利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用。

背景技术

利用合成生物学思路，通过挖掘自然界中对特定化合物敏感的生物识别元件，将其与报告元件连接组成基因线路，转化至遗传背景清晰，操作简单的模式微生物(例如大肠杆菌)中，构建获得微生物传感器。这种微生物传感器可以用于环境污染检测、食品检测等领域。其中生物识别元件包括负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控蛋白等等，可特异性地感应靶标化合物，引起下游报告元件产生信号。一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP)，分别产生绿色荧光、黄色荧光和红色荧光等可以被检测的感应信号。荧光检测的特点是技术成熟、信号强，但是荧光蛋白的荧光信号需要借助于特定波长紫外光的激发，而且荧光信号的收集需要借助于荧光检测仪器。荧光素酶(Luc)也常被用作报告元件，例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶等等，但以荧光素酶作为报告元件时，需在系统中加入荧光素作为底物，在荧光素酶催化作用下，才能够产生荧光。

战区残留爆炸物(例如地雷)对于生命安全、生态系统都造成了不可修复的损伤，因此针对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。通过生物检测技术是对残留地雷进行检测是一种有效的手段。爆炸物(例如地雷)的有效成份为TNT，TNT可分解为多种化合物，如1，3-二硝基苯(1，3-DNB)和2，4-二硝基甲苯(2，4-DNT)。以色列科学家ShimshonBelkin于2014年报道了对爆炸物分子2，4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2，4-DNT的生物感应系统，其对2，4-DNT的检测限为19.4mg/L。此生物传感器以GFP作为报告元件，在野外进行爆炸物探测时，需使用特制的仪器进行紫外波长激发，同时进行绿色荧光的收集，这对于实际的应用是不友好的。另外，野外情况较为复杂，多种非GFP物质能够在紫外光激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。

因此，需要研发一种无需荧光素酶作用，又可以不受其他非GFP物质影响的新的爆炸物感应器或感应系统。

发明内容

本发明提供了利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用，所述微生物自发光生物传感器中含有自发光操纵子和启动子，可以实现对爆炸物的实时荧光检测。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将自发光操纵子luxABCDE operon利用PCR扩增、纯化回收，其与质粒pACYCDuet-1同时使用EcoR I和Hind III进行双酶切，将luxABCDE operon片段与质粒酶切片段以2∶5的质量比进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含氯霉素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-lumPleio或p-lumVf；

(2)扩增启动子114基因片段，纯化回收后，其与重组质粒p-lumPleio或p-lumVf利用EcoR I进行单酶切，将质粒酶切片段与114基因片段以25∶1的质量比进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含卡那霉素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-114-lumPleio或p-114-lumVf；

(3)将重组质粒p-114-lumPleio或p-114-lumVf转化大肠杆菌感受态细胞，于含氯霉素的LB固体平板上筛选到的阳性克隆，得到工程菌株XLYC1或XLYC2；

(4)将工程菌株XLYC1或XLYC2于含氯霉素的LB液体培养基中培养活化，再转接至添加了60％葡萄糖和1M硫酸镁溶液的M9液体培养基中培养生长至OD

进一步的，所述自发光操纵子luxABCDE operon来源于：鲾鱼发光杆菌或费氏弧菌。

进一步的，所述自发光操纵子luxABCDE operon具有下列核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的，且能够编码自发光表型的核苷酸序列。

进一步的，所述启动子114的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，扩增鲾鱼发光杆菌来源的自发光操纵子luxABCDE operon的PCR引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

进一步的，扩增费氏弧菌的自发光操纵子luxABCDE operon的PCR引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

进一步的，扩增所述启动子114的PCR引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

本发明还提供了所述的利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法中获得的微生物自发光生物传感器。

本发明还提供了所述的微生物自发光生物传感器在用于爆炸物分子的实时检测中的应用。

进一步的，所述微生物自发光生物传感器的使用方法为：将所述微生物自发光生物传感器与待测样品以8-10∶1的体积比混匀后，加入黑色酶标板后封闭，利用酶标仪恒温实时监测荧光强度RLU值，每10-20min进行一次监测，共监测15-25h。

优选的，所述微生物自发光生物传感器的使用方法为：将所述微生物自发光生物传感器与待测样品以9∶1的体积比混匀后，加入黑色酶标板后利用封闭膜封闭，在使用酶标仪恒温实时监测荧光强度RLU值，每10-20min进行一次监测，共监测20h。

