胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用.

背景技术

胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的前体，根据理化性质及免疫原性的差异分为胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原II(PGII)，主要由胃粘膜分泌。胃蛋白酶原无消化酶活性，分泌至胃腔后在胃酸的作用下活化成具有消化活性的胃蛋白酶原。除了主要在消化道行使功能之外，少量的胃蛋白酶原会透过胃粘膜而进入血液循环。血清中胃蛋白酶原的含量能够反映胃液分泌的水平以及胃部粘膜的病理变化，血清中胃蛋白酶原I的含量与胃泌酸腺细胞的功能密切相关，且可用于多种胃部炎症、胃溃疡、胃癌等的快速筛查，具有便捷、经济等诊断优势。

目前临床使用的各种胃蛋白酶原I检测方法都依赖于针对胃蛋白酶原I的特异性单克隆抗体。但目前国内缺乏高特异性的PGI抗体的研究，不仅数量有限，在临床应用中不易实现配对，很难满足不同检测方法学的需求，而且，由于PGI和PGI工蛋白在氨基酸水平上具有一定的相似性，利用现有的PGI抗体制备的检测试剂，对PGI工蛋白也有一定的交叉反应性，会对校测结果的准确性产生影响，因此，生产出多种可以配对使用的高特性、且对PGII不会产生交叉反应的抗PGI单克隆抗体，对临床研究有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供抗PGI单克隆抗体，解决与PGII产生交叉反应的问题，实现与PGI的高特异性结合。

抗PGI单克隆抗体，其特征在于，包括：

如SEQ ID NO：1所列的重链可变区CDR1；

如SEQ ID NO：2所列的重链可变区CDR2；

如SEQ ID NO：3所列的重链可变区CDR3；

如SEQ ID NO：4所列的轻链可变区CDR1；

如SEQ ID NO：5所列的轻链可变区CDR2；

如SEQ ID NO：6所列的轻链可变区CDR3；

上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体A

或

如SEQ ID NO：7所列的重链可变区CDR1；

如SEQ ID NO：8所列的重链可变区CDR2；

如SEQ ID NO：9所列的重链可变区CDR3；

如SEQ ID NO：10所列的轻链可变区CDR1；

如SEQ ID NO：11所列的轻链可变区CDR2；

如SEQ ID NO：12所列的轻链可变区CDR3；

上述抗PGI单克隆抗体，命名为抗体B。

另一方面，本发明提供了一种抗原抗体混合物，所述抗原抗体混合物含有抗体A和/或抗体B。

优选的，所述抗原抗体混合物为抗体A-PGI-抗体B。

上述抗体A和抗体B特异性的结合PGI的不同抗原结合位点，可以配合使用，达到检测PGI的目的。

另一方面，本发明公开了含有上述抗体A或抗体B的试剂盒。

另一方面，本发明公开了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价链接的所述抗PGI单克隆抗体。

另一方面，本发明公开了一种偶联物，由所述抗PGI单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

另一方面，本发明公开了所述的抗PGI单克隆抗体和/或所述的结合物和/或所述的偶联物在制备检测PGI表达产品中的应用。

有益效果：

本发明的PGI单克隆抗体不会对PGII产生交叉反应，且能够应用到不同的试剂盒中实现高灵敏度和高精度的检测。

附图说明

图1：免疫比浊试剂盒加速稳定性试验图；

图2：不同方法学临床检测相关性对比图。

具体实施例

实施例1：小鼠免疫及抗体检测

挑选5只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的PG1蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上。筛选血清效价10

实施例2：单克隆抗体的生产纯化

选择两组6-8周BALB/c小鼠，腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向一组小鼠腹腔内注入0.5ml的PG1-A杂交瘤细胞，细胞数量约1×10

实施例3：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆

采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为：

1、用包被液(0.05M pH9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。

2、用稀释液(1％BSA，0.1％PBST)按照1∶1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP，IgG1-HRP，IgG2a-HRP，IgG2b-HRP，IgG3-HRP，IgM-HRP，kappa-HRP，lamda-HRP)1∶3000稀释。

3、用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取0D450吸光值。经过鉴定，抗体A和抗体B的重链亚型均为IgG1，轻链为Kappa。根据抗体亚型结果，采用基于RACE技术路线的方法克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，使用总RNA提取试剂盒获得杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的SMARTer RACE说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，并扩增目的抗体全长序列。

实施例4：检测抗体A和抗体B对PGI蛋白和PGII蛋白的反应性

采用间接ELISA的方式检测抗体的交叉反应性。购买的PGI蛋白和PGII蛋白(购自Lee Biosolutions.Inc)用包被液(0.05M pH＝9.5的碳酸盐缓冲液)从600ng/mL梯度稀释，稀释之后取100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。检测时，将各个待检抗体稀释至500ng/mL与抗原进行37℃孵育，并采用HRP标记的山羊抗鼠多抗进行显色，检测峰值的吸光度，结果如下表1所示。

