gagctg 126
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> CD3ζ胞内区(CD3 ζ intracellular region)
<400> 12
agagtgaagt tttctagatc cgccgacgct cccgcctatc aa 42
- 一种敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T细胞的制备方法和应用
- 一种敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用