进一步的，所述微生物自发光生物传感器能够感应到的爆炸物分子的浓度为10μg/L-10mg/L。

进一步的，所述爆炸物分子为2，4-DNT。

进一步的，所述微生物自发光生物传感器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而生成不同RLU值的荧光，将爆炸物分子浓度与自发光RLU值进行偶联来达到实时监测爆炸物分子的目的。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、本发明将含有自发光操纵子的报告质粒作为基础质粒，通过连接不同的启动子，制备成微生物自发光生物传感器，该生物感应器能够实时感应不同浓度的爆炸物分子，从而生成不同RLU值的自发光，并将爆炸物分子浓度与自发光RLU值进行偶联，进而实现了对爆炸物分子的实时荧光检测，且该方法操作方便、简单、安全性高、灵敏度高。

2、本发明采用luxABCDE operon作为报告元件，能够避免需要荧光素酶才能够产生荧光进行检测的缺点，在luxABCDE operon中，luxCDE编码的脂肪酸还原酶能够催化底物脂肪醛的合成，而脂肪醛在luxAB编码的荧光素酶的催化作用下能够发出荧光，即自发光，因此本发明的微生物自发光生物传感器相比于常用的荧光蛋白和荧光素酶，其操作更简便、信号收集更容易，能够检测到浓度范围较广的爆炸物分子，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为构建的载体p-lumPleio的质粒图谱。

图2为构建的载体p-lumVf的质粒图谱。

图3为构建的载体p-114-lumPleio的质粒图谱。

图4为构建的载体p-114-lumVf的质粒图谱。

图5为构建的工程菌株XLUM1诱导自发光检测结果。

图6为构建的工程菌株XLUM2诱导自发光检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。

实施例1：基因的获得和载体的构建

1、基因的获得

将一种来源于鲾鱼发光杆菌(Photobacterium leiognathi)的luxABCDE operon，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由华大基因公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-lumPleio载体。

将一种来源于费氏弧菌(Aliivibrio fischeri)的luxABCDE operon，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由华大基因公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-lumVf载体。

将114启动子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，由华大基因公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-114载体。

2、p-lumPleio和p-lumVf表达载体的构建

(1)以pUC-lumPleio为模版，引物LuxC-F和引物LuxG-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增lumPleio片段，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：95℃ 3min；30循环×(95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 4min)；72℃ 5min：16℃∞。

引物序列如下所示：

LuxC-F：

5’-CCACAGCCAGGATCCGAATTCATGATTAAGAAGATCCCAATGATTATTG-3’(SEQ ID NO.4)；

LuxG-R：

5’-TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTACGTATAGCTAAATGCATCAG-3’(SEQ ID NO.5)。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化。

利用限制性内切酶1 EcoR I(TaKaRa，货号1611)和限制性内切酶2 Hind III(TaKaRa，货号1615)双酶切pACYCDuet-1质粒，其酶切体系为：

酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。

利用无缝克隆将lumPleio片段克隆pACYCDuet-1质粒上，其体系如下所示：

连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含有34mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-lumPleio(图1)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

(2)以pUC-lumVf为模版，引物LumVf-F和引物LumVf-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增lumPleio片段，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：95℃ 3min；30循环×(95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 4min)；72℃ 5min；16℃∞。引物序列如下所示：

LumVf-F：

5’-CACCACAGCCAGGATCCGAATTCATGAATAAATGTATTCCAATGATAATTAATG-3’(SEQ IDNO.6)；

LumVf-R：

5’-TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTATACGTATGCAAAAGCATCGgc-3’(SEQ ID NO.7)。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化。

利用限制性内切酶1 EcoR I(TaKaRa，货号1611)和限制性内切酶2 Hind III(TaKaRa，货号1615)双酶切pACYCDuet-1质粒，其酶切体系为：

酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。

利用无缝克隆将lumVf片段克隆pACYCDuet-1质粒上，其体系如下所示：

连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含34mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-lumVf(图2)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

3、p-114-lumPleio和p-114-lumVf表达载体的构建

(1)以pUC-114为模版，引物114-pleio-F和引物114-pleio-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增114-Pleio片段，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：95℃ 3min；30循环×(95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s)；72℃ 5min；16℃∞。引物序列如下所示：

114-pleio-F：

5’-CACAGCCAGGATCCGAATTCAACTATCTGCGTCGCTTCTT-3’(SEQ ID NO.8)；

114-pleio-R：

5’-CATTGGGATCTTCTTAATCATGAATTCTGCTTCAGAAACGACGATTTTAC-3’(SEQ IDNO.9)。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化。