表1抗体A和抗体B对PGI和PGII的反应性

结果显示，本发明抗体A和抗体B对PGI的反应性高于外购1和外购2抗体，抗体A和抗体B与PGII的反应性小于外购1和外购2，说明相比于市面上现存的抗PGI抗体来说，本发明的抗体对PGI具有更高的特异性，且与PGII的交叉反应性更小，更适合用于PGI的检测。

实施例5：抗体A和抗体B抗体应用到乳胶免疫比浊法中

1、试剂盒的制备

本试剂盒包含R1和R2两种试剂，R1为胶乳反应缓冲液，R2为包被了抗PG1单克隆抗体的胶乳颗粒。其中R1试剂为pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，包含浓度为1.6％的PEG6000作为促凝剂。R2试剂的制备方法为用孔径大小为120nm的羧基化胶乳与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺于室温摇床上反应30分钟。反应完成后，将反应混合液分成两份，分别加入抗体A、抗体B震荡混匀，于室温下旋转反应2小时。抗体反应完成之后再同时向两份混合液之中加入6-氨基己酸和BSA并混匀，反应2小时。之后，采用16000g离心力条件离心30分钟，去掉上清。用pH＝7.2的Tris缓冲液重悬清洗胶乳，并再次离心。用pH＝7.2的Tris缓冲液再次重选胶乳，将包被了抗体A和抗体B的胶乳等体积混合。使用超声处理使得胶乳足够分散而得到R2试剂。

2、精密度试验

用重庆中元汇吉生物技术有限公司的ZS400进行检测。

检测低值、中值和高值样本，每份检测10次，计算批内精密度，结果如下表2所示，精密度小于5％，证明本发明的抗体A和抗体B应用到免疫比浊试剂盒中，能够准确的检测PGI的浓度。

表2精密度试验

3、血清PG1含量检测试剂盒的临床稳定性试验

检测不同样本中PGI的含量，对比加速前后相关性，所述加速前是指4℃保存的试剂，所述加速后是指，将4℃保存的试剂在37℃中保存7天之后的试剂。结果如图1所示，本发明检测准确性高达0.99，本发明试剂盒检测稳定性好。

实施例6：抗体A和抗体B抗体应用到化学发光中

1、试剂盒的准备

本发明试剂盒含有3种试剂组分，分别是2μg/mL的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物，1μg/mL的生物素-抗体A偶联物，1mg/mL的磁微粒复合物。

所述链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物是将碱性磷酸酶和链霉亲和素偶联得到的。所述生物素-抗体A偶联物是通过以下的方法制备：在100mM的碳酸盐溶液中将抗体A脱盐并浓缩至浓度为2mg/mL；生物素用DMSO溶解，按照10∶1的比例将生物素加入抗体A中，37℃偶联2小时，用脱盐柱除去未偶联的生物素，得到生物素抗试剂。

所述磁微粒复合物通过以下方法制备：将羧基磁珠用EDC活化后清洗四次，将抗体B以TCEP活化后、超滤管浓缩后更换PBS缓冲液中；将羧基磁珠与抗体B按1∶50的质量比混合偶联4小时，偶联结束以后以BSA、PEG20000作为封闭剂，封闭2小时后进行磁分离清洗，即得磁微粒复合物，利用合适的稀释液调节浓度到1mg/mL。

2、灵敏度和精密度的实验

a)灵敏度实验

用重庆中元汇吉生物技术有限公司的EXI1800进行检测，测空白样本20次，浓度为5ng/ml的PGI样本5次，计算出检出限为0.011ng/mL，证明本发明抗体应用到化学发光试剂盒中，具有很高的灵敏度，适合用于PGI的检测。

b)精密度试验

检测低值和高值样本，每份检测20次，计算批内精密度，结果如下表3所示，精密度小于5％，证明本发明的抗体A和抗体B应用到化学发光试剂盒中，能够准确的检测PGI的浓度。

表3精密度试验

3、相关性试验

利用本实施例与实施例5试剂盒相同浓度梯度的样品，探究不同方法学检测样本的相关性。

结果如图2所示，利用不同方法学检测相同的样本，检测结果的相关性高达0.99，结果表明，本发明的抗体A和抗体B可以配合应用到不同方法学中，实现对PGI的高特异性检测。

序列表

<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司

<120> 胃蛋白酶原I单克隆抗体及其应用

<130> 2021.3.12

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> mouse

<400> 1

Ser Ser Trp Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> mouse

<400> 2

Glu Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> mouse

<400> 3

Val Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> mouse

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala Val Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> mouse

<400> 5

Leu Ala Ser Asn Arg His Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> mouse

<400> 6

Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> mouse

<400> 7

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> mouse

<400> 8

Val Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> mouse

<400> 9

Ser Ala Gly Thr Ser Ala Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> mouse

<400> 10

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> mouse

<400> 11

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> mouse

<400> 12

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

1 5