利用限制性内切酶EcoR I(TaKaRa，货号1611)酶切p-lumPleio质粒，其酶切体系为：

酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。

利用无缝克隆将114片段克隆p-lumPleio质粒上，其体系如下所示：

连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含34mg/L卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-114-lumPleio(图3)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

(2)以pUC-114为模版，引物114-Vf-F和引物114-Vf-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增114-Vf片段，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：95℃ 3min；30循环×(95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s)；72℃ 5min；16℃∞。引物序列如下所示：

114-Vf-F：

5’-CACAGCCAGGATCCGAATTCAACTATCTGCGTCGCTTCTT-3’(SEQ ID NO.10)；

114-Vf-R：

5’-TATCATTGGAATACATTTATTCATGAATTCTGCTTCAGAAACGACGATTTTA-3’(SEQ IDNO.11)。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化。

利用限制性内切酶EcoR I(TaKaRa，货号1611)酶切p-lumVf质粒，其酶切体系为：

酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。

利用无缝克隆将114片段克隆p-lumVf质粒上，其体系如下所示：

连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含34mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-114-lumVf(图4)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

实施例2：生物感应器的构建

将p-114-lumPleio重组质粒转化Escherichia coli BW25113感受态细胞(购买自Weidi Biotechnology，货号DL2050)，涂布到含34mg/L氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体p-114-lumPleio的工程菌株XLUM1。

将p-114-lumVf重组质粒转化Escherichia coli BW25113感受态细胞(购买自Weidi Biotechnology，货号DL2050)，涂布到含4mg/L氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体p-114-lumVf的工程菌株XLUM2。

实施例3：微生物自发光生物感应器检测爆炸物分子的应用

1、菌株活化和培养

将测序正确的工程菌株XLUM1和XLUM2分别转接至含有34mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，得到菌液。

10mL含有34mg/L氯霉素的M9液体培养基中加入330μL60％葡萄糖、10μL1 M硫酸镁储存液，200μL菌液，37℃摇床培养，生长至OD

2、配制2，4-DNT溶液

配制20mg/mL母液2，4-DNT(100mg2，4-DNT溶于5mL无水乙醇)；

按以下比例配制稀释后的2，4-DNT溶液：

100mg/L：5μL母液+980μL M9培养基+15μL无水乙醇；

50mg/L：2.5μL母液+980μL M9培养基+17.5μL无水乙醇；

10mg/L：0.5μL母液+980μL M9培养基+19.5μL无水乙醇；

0mg/L：980μL M9培养基+20μL无水乙醇。

配制0.2mg/mL 2，4-DNT稀释母液(10μL 20mg/mL的2，4-DNT母液加990μL无水乙醇)；

按以下比例配制稀释后的2，4-DNT溶液：

1mg/L：5μL稀释母液+980μL M9培养基+15μL无水乙醇；

0.1mg/L：0.5μL稀释母液+980μL M9培养基+19.5μL无水乙醇。

使得各DNT溶液中乙醇的浓度为2％，稀释10倍后乙醇的终浓度为0.2％。

3、加样

各取90μL菌液+10μL0mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L浓度的2，4-DNT母液加至96孔黑色酶标板(costar，货号3603)中，使得2，4-DNT的终浓度分别为0mg/L、0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L，每个浓度做4个平行，用封板膜(Biored，货号MSB1001)封闭。

4、发光检测

用酶标仪(Biotek)恒温30℃实时监测XLUM1菌株荧光强度(RLU)，每10min进行一次检测，共监测20h。

用酶标仪恒温20℃实时监测XLUM2菌株荧光强度(RLU)，每10min进行一次检测，共监测20h。

结果如图5和6，表明本发明构建的XLUM1和XLUM2重组菌株，作为感应爆炸物分子的微生物自发光生物传感器，在不同浓度DNT的作用下，其RLU值呈现出不同的变化，DNT浓度越高，其RLU值越高，检测效果越明显，而且在最低DNT浓度10μg/L时，相比于DNT浓度为0时，其RLU值也具有非常显著的区别。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

青岛海军食品与营养创新研究院（青岛特种食品研究院）

<120> 利用自发光操纵子合成微生物自发光生物传感器的制备方法及其相应生物传感器和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6533

<212> DNA

<213> 鲾鱼发光杆菌(Photobacterium leiognathi)

<400> 1

atgattaaga agatcccaat gattattggg ggtgtagttc aaaacacgtc tggatatggc 60

atgcgtgaac taacgctcaa caataataaa gtgaatatcc ctatcatcac ccaaagtgat 120

gttgaagcta ttcaatcact aaatatagaa aacaaattga ctataaatca gatagttaat 180

ttcttatata cagtgggaca aaaatggaag agcgaaactt acagccgacg actcacttat 240

attcgagatc ttattaagtt cctcggttac tcacaagaga tggcaaaact tgaagctaac 300

tggatctcaa tgattctgtg tagcaaaagt gcgttgtacg atattgttga gaatgatctt 360

agctcacggc atattattga tgagtggatc ccccaaggtg aatgttatgt caaagcgctc 420

ccaaaaggaa aatctgtaca cctattagct ggtaacgtac cactatctgg tgtgacttct 480

attcttcgtg cgattttgac caaaaacgag tgcatcataa aaacgtcatc agctgatcct 540

tttacagcta ctgcgctagt taatagtttt atcgatgtag atgcagaaca cccgatcaca 600

cgttcaatct cagttatgta ttggtcacat agcgaggatc ttgctattcc aaaacaaata 660

atgagctgtg ctgatgtggt tattgcatgg ggtggtgatg atgcaattaa atgggctaca 720

gaacatgcac catcacacgc agatattcta aaatttggtc ccaaaaagag tatatccatt 780

gttgacaacc caacagatat taaggctgct gctatcggtg tagcacatga tatctgtttt 840

tacgatcagc aagcatgttt ctccacccaa gatatttatt atattggcga tagcatagac 900

atattttttg atgaattagc tcagcaatta aataaatata aagacatatt gcctaaaggt 960

gagcggaatt ttgatgaaaa agcagctttt tctttaacgg aaagagaatg tttgtttgcc 1020

aaatataaag ttcaaaaagg tgaaagccaa tcttggttat taacgcaatc acctgcggga 1080

tcatttggta atcagccgtt atcacgctcg gcttatattc atcaagtaaa tgacatttca 1140

gaagtcattc cattcgtgca taaggcggta acgcaaaccg tcgcaatagc gccgtgggag 1200

tcgtctttca aatatagaga tatattagca gaacatggtg cagaacgaat tatagaagcc 1260

ggaatgaata atatatttcg agtaggtggc gcccatgatg ggatgcgtcc ccttcaacgg 1320

cttgttaact atatatcaca tgaaaggccg tcaacatata ccactaaaga tgtctcggtg 1380

aaaatcgaac agactcgtta tcttgaggaa gataagttcc tcgtatttgt accgtagaaa 1440

gagatatatc atggaaaata cacaacattc attacctatt gatcacgtaa ttgatattgg 1500

tgataaccgt tatattcgag tatgggaaac caagccgaaa aataaagaaa ccaagcgtaa 1560

taataccatc gttatcgcct caggctttgc tcgacgcatg gatcattttg ctggtcttgc 1620

cgaatattta gcaaataatg gttttcgtgt tattcgttat gattcgttaa atcatgtcgg 1680

tcttagtagc ggagagatca aacagttctc gatgtcagta ggtaaacaca gtttgctaac 1740

tgttattgat tggctaaaag aacgaaatat taacaatata ggtcttattg cttcgagtct 1800

ttctgctcga attgcttatg aagtggcagc agaaattgat ttgtcatttt taattaccgc 1860

cgtcggtgtt gtcaatttaa gaagtacgct agaaaaagca ctgaaatatg attatctaca 1920

aatggaagta aatactattc ctgaagattt aatttttgaa ggacacaatc taggttcaaa 1980

agtctttgtg acagattgtt ttgaaaataa ttgggactca ttagattcga caataaataa 2040

aatttgtgaa ctagatattc catttattgc tttcacttca gatggcgatg attgggtttg 2100

ccaacatgaa gtaaaacatt tagtcagtaa cgttaaatct gacaaaaaga aaatttactc 2160

actcgttggc tcatctcatg atttgggcga aaacctagtg gtgcttcgta acttctatca 2220

atcaatgacg aaagctgctg tgagcttaga tcgtcaatta gtagagcttg ttgatgaaat 2280

tattgaacca aattttgaag acctaacagt tattacggta aatgaacggc gcctcaaaaa 2340

taaaatcgaa aatgaaatta ttaatagatt agctgatcgc gtattggcta gtgtctaaat 2400

agtacttacc taagtacagc caaaaggaag aaataatgaa aattagtaat atctgtttct 2460

cataccaacc accaggtgaa tcacatcaag aggtaatgga gcgctttatt cgtttaggcg 2520

ttgcatcaga agagctcaac tttgatggtt tctatacact tgaacaccat ttcactgagt 2580

ttggtattac aggtaacctt tatattgcct gtgccaatat tcttggtcga accaaaagga 2640

tccaagtcgg taccatgggg atagtgttac cgacagagca cccagcacga catgtagaaa 2700

gtcttctcgt tttagatcaa ctgtctaaag ggcgctttaa ctacggtact gttcgcggac 2760

tctaccataa agattttcgt gtttttggta catcacagga agattctcgt aagaccgcag 2820

aaaatttcta ctctatgatc ttggatgcat caaaaacagg tgtgctacat actgacggtg 2880

aagtagtaga gttcccagat gtcaatgttt atccagaagc ttacagcaaa aaacaaccca 2940

cctgcatgac agccgaatca tccgagacca tcacttattt agctgaacgt ggtttaccaa 3000

tggtgttaag ttggattatt ccggtcagtg agaaagtctc acaaatggaa ttgtacaatg 3060

aagttgcggc agagcatggt catgacatta acaacattga acatatccta actttcattt 3120

gctctgtaaa tgaagacggt gaaaaagcag acagcgtatg ccgtaatttc ctagaaaatt 3180

ggtacgactc ttacaaaaat gcaaccaaca tcttcaacga cagtaaccaa actcgtggct 3240

acgattacct caaagctcag tggcgtgagt gggtaatgaa ggggttggct gatcctcgtc 3300

gccgacttga ttacagtaac gaattaaacc ctgtcggcac gccagaacga tgcattgaga 3360

tcattcaaag taatattgat gccactggaa ttaagcatat tactgttgga tttgaagcga 3420

atggttctga acaagaaatt cgtgaatcca tggagctatt tatggaaaaa gtagcgccac 3480

acttaaaaga tcctcagtaa gctgttcttt ttaaactatt caatatcaag gcataaggaa 3540

taaaatatga atttcgggtt atttttccta aatttccagc ctgaaggtat gacttcagaa 3600

atggttttag acaacatggt agatactgtc gcattagtgg ataaagatga ttaccacttt 3660

aaaagagtgc tcgtcagcga gcatcatttt tctaaaaacg gcattatcgg agaacctttg 3720

acagcgatta gcttcttact tggtttgact aaacgtatag aaattggttc tttaaatcaa 3780

gtgattacca cccatcatcc tgtacgtatc ggagaacaaa cgggcttact tgatcaaatg 3840

tcttacggtc gtttcgtttt aggcttaagt gactgtgtca atgacttcga aatggatttc 3900

tttaagagaa aacgtagctc tcaacagcaa caattcgaag catgttacga aattttaaat 3960

gaagcgctga cgacaaacta ttgtcaggca gatgatgact tctttaactt cccacgtatt 4020

tctgttaacc cgcattgtat tagcgaagta aaacaatata ttttagcttc aagcatgggc 4080

gtggttgaat gggcagcaag aaaaggattg ccactcactt accgctggag tgacagccta 4140

gcagaaaaag aaaaatacta tcagcgttat ctcgctgttg ctaaagagaa taatattgat 4200

gtatcaaata ttgaccacca attcccactg ctcgttaata tcaatgaaaa tcgtcgtatt 4260

gctcgagatg aagtaaggga gtatatacaa agttatgtga gtgaagccta ccctactgac 4320

cccaacattg agctaagagt agaagagctt attgagcagc atgctgtcgg caaagtggat 4380

gagtactacg actcaacaat gcacgcagta aaagttacag gttcaaaaaa tttattactc 4440

tcttttgaat caatgaaaaa taaagacgat gttaccaagc ttataaatat gtttaatcaa 4500

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taaataattg ccattaatta atggcagtgc agatccttac actgccattt ataaattaaa 4680

taagggttaa catgtcaaca ttattaaata tagatgcaac tgaaattaag gtgagtacag 4740

aaatagatga tattattttt acatcatcac cgctaacgtt actatttgaa gatcaagaaa 4800

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<210> 2

<211> 6417

<212> DNA

<213> 费氏弧菌(Aliivibrio fischeri)

<400> 2

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tataaagaag ttaaactaaa taatgataat agagtaaaat tatctgtcat tactgaaagt 120

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ccttttactg caaacgcttt agtttccagt tttattgatg ttaatgcaga ccatccaata 600

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aattgattca actaaatatc attttaatac tgcctttgtt aatgaacatc acttttcaaa 3660

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agcattgaac gcttgcttgg ttctgtcaac ttcggaatga aatacgttgg agattggttt 4980

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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